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O DNA fecal foi extraído utilizando o QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA), seguindo as instruções do fabricante. Cerca de 200mg ou 200µL de fezes foram incubadas com 1,4mL de tampão ASL, que promove a lise celular e remove substâncias inibidoras presentes nas fezes. Para prevenir a degradação do DNA, a solução de lise foi adicionada antes do descongelamento das amostras fecais. A mistura foi agitada por 1 minuto ou até que as amostras estivessem totalmente homogeneizadas e foi, então, incubada por 5 minutos a 95°C. A elevação da temperatura é recomendada pelo fabricante e tem o objetivo de facilitar a ação do tampão em células difíceis de lisar, aumentando em três a cinco vezes a concentração final de DNA.

O lisado foi homogeneizado por 15 segundos e centrifugado por 1 minuto para precipitação das partículas fecais. Em seguida, 1,2mL do sobrenadante foram transferidos para um novo tubo de 2mL contendo InhibitEX, um componente do kit em forma de comprimido, que adsorve inibidores de PCR e substâncias lesivas ao DNA presentes nas fezes. A transferência do comprimido a partir de sua embalagem original para o tubo foi realizada sem contato direto para evitar a contaminação cruzada. O tubo contendo o lisado e o comprimido foi agitado em um agitador de tubos imediatamente e continuamente por 1 minuto ou até que o comprimido estivesse totalmente dissolvido. A mistura foi incubada por 1 minuto a temperatura ambiente com o objetivo de permitir a adsorção dos inibidores pela matriz. O processo de remoção dos inibidores foi finalizado por um passo de centrifugação durante 3 minutos. Todo o sobrenadante foi transferido para um novo tubo de 1,5mL e submetido a uma nova centrifugação por 3 minutos.

O processo de purificação do DNA envolveu, ainda, a digestão de proteínas, ligação do DNA a uma membrana de sílica-gel, lavagens com tampões adequados para remoção de impurezas e eluição do DNA. Para a digestão das proteínas, 200µL do sobrenadante foram transferidos para um tubo de 1,5mL contendo 15µL de proteinase K. Em seguida, adicionou-se ao tubo 200µL de tampão AL, constituído de hidrocloreto de guanidina. Segundo Fonseca et al. (2006), a ação desnaturante do hidrocloreto de guanidina poderia ser decorrente de elevações na

solubilidade de grupos da proteína na solução aquosa do desnaturante. A mistura foi, então, aquecida a 70°C durante 10 minutos, temperatura e tempo adequados para a ação dos desnaturantes. Para completar o passo de desnaturação protéica, adicionou-se 200µL de etanol a 96-100%, que é um agente caotrópico anfifílico, com um segmento hidrocarbonado hidrofóbico (-CH2-CH2-) e um grupo hidrofílico (-OH). Ele pode se misturar com a água e acomodar melhor no solvente os grupos apolares da proteína, atenuando a força hidrofóbica, de tal forma a desfavorecer o estado nativo em detrimento do estado desnaturado (FONSECA et al., 2006).

Após centrifugação rápida para remoção de gotas presentes na tampa e paredes do tubo, a mistura foi transferida para um tubo contendo um filtro composto de uma membrana de sílica-gel. O DNA foi adsorvido à membrana durante uma breve centrifugação (1 minuto). O filtro e o DNA foram transferidos para um novo tubo coletor, sendo o filtrado descartado. As condições do lisado, como concentração de sais e pH, dificultam a ligação de proteínas digeridas e outras impurezas à membrana. Com o intuito de remover qualquer impureza residual, o DNA adsorvido foi, então, lavado em dois passos de centrifugação. No primeiro deles, 500µL do tampão AW1 foram adicionados à membrana e submetidos à centrifugação durante 1 minuto. A membrana ligada ao DNA foi transferida para um novo tubo coletor e o filtrado foi descartado. No segundo passo de lavagem, 500µL do tampão AW2 foram adicionados à membrana e submetidos à centrifugação durante 3 minutos. Para que nenhum excesso de tampão permanecesse na amostra antes da eluição final, o filtrado foi descartado e o filtro foi colocado de volta ao mesmo tubo coletor e submetido a uma nova centrifugação de 1 minuto. A membrana contendo o DNA concentrado e purificado foi transferida para um novo tubo de 1,5mL. Adicionou-se, então, 200µL do tampão de eluição AL e incubou-se por 1 minuto à temperatura ambiente. A concentração de sal do tampão permite a eluição do DNA ligado à membrana, livre de proteínas, nucleases, inibidores e outras impurezas. A centrifugação durante 1 minuto completou o processo. O produto obtido foi armazenado a -20°C em duas alíquotas contendo 100µL cada uma para posterior análise. Todas as centrifugações foram realizadas a 20.000xg à temperatura ambiente. Os passos da extração de DNA fecal estão ilustrados na Figura 8.

FIGURA 8 – Fluxograma da técnica de extração de DNA fecal utilizando o QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA).

Fonte: Adaptado do manual do usuário do QIAamp DNA Stool Mini Kit.

Essa técnica de extração foi escolhida em nosso laboratório após a realização de testes para quatro diferentes tipos de pré-tratamento. Avaliamos: 1) pré-tratamento químico – as fezes foram pré-tratadas com KOH 1M (50µL) e dithiothreitol (DTT) 1M (18µL) durante 1 hora a 65°C, neutralizadas com HCl 25% (8µL) e tamponadas com Tris-HCl 2M, pH=8,0 (80µL); 2) pré-tratamento físico – as amostras fecais foram submetidas a sucessivos ciclos de congelamento em

nitrogênio líquido e descongelamento em banho-maria a 95°C, ambos por 1 minuto (um e três ciclos foram testados); 3) pré-tratamento físico + químico – as fezes foram tratadas com dois ciclos de congelamento/descongelamento antes de serem submetidas ao tratamento químico descrito anteriormente; 4) sem pré-tratamento (SAMIE et al., 2007) . Todas as alíquotas foram, então, submetidas à extração do DNA fecal com o QIAamp DNA Stool Mini Kit. A amplificação por PCR utilizando o gene aggR de EAEC indicou diferenças entre as intensidades das bandas obtidas, embora todos as técnicas testadas tenham possibilitado a visualização da banda pesquisada. Em virtude da maior intensidade da banda obtida após a extração do DNA fecal sem a adição de uma etapa de pré-tratamento (banda 5) em comparação com as bandas resultantes dos outros métodos de extração testados (bandas 1 a 4), como mostra a Figura 9, essa foi a técnica escolhida para a realização desse trabalho, o que economizou tempo e trabalho laboratorial.

FIGURA 9 – Comparação de cinco métodos de extração de DNA a partir de amostras fecais positivas para EAEC. As amostras foram pré-tratadas com dois ciclos de congelamento/descongelamento com nitrogênio liquido seguido por tratamento alcalino com KOH e DTT (linha 1), tratamento alcalino com KOH e DTT (linha 2), um ciclo de congelamento/descongelamento com nitrogênio líquido (linha 3), três ciclos de congelamento/descongelamento com nitrogênio líquido (linha 4) e sem pré-tratamento (linha 5). As amostras foram submetidas à extração de DNA através do QIAamp DNA Stool Mini Kit. A amplificação do gene aggR foi visualizada através de eletroforese em gel de agarose a 1,2% e coloração com brometo de etídio. M = marcador molecular de 100pb; linha 6 = controle positivo (EAEC O42); linha 7 = controle negativo (água).