Biçimsel İnceleme

Um biomarcador é definido como alterações biológicas (molecular, celular ou fisiológica) em resposta a mudanças ambientais, que podem estar relacionadas à exposição ou a efeitos tóxicos de químicos ambientais (PEAKALL, 1994).

A histologia é uma ferramenta muito útil para diagnosticar efeitos agudos e crônicos de agentes químicos em peixes (AKAISHI et al. 2004). Os biomarcadores histológicos permitem visualizar os efeitos da exposição a vários agentes, biológicos e químicos, sendo considerada importante ferramenta na avaliação de alterações patológicas em peixes em curto e médio prazo dependendo, portanto, da concentração de contaminante e do tempo de exposição, permitindo uma abordagem relativamente fácil de identificação de possíveis alterações em diversos tecidos e órgão de peixes principalmente brânquias, fígado, rim, gônadas e pele (JOHNSON et al. 1993; VAN DER OOST et al. 1996; BERNET, et al. 1999).

3.3.1 Gônadas Masculinas:

Os testículos do Danio rerio são órgãos pares localizados na cavidade celômica e sustentados dorsalmente pelo mesórquio. Apresentam uma porção central e contínua que se comunica com o ducto espermático, o qual se abre no exterior através da papila urogenital. A forma, o volume, a coloração e a irrigação sanguínea também variam nos diferentes estádios do ciclo reprodutivo.

Durante a espermatogênese, as células germinais primordiais (espermatogônias) sofrem mitoses, originando os espermatócitos, os quais se dividem meioticamente, originando as espermátides que, ao sofrerem espermiogênese, darão origem às células reprodutoras masculinas os espermatozóides (COSTA, 2004).

O testículo é revestido externamente por uma fina cápsula fibrosa de tecido conjuntivo que se estende para o interior, delimitando os túbulos seminíferos (RIBEIRO, 2005).

Internamente, os túbulos seminíferos são organizados em cistos delimitados por células de Sertoli. Entre os túbulos seminíferos, está o tecido intersticial constituído por

tecido conjuntivo frouxo de preenchimento, além das células de Leydig (também denominadas células intersticiais) e de vasos sanguíneos. O conjunto formado pelas células de Sertoli, Leydig e demais células da região intersticial corresponde às células somáticas que compõe o testículo (SCHULZ et al. 2010; RUPIK et al. 2011; HUSZNO; KLAG, 2012).

A espermatogênese dos peixes pode ser dividida em três etapas principais: a etapa proliferativa, caracterizada por rápidas divisões mitóticas sucessivas das espermatogônias; a etapa de divisões meióticas responsáveis pela formação dos espermatócitos e espermátides; e a etapa de diferenciação das espermátides em espermatozoides (NÓBREGA et al. 2009) (Figura 3). Estas células germinativas estão organizadas de forma cística, onde cada cisto, delimitado por extensões citoplasmáticas de células de Sertoli, é formado por um único tipo de célula germinativa.

Os cistos de espermatogônias são inicialmente formados por uma única espermatogônia que prolifera por divisão mitótica, sendo que as células filhas permanecem ligadas entre si por pontes citoplasmáticas responsáveis pela forma sincrônica do desenvolvimento destas células germinativas (ALMEIDA et al. 2008; NÓBREGA et al. 2009; SCHULZ et al. 2010).

As espermatogônias são classificadas em espermatogônias do tipo I ou A, as maiores células da linhagem germinativa, com um grande núcleo, de contorno irregular cercado por grande volume de citoplasma. Esta espermatogônias se divide formando novas espermatogônias, sendo consideradas como células-fonte do testículo. As espermatogônias do tipo II ou B são menores, com núcleos mais esféricos, sendo estas as espermatogônias que darão origem aos espermatócitos e por fim, aos espermatozoides (LEAL et al. 2009; NÓBREGA et al. 2009; SCHULZ et al. 2010, RUPIK et al. 2011).

Figura 3: Esquema com secções de testículo representando as três diferentes fases da espermatogênese em peixes (Fase Proliferativa, Fase das Divisões Meióticas e Fase da Diferenciação).

3.3.2 Gônadas Feminin

Nas fêmeas de Danio rerio os ovários, quanto à sua morfologia, são órgãos pares, saciformes e sustentados dorsalmente na cavidade celômica pelo mesovário. Os ovários direito e esquerdo unem-se na extremidade caudal para formar o ducto ovariano, que se comunica com a papila urogenital. A forma, o volume, a coloração e a irrigação sanguínea dos ovários variam, nos diferentes estádios do ciclo reprodutivo (COSTA, 2004).

Os folículos ovarianos compreendem o ovócito, as células foliculares e a membrana vitelina. A ovogênese, em teleósteos, inicia-se com a proliferação e diferenciação de ovogônias por meio do processo mitótico. Essas células germinativas primordiais podem apresentar-se em ninhos ou isoladamente (SCHULTZ et al. 2002). Caracterizam-se por apresentar citoplasma escasso, núcleo grande com nucléolo proeminente e originam ovócitos, pré-vitelogênicos e vitelogênicos. Os folículos ovarianos desenvolvem-se por processos meióticos até o completo desenvolvimento. Os folículos pós-ovulatórios são estruturas remanescentes nos ovários pós-ovulação, tendo a parede constituída por células foliculares e tecido conjuntivo (SCHULTZ et al. 2002).

Durante o processo de maturação do folículo ovariano, podem-se observar mudanças na sua morfologia tanto quanto na constituição química, que caracteriza as cinco estádios de maturação distintas no seu desenvolvimento (SCHULTZ et al. 2002) (Figura 4).

Espermatogonias Espermatócitos Espermátides Espermatozóides

ESPERMATOGÊNESE

Fase Proliferativa Células primordial Divisões Mitóticas

Fase das Divisões Meióticas Fase Diferenciada Completa

Fonte: Autoria própria Legenda: As setas representam as células individualizadas em cada fase.

I (Ovogônia) Células pequenas, em ninhos; o citoplasma é reduzido; o núcleo é grande com nucléolo único, basófilo e central.

II Células foliculares pavimentosas envolvem o ovócito e permanecem dessa forma durante todo o processo. O ovócito apresenta um tamanho maior, o citoplasma se torna mais volumoso, mas ainda reduzido em relação ao núcleo, que começa a sofrer fragmentação nucleolar.

III Surgem vesículas citoplasmáticas na periferia do ovócito (sem afinidade por HE) e a membrana vitelina (envolvendo o ovócito). O citoplasma é mais volumoso e menos basófilo. Os nucléolos se encontram periféricos ao núcleo.

IV Caracterizada pela presença de dois tipos de inclusões citoplasmáticas no ovócito: as vesículas citoplasmáticas e os grânulos de vitelo; a membrana vitelina sofre um espessamento, com estriações transversais evidentes.

V O ovócito sofre um aumento de volume; o citoplasma apresenta-se repleto de grânulos de vitelo acidófilos; o núcleo apresenta o seu contorno irregular contendo diversos nucléolos basófilos na periferia; a membrana vitelina permanece inalterada. Histologicamente os ovários são revestidos pela túnica albugínea, constituída de tecido conjuntivo, fibras musculares lisas e vasos sanguíneos. Essa túnica emite septos em direção ao lume, formando lamelas ovulígeras, nas quais se encontram os folículos ovarianos (VAZZOLLER,1996; RIBEIRO, 2005; OECD, 2010).

Figura 4: Esquema com imagens de ovócitos representando o desenvolvimento ovocitário em peixes.

Fonte: Autoria Própria

Legenda: : Fase I - Ovogônias, Fase II – Ovócitos de reserva, Fase III – Ovócitos c grânulos lipídicos, Fase IV – Ovócitos com vitelogênese lipídica e proteica, Fase V – Ovócitos com vitelogênese completa.

3.3.3 Fígado

O fígado localiza-se na cavidade celomática com os demais órgãos, sendo formado basicamente por hepatócitos dispostos como uma dupla camada celular ao redor de sinusóides. Os hepatócitos são poliédricos, com bordos distintos, amplo citoplasma com diferentes graus de vacuolização. O fígado (Figura 5) é uma glândula digestiva composta por parênquima celular (hepatócitos) e por fibras que promovem sua sustentação (cordões hepáticos). A superfície hepática é revestida por uma membrana serosa e o tecido conectivo dessa cápsula penetra no parênquima hepático. Os hepatócitos são células uninucleadas com forma poligonal que possuem importantes funções metabólicas. Também é possível visualizar no fígado vascularização de grande calibre, sinusóides (vasos sanguíneos de pequeno calibre), ductos biliares, tecido pancreático e centro melanomacrofágico (TAKASHIMA;HIBIYA 1995).

DESENVOLVIMENTO OVOCITÁRIO Células germinativas Jovens (Ninhos) Fase I

Cromatina-nucleolar

Ovócitos do estoque de reserva Fase II

Perinucleolar Ovócitos com grânulos

lipidicos Fase III

Formação da visícula vitelínica

Ovócitos com vitelogênese lipídica e protéica Fase IV

Vitelogênese

Ovócitos com vitelogênese completa Fase V

O núcleo único dos hepatócitos é arredondado e localiza-se geralmente central ou levemente periférico. Em casos em que a vacuolização é mais acentuada, o núcleo apresenta-se deslocado para a periferia.

Em fêmeas os hepatócitos apresentam-se mais basofílicos e os hepatócitos de fígado de machos mais eosinofílicos (VAN DER VEN, 2003).

A vesícula biliar é como uma estrutura oca, com epitélio de transição, enquanto os ductos biliares possuem epitélio simples cúbico. Os vasos sanguíneos do fígado são constituídos por epitélio simples pavimentoso (TAKASHIMA; HIBIYA 1995).

Figura 5- Corte transversal de fígado.

Fonte: YONKOS, 2000.

Legenda: - Fígado corte transversal, HE, (barra = 22.8 μm), Legenda: 1) hepatócitos; 2) ductos biliares; 3 e 4) vasos sinusóides; 5) tecido conectivo; 6) centro de melanomacrófagos; 7) veia porta.