BGYS’nin Gerçekleştirilmesi ve Đşletilmesi

II. 3.1. Especificações do material e instrumentos utilizados para o estudo químico da alga Bostrychia tenella

Os solventes orgânicos empregados nos processos de fracionamento e purificação dos extratos e frações foram de grau técnico (purificados por destilação fracionada antes de serem utilizados) e de grau analítico da marca JT Baker.

As placas cromatográficas comparativas (CCDC) foram preparadas aplicando-se uma suspensão de sílica gel 60 (GF254 – Merck) em água destilada na

proporção de 1:2 (m/v), sobre placas de vidro de 5x20, 10x20 ou 20x20 cm, obtendo-se camadas de 0,25 mm de espessura de adsorvente.

Os reveladores utilizados nas análises por CCDC foram: irradiação UV λ = 254 nm; iodo ressublimado em câmara saturada, nebulização com solução comercial de iodoplatinado (0,15% de sal cloroplatinado de potássio e 3% de iodeto de potássio, em ácido clorídrico hidratado) da marca Sigma e p-anisaldeído em solução hidroalcoólica ácida comercial (90% (v/v) metanol, 5% (v/v) ácido sulfúrico e 5% (v/v) ácido acético) da marca Sigma, seguida de aquecimento da cromatoplaca a 100°C por cinco minutos.

Para a análise por CLV, foi utiliza sílica gel 60 H, da marca Merck, como fase estacionária, e sílica gel 60 G, marca Merck, para incorporação da amostra. Para o procedimento de CCC por exclusão foi utilizada uma coluna empacotada com Sephadex LH-20.

As análises por CG-EM foram realizadas em aparelho Shimadzu, modelo QP 2010, em um sistema operando via impacto eletrônico (70 eV) acoplado com injetor split (250º.C). Foi utilizada coluna DB-5MS (30 metros, 0,25 mm de diâmetro interno, 0,25 m de espessura do filme) da marca Agilent J&W GC columns, para a análise das amostras, e gás carreador Hélio com fluxo e pressão variáveis de acordo com a análise. Para tratamento das amostras para análise em CG-EM, foram utilizadas colunas comerciais Sepak de 1g contendo a fase estacionária sílica-gel 60.

II. 3.2. Análise química da alga Bostrychia tenella

II. 3.2.1 Coleta do material algal

Indivíduos da macroalga Bostrychia tenella (L. V. Lamouroux) J. Agardh foram coletados nos Costões Rochosos da Praia da Fortaleza, em Ubatuba – São Paulo (23º31’30’’S, 45º10’09’’O). A coleta foi realizada no mês de dezembro de 2007, levando em consideração as datas e períodos de maré baixa. As amostras frescas foram lavadas em água do mar para remoção de detritos e contaminantes, colocadas em recipientes plásticos e transportadas em caixas com isolamento térmico a baixas temperaturas (~4ºC).

O material coletado foi limpo em água doce, sendo, em seguida, congelado até o momento da extração. Antes, porém, foi realizada uma triagem com o propósito de separar outras espécies de algas associadas, que porventura foram coletadas juntas.

Ainda, exemplares da espécie foram devidamente limpos e mantidos em frascos plásticos contendo solução de formol (4%), os quais foram utilizados para preparação de exsicata (SP 371456) depositada no herbário SP, Instituto de Botânica de São Paulo.

Os processos de identificação, limpeza e triagem das amostras de algas coletadas foram supervisionados pela bióloga com experiência em taxonomia de algas Dra. Nair Sumie Yokoya, pesquisadora vinculada à Seção de Ficologia do Instituto de Botânica de São Paulo.

II. 3.2.2 Obtenção e fracionamento do extrato metanólico de B. tenella

O material coletado foi reunido e submetido à extração em solvente orgânico a frio. Cerca de 2.750 g de algas congeladas foram trituradas com o auxílio de liquidificador doméstico e submetidas à extração por maceração utilizando-se metanol, numa proporção massa de alga/volume de solvente igual a 1:1. O extrato obtido foi filtrado em gaze e papel de filtro, e concentrado em evaporador rotativo, sob pressão reduzida a uma temperatura máxima de 40°C.

Amostras da alga B. tenella (2,750 g) Extrato Metanólico (em metanol/água) BT Extração com Metanol Partição líquido-líquido com hexano Fase orgânica 1 – Fração Hexânica (BT-H) 11,44 g Fase aquosa 1

Partição Líquido-líquido com acetato de etila

Fase orgânica 2 – Fração Acetato (BT-A)

2,13 g Fase aquosa 2 Fase orgânica 3 – Fração Butanólica (BT-B) 7,08 g Fase aquosa 3 – Fração Hidro-metanólica (BT- MH) 32,31 g Partição Líquido-líquido com n-butanol

Devido à grande quantidade de água presente no extrato concentrado, à possibilidade da degradação e formação de artefatos caso a temperatura do evaporador rotativo fosse elevada, aos problemas de congelamento (alta concentração de polissacarídeos) e lentidão caso este fosse liofilizado, optou-se por submeter o extrato concentrado a partições líquido-líquido utilizando-se solventes orgânicos imiscíveis. Para este processo, foram utilizados os solventes destilados n- hexano, acetato de etila e butanol, resultando em 4 frações, de acordo com a Figura II.3.

Figura II.3 - Obtenção e fracionamento do extrato hidro-metanólico da alga Bostrychia tenella.

II. 3.2.3 Fracionamento e análise cromatográfica de BT-H

O fracionamento cromatográfico da fração hexânica BT-H foi realizado por CLV. Utilizou-se uma coluna clássica com sistema de vácuo, placa porosa (sinterizada) com diâmetro de 10 cm e um erlenmeyer de volume igual a 1L como sistema coletor. Como suporte cromatográfico, foram utilizados 500 g de sílica gel 60 H. A quantidade de 11,0132 g de BT-H foi incorporada em 50,0 g de sílica gel 60 G e a mistura foi colocada sobre o suporte de sílica gel 60 H na coluna. A eluição foi realizada de acordo com gradiente crescente de polaridade, utilizando os solventes hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol (Tabela II.1).

Foram coletadas 6 frações de volume variável (Tabela II.2), concentradas sob pressão reduzida, em rotoevaporador e dessecador.

Tabela II.2 - Fracionamento cromatográfico de BT-H por CLV.

Frações Sistema de Eluição

Volume de solvente utilizado na eluição (L) Massa da subfração seca (g) BT-H.H Hex 0,5 0,0690 BT-H.HD Hex: Dcm (1:1) 0,5 0,9652 BT-H.D Dcm 0,5 0,2420 BT-H.A AcOEt 1 3,1408

BT-H.AM AcOEt: MeOH (1:1) 1 4,9480

BT-H.M MeOH 2 1,2939

Após secagem, as subfrações resultantes foram pesadas e submetidas a análises cromatográficas por CCDC, utilizando sistemas de solventes e reveladores variados (item II. 3.1). Adicionalmente, estas subfrações foram submetidas a análises por CG-EM, seguindo a sequência de aquecimento descrita na Tabela II.3.

________________________ 1

Tempo no qual a temperatura final atingida permanece constante até o próximo aquecimento. Outros parâmetros: Temperatura inicial 80º.C; Gás carreador: pressão – 73,2 kPa, fluxo na coluna: 1,1 mL/min.

Tabela II.3 - Programação de temperatura do cromatógrafo a gás durante a análise das subfrações de BT-H.

Velocidade de Aquecimento

(oC/min) Temperatura final (°C) Tempo de espera

1 (min) - 80 5 10 200 5 5 250 5 15 280 10