BGKD’de Kullanılan Kontrol Yöntemlerinin Simülasyonu

quantificação de mediadores envolvidos na inflamação

O processo extrativo foi realizado segundo planejamento experimental completo com ponto central, no que diz respeito ao aumento de escala das condições pior e melhor em relação ao teor de warifteína obtido anteriormente. O extrato com menor teor de warifteína foi codificado como extrato “P” e obtido da seguinte forma: 50g de folhas com 500 µm foram adicionadas a 250 mL de etanol:água 20:80 (v/v), mantendo-se a proporção droga:solvente de 1:5, e submetidos a ultrassom por 15 minutos. O extrato com maior teor de warifteína foi codificado como “M” e obtido adicionando 50 g de folhas com 500 µm a 500 mL de etanol:água 80:20 (v/v), mantendo-se a proporção droga:solvente de 1:10, e submetidos a ultrassom por 15 minutos. Ao final do processo os extratos foram filtrados e monitorados quanto ao teor de resíduo sólido (BRASIL, 2010a), teor de warifteína (MARINHO et al., 2012) e rendimento em peso do extrato hidroalcoólico.

Os extratos hidroalcoólicos foram submetidos à partição em água visando a obtenção de sua fração aquosa para avaliação in vitro de atividade anti-inflamatória, como forma de avaliar biologicamente o comportamento dos extratos com menor e maior teor de warifteína, na forma de suas respectivas frações aquosas, visto que os ensaios farmacológicos e toxicológicos relatados na literatura foram feitos com essas frações.

A partição em água dos extratos hidroalcoólicos secos ocorreu na proporção de 1 grama de extrato para 100 mL de água, conforme sugestão dos ensaios anteriores. As frações aquosas foram liofilizadas e avaliadas quanto ao resíduo sólido (BRASIL, 2010a), teor de warifteína (MARINHO et al., 2012) e rendimento em peso, sendo nomeadas como fração aquosa do extrato hidroalcoólico com pior teor de warifteína (Fr Aq P) e fração aquosa do extrato hidroalcoólico com melhor teor de warifteína (Fr Aq M).

4.9.2. Quantificação de mediadores envolvidos na inflamação

4.9.2.1. Animais

Camundongos BALB/c machos, com 8 semanas de idade e pesando entre 18 e 25 g foram provenientes do Biotério Prof Dr George Thomas, da Universidade Federal da Paraíba, e tiveram livre acesso à água e ração tipo pellets. Os animais foram mantidos à temperatura ambiente (21 ± 2 °C) e submetidos a um ciclo de claro/escuro de 12 h cada. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética (CEUA) do CBiotec/UFPB sob parecer nº 0104/12.

4.9.2.2. Cultura de células de linfonodos mesentéricos

Os linfonodos mesentéricos de quatro camundongos BALB/C por experimento, foram removidos, triturados com auxílio de lâminas de vidro esmerilhado em meio de cultura RPMI- 1640 completo (10 % Soro Bovino Fetal (SBF), 100 μg/mL de sulfato de estreptomicina, 100 U/mL de penicilina G, 1 nM de piruvato de sódio, 2 nM de L-glutamina e 2 mg/mL de hepes) para obtenção das células totais. Estes foram transferidos e incubados em tubo de 15 mL com RPMI-1640 completo. A contagem de células totais foi realizada em câmara de Neubauer e a viabilidade celular avaliada pelo teste de exclusão pelo corante azul de Tripan 0,2 %. Após este procedimento as suspensões celulares foram semeadas em triplicata, em placa de polipropileno de 96 na quantidade total de 5 x 105 células viáveis por cavidade em um volume final de 200 µL e em monoclata nas placas de 24 cavidades de fundo chato com volume final de 1000 µ L por cavidade contendo 2 x 106 células viáveis. Foram adicionados os estímulos: meio RPMI completo, Concanavalina-A (5 µg/mL de meio RPMI completo) ou as frações aquosas dos extratos hidroalcoólicos com pior (Fr Aq P) e melhor teor (Fr Aq M) de warifteína (100, 50, 25, 12, 6, 3 µg/mL), obtidas através do planejamento experimental completo, com ou sem Concanavalina-A. As concentrações foram escolhidas a partir de estudos prévios (PIUVEZAM et al., 1999; THOMAS et al., 1999). As culturas celulares foram incubadas por 48h em estufa com atmosfera úmida a 37 °C e 5 % CO2 (PIUVEZAM et al., 1999).Os sobrenadantes das culturas em placas de 24 cavidades (500 µL) foram coletados para a realização das dosagens das citocinas. Após o período de incubação foram retirados 100 µ L de sobrenadante das placas de 96 cavidades e adicionados 10 µL de uma solução de MTT (5 mg/mL). As placas foram reincubadas em estufa com atmosfera úmida a 37 °C e 5 % CO2 por quatro horas para incorporação do MTT pelas células (MOSMANN, 1983). Para

dissolver os cristais formados, denominados de formazam, produto de reação do MTT, foram adicionados 100 µL de solvente dimetil-sulfóxido e em seguida foi realizada a leitura em espectrofotômetro do tipo leitor de ELISA com comprimento de onda de 570 nm. Os valores de absorbância foram apresentados como média ± erro padrão da média.

4.9.2.3. Ensaio de apoptose e necrose

Após a retirada do sobrenadante das culturas em placas de 24 cavidades foi coletada uma alíquota contendo 1x106 células e transferida para tubos apropriados para análise em citômetro de fluxo. As células foram lavadas duas vezes com 300 μL de tampão de ligação

(0,01 M Hepes (pH 7.4), 0.14 M NaCl e 2.5mM de CaCl2) centrifugando-se por 10 min. em

1200 rpm a 25 ºC, após a segunda lavagem os sobrenadantes foram eliminados e as células foram ressuspensas no volume residual, em seguida foram adicionados cinco μL de FITC- Anexina V e deixado em repouso por 15 mim em ambiente escuro para a marcação de células em apoptose. Para a marcação de células em necrose foram adicionados 10 μL de uma solução contendo 50 μg/mL de iodeto de propídio (PI). Foram adicionados 400 μL de tampão de ligação a cada suspensão celular para a realização da leitura em citômetro de fluxo.

Para aquisição dos dados foi utilizado o programa de computador CellQuest ™ versão 2.1 para Macintosh OS (BD Biosciences ™), e para analisar os dados foi usado o programa de computador Win MDI versão 2.9 para Windows OS.

4.9.2.4. Cultura de macrófagos e dosagem de óxido nítrico

O ensaio com macrófagos foi iniciado administrando-se um mL meio de cultura tioglicolato de sódio (290 mg/mL) via i.p. em seis camundongos BALB/c, por experimento, para o recrutamento de macrófagos para o peritônio. Após quatro dias foram injetados cinco mL de PBS gelado contendo três % de SBF, no peritônio de cada animal que foi massageado por 60 s e em seguida secionado. O lavado foi coletado em um tubo de 50 mL, que foi centrifugado 1200 rpm por 10 min. a 7 °C, o sobrenadante foi descartado, as células sedimentadas foram ressuspensas em 1 mL de meio RPMI com 10 % de SBF, a contagem e a viabilidade celular foi realizada em câmara de neubauer com auxílio de corante azul de tripan 0,2 %.

Os macrófagos viáveis (4 x 105 células/cavidade) foram semeados em placas de 96 cavidades, e incubadas para aderir por 24 horas. Em seguida os cavidades foram lavados 3 vezes com meio RPMI 10% SBF e o volume fixado em 160 L, e completado para 200 L pela adição dos estímulos: meio, LPS (10g/mL) ou os Fr Aq P e Fr Aq M (50; 12,0; 3,0 µ g/mL). Após adicionar os tratamentos em triplicata, as placas foram incubadas em estufa úmida de 5 % CO2 a 37 °C por 24 h.

A dosagem de óxido nítrico (NO)foi realizada de maneira indireta pela detecção do nitrito (NO2-) utilizando-se o método de Griess. Estas dosagens foram realizadas com 50L de

sobrenadantes das culturas de macrófagos. Os sobrenadantes coletados foram colocados em placas de poliestireno de 96 cavidades e incubados contendo volumes idênticos de naftiletileno-diamida-dihidrocloreto (1 mg/mL), sulfanilamida (10 mg/mL) em ácido fosfórico

a 5 %, após o tempo cinco mim. Para reação de Griess a placa foi levada para a leitura em espectrofotômetro do tipo leitor de ELISA com comprimento de onda de 540 nm. Como padrão foi utilizado uma solução de nitrito de sódio na concentração inicial de 100 M. A partir da curva padrão foram calculadas as concentrações de nitrito nos sobrenadantes das culturas celulares. Após a retirada do sobrenadante para a dosagem de nitrito foram adicionados 10 l de uma solução de MTT (5 mg/mL). As placas foram reincubadas em estufa com atmosfera úmida a 37 C e 5 % CO2 por quatro horas para incorporação do MTT

pelas células (MOSMANN, 1983). Após o tempo de reação e dissolução dos produtos formados foi realizada a leitura em espectrofotômetro do tipo leitor de ELISA com comprimento de onda de 570 nm. Os valores de absorbância foram apresentados como média  erro padrão da média.

4.9.2.5. Dosagem de citocinas

As citocinas IL-10, IL-13 e IFN- e IL-17 nos sobrenadantes das culturas de células dos linfonodos mesentéricos e as citocinas IL-1, IL-6 e TNF-α nos sobrenadantes das culturas de macrófagos foram quantificadas pela técnica de ELISA. As metodologias utilizadas para tais dosagens foram às recomendadas pelo fabricante dos kits (eBioscience). Para tal, as placas de ELISA com 96 cavidades receberam 50 μL de anticorpo de captura (para cada citocina específica) diluído em tampão de cobertura (Coating buffer). Em seguida foram seladas com plástico tipo parafilme e mantidas em repouso no período de overnight a 4 °C.

As metodologias utilizadas para tais dosagens foram às recomendadas pelo fabricante dos kits (eBioscience). Para tal, as placas de ELISA com 96 cavidades receberam 50 μL de anticorpo de captura (para cada citocina específica) diluído em tampão de cobertura (Coating

buffer). Em seguida foram seladas com plástico tipo parafilme e mantidas repouso no período

de overnight a 4 °C.

Após este período, aspirou-se um volume de 50 μL de cada cavidade seguido das lavagens, que consistiram em adicionar cerca de 250 μL de tampão de lavagem (wash buffer- PBS Tween 20 0,05 %) em cada cavidade e após aproximadamente 1 min a solução foi removida eliminando todo o conteúdo em um reservatório de descarte. As placas foram secas sobre papel absorvente para remoção completa de resíduos de tampão. Esse procedimento foi repetido por mais quatro vezes.

A curva de concentração padrão de cada citocina foi adicionada a placa (50 μL/cavidade), em duplicata, em seguida adicionou-se as amostras provenientes da cultura celular nos cavidades previamente determinados (50 μL/cavidade). Repetindo-se o tempo de repouso (overnight) a 4 °C.

Após o procedimento de lavagem adicionou-se 50 μL/cavidade de anticorpo de detecção devidamente diluído, em seguida selou-se as placas deixando-a em repouso, em temperatura ambiente, por 1 hora. Em seguida adicionou-se 100 μL/cavidade de avidina-HRP devidamente diluída, selou-se a placa e deixou-a em repouso a temperatura ambiente por 30 minutos. Posteriormente adicionou-se 100 μL/cavidade de solução de substrato a cada cavidade, e incubou-se as placas à temperatura ambiente durante 15 minutos em local escuro.

A reação enzimática foi parada pela adição de 50 μL/cavidade de solução de parada (H2SO4 1M), resultando em coloração amarela de intensidade proporcional a concentração da

citocina dosada.

As placas foram lidas em leitor de microplaca no comprimento de onda de 450 nm. Os dados de absorbância foram transformados para concentração de acordo com a curva de soluções padrão de cada citocina.

4.9.2.6. Análises estatísticas

Os resultados obtidos foram expressos em média  erro padrão da média e analisados estatisticamente com auxílio do programa de computador (software) GraphPad Prisma versão 5.0. Os dados foram submetidos ao teste t Student quando o grupo tratado foi comparado somente ao CTR+ ou ANOVA seguido de pós-teste de Tukey quando todos os grupos foram comparados entre si. Os testes estatísticos foram escolhidos conforme a natureza dos dados obtidos e descritos nas legendas das figuras.

4.10. Obtenção do insumo farmacêutico na forma de pó seco por spray dryer a base da