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1.1.1 – Métodos gerais

Nesse trabalho foi adotado como critério preliminar de pureza a visualização de uma única mancha em cromatoplaca obtida por cromatografia em camada delgada (CCD), utilizando eluentes com diferentes polaridades.

Na preparação das cromatoplacas utilizou-se suspensão de sílica gel 60 G em água (7 g para cada 15 mL), formando camada de 0,25 mm de espessura sob suporte de vidro. Após secagem parcial à temperatura ambiente, as placas foram ativadas em estufa a 100 ºC durante prazo mínimo de 30 minutos. Como reveladores utilizaram-se luz ultravioleta e pulverização com solução de vanilina em álcool etílico (1:99) e solução de ácido perclórico em água (3:97), recém misturadas na proporção de 1:1 v/v, seguida por aquecimento em estufa a 100 ºC. As placas de cromatografia em camada preparativa de sílica gel foram preparadas com 0,75 mm de espessura.

Para o preparo de colunas cromatográficas clássicas (CC) utilizou-se sílica gel 60 (70-230 Mesh). Os solventes empregados nas análises cromatográficas foram hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol. A reutilização desses solventes, quando em mistura e para a mesma coluna, foi realizada após correção das proporções das misturas usando refratômetro modelo Biobrix.

Para teste de Liebermann Burchard (MATOS, 1988) as amostras foram solubilizadas em pequena quantidade de clorofórmio e adicionaram-se 1 mL de anidrido acético e algumas gotas de ácido sulfúrico, ambos concentrados.

As faixas de fusão foram determinadas em aparelho Microquímica MQAPF- 302. Também foram utilizados os métodos de análises térmicas: termogravimetria (TG), análise térmica diferencial (DTA) e calorimetria diferencial de varredura ou exploratória (DSC). Os equipamentos empregados foram DTG-60 Shimadzu e DSC-60 Shimadzu.

O aparelho de luz UV utilizado foi CHROMATO-UVE da Ultra-Violet Products, Inc.

As rotações ópticas específicas foram medidas em polarímetro Perkin Elmer 341 do Laboratório de Quimio e Bioprospecção de Plantas do Cerrado (CerQBio) do DQ da UFMG, utilizando um tubo de 1 dm.

Espectros de absorção na região do infravermelho foram obtidos utilizando, quando necessário, pastilhas de KBr [1% (m/m)]. Os equipamentos usados foram espectrômetro Shimadzu IR-408 do Departamento de Química, UFMG e o espectrômetro modelo Spectrum One Perkin Elmer do Laboratório de Química Farmacêutica da Faculdade de Farmácia da UFMG. O último possui dispositivo ATR permitindo que o espectro seja obtido diretamente da amostra sólida sem a necessidade do uso de pastilha.

Os espectros de RMN de 1D e 2D foram obtidos em espectrômetros Bruker Avance DPX-200 e DRX-400 do Laboratório de Ressonância Magnética de Alta Resolução (LAREMAR) do Departamento de Química, UFMG. Solventes deuterados utilizados encontram-se indicados em cada caso. Os deslocamentos químicos (δ) foram registrados em ppm usando tetrametilsilano (TMS) como padrão de referência interna e as constantes de acoplamento (J) dadas em Hz.

Cromatografia gasosa foi realizada utilizando cromatógrafo HP5890 do Laboratório de Cromatografia do Departamento de Química, UFMG.

1.1.2 – Coleta e identificação do material vegetal

Folhas de Maytenus robusta (Celastraceae) foram coletadas no Parque Estadual do Itacolomi, situado na cidade de Ouro Preto – MG, em junho de 2010 pelo Prof. Dr. Sidney Augusto Vieira Filho da Escola de Farmácia da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP).

O material vegetal foi identificado pela Profa. Maria Cristina Teixeira Braga Messias do Departamento de Biodiversidade, Evolução e Meio Ambiente do Instituto de Ciências Exatas e Biológicas (ICEB) da UFOP. Uma exsicata do especimen (Nº. OUPR 25559) encontra-se depositada no Herbário Professor José Badini do ICEB da UFOP.

1.1.3 – Preparação dos extratos das folhas de Maytenus robusta

Após secagem a temperatura ambiente, as folhas foram pulverizadas em moinho de martelos e obtiveram-se 864,4 g. Os extratos das folhas pulverizadas foram preparados empregando extração exaustiva por maceração à temperatura ambiente. Foram utilizados hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol puros. Após filtração, a remoção dos solventes por destilação sob pressão reduzida, conduziram aos respectivos extratos. Durante a remoção parcial do solvente dos extratos em hexano e clorofórmio houve precipitação de sólidos que foram separados por processo de filtração sob pressão reduzida. A preparação dos extratos está esquematizada na Figura 12, página 16.

A nomenclatura dos extratos foi feita da seguinte forma: letra E, para extrato; H para hexânico; C para clorofórmico; A para acetato etílico; M para metanólico e F para folhas. Para os sólidos, foi incluída a letra S no início da nomenclatura. Assim, o sólido obtido do extrato hexânico das folhas foi identificado como SEHF e o proveniente do extrato clorofórmico como SECF.

A notação empregada para codificar as substâncias ou misturas isoladas durante o estudo fitoquímico do extrato hexânico das folhas de Maytenus robusta tem as iniciais da planta seguida por ordem de isolamento das mesmas.

Figura 12: Esquema da obtenção dos extratos de folhas de M. robusta.

Folhas moídas m = 864,4 g

Torta 1

Torta 3

1- Extração com clorofórmio 2- Filtração

1- Extração com acetato de etila

2- Filtração

1- Extração com metanol Extrato em hexano

1- Remoção parcial do solvente em rotavapor 2- Filtração

Filtrado

Remoção total do solvente

Extrato (EHF) m = 31,43 g Sólido do extrato

(SEHF) m = 4,51 g

1- Remoção parcial do solvente em rotavapor 2- Filtração Filtrado Extrato (ECF) m = 18,49 g Sólido do extrato (SECF) m = 1,78 g 2- Filtração 1- Extração com hexano

Extrato em clorofórmio

Remoção total do solvente

Torta 2

Extrato em acetato de etila

Remoção total do solvente

Extrato (EAF) m = 5,74 g

2- Filtração

Extrato em metanol Torta 4

Extrato (EMF) m = 130,27 g Remoção total do solvente

1.1.4 – Elaboração de SEHF

SEHF (4,51 g) foi obtido como um sólido de coloração ligeiramente verde durante a preparação do extrato hexânico. Apresentou resultado positivo para triterpenos pentacíclicos no teste de Liebermann-Burchard. Realizou-se análise por CCD de SEHF utilizando padrões dos triterpenos pentacíclicos friedelina e

β-friedelinol, os quais são comumente encontrados em membros da família Celastraceae, as duas substâncias foram identificadas como possíveis constituintes do sólido. SEHF foi submetido à CC (Coluna A), utilizaram-se 4,51 g da amostra e 242,7 g de sílica gel 60 (70-230 Mesh). Os eluentes empregados foram clorofórmio, acetato de etila e metanol, puros ou em misturas, em ordem crescente de polaridade. Foram coletadas 178 frações de aproximadamente 50 mL cada (Tabela 2).

Tabela 2. Frações obtidas da coluna A e eluentes utilizados

Fração Eluente

1 – 71 Clorofórmio

72 – 111 Clorofórmio/ acetato de etila (9:1) 112 – 132 Clorofórmio/ acetato de etila (8:2) 133 – 151 Clorofórmio/ acetato de etila (7:3) 152 – 157 Clorofórmio/ acetato de etila (6:4) 158 – 168 Acetato de etila

169 – 178 Metanol

Algumas frações foram consideradas mais promissoras de acordo com a massa e análise por CCD e foram reunidas em 6 grupos (Figura 13, pág. 19). Frações com massas muito pequenas e que apresentaram várias manchas em CCD não foram trabalhadas.

Grupo A1 (frações 12 a 16). Foi obtido como um sólido branco (102,0 mg) com faixa de fusão de 251-254 ºC. A análise por CCD, comparação com amostras autênticas de 3-oxofriedelano e 3 -hidroxifriedelano e os espectros de RMN de 1H e 13C, indicaram tratar-se de 3-oxofriedelano (MR01).

Grupo A2 (frações 17 a 50). Esse grupo foi obtido como um sólido branco (3,32 g). A análise por CCD empregando amostras autênticas de 3-oxofriedelano e 3β-hidroxifriedelano e os experimentos de RMN de 1H e 13C indicaram tratar-se da mistura desses dois compostos codificados como MR01 e MR02.

Grupo A3 (frações 51 a 71). Foi obtido como um sólido branco (163,0 mg) com faixa de fusão de 271-276 ºC. O sólido foi submetido à cromatografia em camada delgada e comparado com uma amostra autêntica de 3β- hidroxifriedelano, indicando tratar-se dessa mesma substância. Espectros no IV e RMN de 1H e 13C foram obtidos e confirmou-se que o composto tratava-se de 3β- hidroxifriedelano (MR02).

Grupo A4 (frações 86 a 89). O grupo foi obtido como um sólido amarelo amorfo (90,0 mg). Foram observadas na cromatoplaca duas manchas quase sobrepostas. Após adição de éter etílico na amostra, houve precipitação de um sólido branco que foi filtrado sob pressão reduzida, obtendo-se 10,8 mg. A análise dos espectros no IV, RMN de 1H e 13C indicou tratar-se de mistura de 3-oxo-11β- hidroxifriedelano (MR03) e 3-oxo-29-hidroxifriedelano (MR04).

Grupo A5 (frações 120 e 121). Foi obtido como um sólido branco (6,0 mg) e apresentou uma única mancha em CCD. Foram obtidas curvas de TG, DTA e DSC e observou-se que o composto começa a decompor próximo de 163 ºC. A análise dos espectros no IV, RMN de 1H e 13C (1D/2D) permitiu elucidar a estrutura química do composto inédito, identificado como 3β,11β-di- hidroxifriedelano (MR05).

Grupo A6 (122 a 131). Foi obtido como um sólido branco amorfo (54,0 mg). Apresentou várias manchas em CCD, sendo que a de maior intensidade apresentou o mesmo Rf do 3β,11β-dihidroxifriedelano. Esse grupo foi submetido a outra CC (Coluna B) utilizando-se 47,94 g de sílica gel 60 (70-230 Mesh). Os eluentes foram clorofórmio, acetato de etila e metanol, puros ou em misturas em gradiente de polaridade. Obtiveram-se 38 frações de aproximadamente 30 mL cada. As frações 19 a 27 foram agrupadas levando a obtenção do subgrupo B1.

Esse subgrupo (15,5 mg) foi comparado com amostra autêntica de 3β,11β- dihidroxifriedelano (MR05) em CCD e ambos apresentaram o mesmo Rf. As demais frações apresentaram massa muito pequena e não foram trabalhadas.

Do sólido obtido durante a preparação do extrato hexânico, foi possível isolar 5 substâncias (algumas como misturas), conforme está representado na Figura 13.

Figura 13: Esquema do fracionamento de SEHF.

1.1.5 – Elaboração de EHF

O extrato hexânico das folhas de Maytenus robusta (EHF) foi submetido à CC (coluna C), utilizaram-se 31,43 g da amostra e 509,3 g de sílica gel 60 (70-230 Mesh). Os eluentes utilizados foram hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol, puros ou em misturas, em ordem crescente de polaridade. Foram obtidas 304 frações de aproximadamente 250 mL cada (Tabela 3). Após análise por CCD, algumas frações foram reunidas em 9 grupos (Figura 14, pág. 26).

SEHF 4,51 g A2 17-50 A1 12-16 A3 51-71 A6 122-131 B1 19-27 MR01 (2,3%) MR02 MR01 MR03 MR05 (0,5%; A5 + B1) MR04 MR05 MR02 (3,6%) MR01: 3-oxofriedelano MR02: 3β-hidroxifriedelano MR03: 3-oxo-11β-hidroxifriedelano MR04: 3-oxo-29-hidroxifriedelano MR05: 3β,11β-di-hidroxifriedelano Coluna A Coluna B A4 86-89 A5 120-121 (73,6%) (0,2%)

Frações com massas muito pequenas e que apresentaram várias manchas em CCD não foram trabalhadas.

Tabela 3. Frações obtidas da coluna C e eluentes utilizados

Fração Eluente 1 – 71 Hexano 72 – 97 Hexano/clorofórmio (9:1) 98 – 134 Hexano/clorofórmio (8:2) 135 – 174 Hexano/clorofórmio (7:3) 175 – 206 Hexano/clorofórmio (5:5) 207 – 242 Clorofórmio 243 – 265 Clorofórmio/acetato de etila (5:5) 266 – 296 Acetato de etila 297 – 304 Metanol

Grupo C1 (fração 3). Foi obtido como um sólido branco amorfo (400,7 mg) com faixa de fusão de 61-65 ºC. A fração foi identificada como mistura de hidrocarbonetos (MR06), após análise do espectro no IV, de RMN e cromatograma de CG. De acordo com o cromatograma obtido, os principais constituintes da amostra foram C27 (12,8%), C29 (36,4%), C30 (2,7%), C31 (27,6%) e C32 (6,7%).

Grupo C2 (fração 4). Foi obtido como um sólido branco amorfo (861,9 mg) com faixa de fusão de 58-62 ºC. Essa fração também foi identificada como mistura de hidrocarbonetos após análise do espectro no IV e cromatograma de CG. A partir do cromatograma, concluiu-se que os principais constituintes da mostra são C27 (13,8%), C28 (1,6%), C29 (42,0%), C30 (2,9%) e C31 (26,3%). Essa amostra também foi codificada como MR06.

Grupo C3 (frações 6 e 7). Esse grupo foi obtido como um óleo viscoso de coloração amarela (1,01 g). A análise por CCD indicou a presença de apenas uma mancha de coloração lilás. Espectros no IV e de RMN foram obtidos e comparados com dados da literatura e concluiu-se que a amostra tratava-se do

hidrocarboneto sesquiterpênico 2,6,11-trimetildodeca-2,6,10-trieno

(tanaceteno) (MR07).

Grupo C4 (frações 104 a 106). Foram observadas várias manchas para esse grupo em CCD. O grupo (1,27 g) foi submetido à CC (coluna D). Utilizaram- se 124,06 g de sílica gel 60 (70-230 Mesh). Os eluentes foram hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol, puros ou em misturas, em ordem crescente de polaridade. Obtiveram-se 305 frações de aproximadamente 10 mL cada (Tabela 4). Após análise por CCD, as frações 59 a 79 foram consideradas mais promissoras e reagrupadas no subgrupo D1. As demais frações não foram trabalhadas por apresentarem massas muito pequenas e várias manchas em CCD.

Tabela 4. Frações obtidas da coluna D e eluentes utilizados

Subgrupo D1 (frações 59-79). Esse subgrupo (88,2 mg) apresentou aspecto de cera. Após adição de hexano houve precipitação de um sólido branco (13,5 mg), o qual foi filtrado sob pressão reduzida. Espectros de RMN foram obtidos para o sólido e comparados com dados da literatura, concluiu-se que se tratava da mistura de 3-oxofriedelano (MR01) e 3-oxo-21β-H-hop-22(29)-eno (MR08). Fração Eluente 1 – 76 Hexano/clorofórmio (5:5) 77 – 104 Hexano/clorofórmio (4:6) 105 – 150 Hexano/clorofórmio (3:7) 151 – 182 Hexano/clorofórmio (1:9) 183 – 226 Clorofórmio 227 – 258 Clorofórmio/acetato de etila (2:8) 259 – 276 Clorofórmio/acetato de etila (5:5) 277 – 293 Acetato de etila 294 – 305 Metanol

Grupo C5 (frações 107 a 130). A esse grupo (1,79 g) foi adicionado hexano e ocorreu precipitação de um sólido branco que foi filtrado sob pressão reduzida levando à obtenção de 624 mg deste sólido. Fez-se CCD comparando o sólido com amostra autêntica de 3-oxofriedelano, ambos apresentaram o mesmo Rf. Espectros de RMN e IV foram obtidos e permitiram concluir que o sólido obtido tratava-se de 3-oxofriedelano (MR01).

Grupo C6 (frações 131 a 137). A partir da análise por CCD utilizando amostras autênticas de 3-oxofriedelano e de 3β-hidroxifriedelano observou-se a presença das duas substâncias. Após a adição de hexano houve precipitação de sólido o qual foi filtrado sob pressão reduzida. A partir de espectros de RMN e IV, o sólido obtido (98,7 mg) foi identificado como mistura de 3-oxofriedelano (MR01) e 3β-hidroxifriedelano (MR02).

Grupo C7 (frações 138 a 150). Nesse grupo houve formação de um precipitado branco após adição de hexano e o sólido (566,1 mg) foi separado através de filtração sob pressão reduzida. Empregando CCD, o sólido foi comparado com amostra autêntica de 3β-hidroxifriedelano e ambos apresentaram o mesmo Rf. Espectros de RMN e no IV foram obtidos e concluiu-se que o sólido tratava-se de 3β-hidroxifriedelano (MR02).

Grupo C8 (frações 151 a 172). Foram observadas várias manchas para esse grupo em CCD. Fez-se uma nova CC (coluna E) a fim de se isolar constituintes do grupo. Utilizaram-se 2,83 g da amostra e 205,0 g de sílica gel 60 (70-230 Mesh). Os eluentes foram hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol, puros ou em misturas, em ordem crescente de polaridade. Foram obtidas 113 frações de aproximadamente 30 mL cada (Tabela 5, pág. 23). As frações 52 a 71 e 72 a 99 foram reunidas em dois subgrupos. Não se trabalharam as demais frações por apresentarem massas muito pequenas e várias manchas em CCD.

Tabela 5. Frações obtidas da coluna E e eluentes utilizados

Subgrupo E1 (frações 52 a 71). O subgrupo foi obtido como um sólido amorfo, apresentou várias manchas em CCD e foi submetido a nova CC (Coluna F), utilizaram-se 777,3 mg de amostra e 55,21 g de sílica gel 60 (70-230 Mesh). Os eluentes foram hexano, acetato de etila e metanol, puros ou em misturas, em ordem crescente de polaridade. Obtiveram-se 60 frações de aproximadamente 5 mL cada. As frações 31 a 39 foram agrupadas em um subgrupo. Não se trabalharam as demais frações por apresentarem massa muito pequena e várias manchas em CCD.

Subgrupo F1 (frações 31 a 39). As frações foram obtidas como um sólido amorfo de coloração amarela. Após adição de hexano houve precipitação de um sólido branco (14,1 mg) que foi filtrado sob pressão reduzida. Esse sólido apresentou uma única mancha em CCD e faixa de fusão de 184-187 ºC. Foram obtidos espectros de RMN de 1H e 13C (1D/2D) e o sólido foi identificado como 3,4-seco-friedelan-3,11β-olideo (MR09), substância inédita.

Subgrupo E2 (frações 72 a 99). O subgrupo (1,80 g) foi obtido como um sólido com aspecto de cera e apresentou várias manchas em CCD. Após adição de etanol ocorreu precipitação de um sólido branco que foi filtrado e, posteriormente, recristalizado em etanol. O sólido recristalizado foi filtrado sob pressão reduzida e obtiveram-se 289,0 mg. Fez-se CCD empregando amostra autêntica de 3β-hidroxi-20(29)-lupeno (lupeol) e observou-se uma mancha de coloração lilás e Rf semelhante ao observado para o lupeol. O sólido foi analisado por espectroscopia no IV e de RMN de 1H e 13C (1D/2D), o que indicou que o

Fração Eluente 1 – 17 Hexano/clorofórmio (5:5) 18 – 54 Hexano/clorofórmio (3:7) 55 – 101 Clorofórmio 102 – 110 Clorofórmio/acetato de etila (9:1) 111– 113 Metanol

sólido não estava puro. O principal componente foi identificado como 3β-hidroxi- 21β-H-hop-22(29)-eno (MR10). O sólido recristalizado foi submetido a uma nova CC (coluna G) a fim de purificá-lo. Utilizaram-se 272,6 mg de amostra e 22,9 g de sílica gel 60 (70-230 Mesh). Os eluentes foram clorofórmio, acetato de etila e metanol, puros ou em misturas, em ordem crescente de polaridade. Obtiveram-se 62 frações de aproximadamente 5 mL. Após análise por CCD, as frações 20 a 35 e 42 a 53 foram agrupadas em dois subgrupos. Não se trabalharam as demais frações por apresentarem massas muito pequenas.

Subgrupo G1 (frações 20 a 35). Foi obtido como um sólido branco (103,0 mg), apresentou uma única mancha em CCD e faixa de fusão de 217-221 ºC. A análise por espectroscopia no IV, de RMN de 1H e 13C indicou tratar-se de 3β- hidroxi-21β-H-hop-22(29)-eno (MR10).

Subgrupo G2 (frações 42 a 53). Foi obtido como um sólido branco amorfo (14,90 mg) com faixa de fusão de 80-84 ºC. A análise por espectroscopia no IV, de RMN de 1H e 13C indicou tratar-se do ácido hentriacontanóico (ácido melíssico) (MR11).

O sobrenadante obtido a partir da recristalização do subgrupo E2 foi submetido à CC (Coluna H). Utilizou-se 1,4919 g da amostra e 81,5 g de sílica gel 60 (70-230 Mesh). Os eluentes foram clorofórmio, acetato de etila e metanol, puros ou em misturas, em ordem crescente de polaridade. Obtiveram-se 100 frações de aproximadamente 5 mL. As frações 28 a 53 foram reunidas em um subgrupo. Não se trabalharam as demais frações por apresentarem massas muito pequenas e várias manchas em CCD.

Subgrupo H1 (frações 28 a 53). Para esse grupo (493,9 mg) foram observadas várias manchas em CCD e uma delas apresentou o mesmo Rf que MR10. Realizou-se CC (coluna I) a fim de se obter maior quantidade de MR10. Utilizaram-se 140,0 g de sílica gel 60 (70-230 Mesh) e os eluentes foram clorofórmio, acetato de etila e metanol, puros ou em misturas, em ordem crescente de polaridade. Obtiveram-se 144 frações de aproximadamente 10 mL.

As frações 53 a 57 e 58 a 93 foram agrupadas em dois subgrupos. Não se trabalharam as demais frações por apresentarem massas muito pequenas e várias manchas em CCD.

Subgrupo I1 (frações 53 a 57). O subgrupo (27,9 mg) apresentou aspecto de cera e observaram-se duas manchas em CCD, sendo que uma delas apresentou o mesmo Rf que MR10.

Subgrupo I2 (frações 58 a 93). Foi obtido como um sólido branco (409,7 mg) e, quando submetido a CCD, exibiu apenas uma mancha com mesmo Rf de MR10. A partir da análise de espectros de RMN de 1_{H e} 13_{C concluiu-se que o}

sólido tratava-se de MR10.

Grupo C9 (frações 173-209). Esse grupo (1,90 g) apresentou algumas manchas em CCD, foi considerado promissor e submetido a uma nova coluna cromatográfica (coluna J). Utilizaram-se 255,3 g de sílica gel 60 (70-230 Mesh). Os eluentes foram hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol, puros ou em misturas, em ordem crescente de polaridade. Foram obtidas 200 frações de aproximadamente 30 mL cada. As frações 88 a 89 e 90 a 92 foram reunidas de acordo com o perfil cromatográfico em CCD e reunidas em dois subgrupos. Não se trabalharam as demais frações por apresentarem massas muito pequenas e várias manchas em CCD.

Subgrupo J1 (frações 88 a 89). Esse grupo (148,7 mg) apresentou uma única mancha em CCD mesmo com a utilização de diferentes misturas de solventes como eluentes. Após adição de hexano na amostra ocorreu precipitação de um sólido branco (59,5 mg) que foi filtrado sob pressão reduzida. O sólido foi identificado a partir da análise de espectros no IV e RMN como mistura de ácido 3,4-seco-21β-H-hop-22(29)-en-3-óico e de ácido 3,4-seco- friedelan-3-óico (MR12) e (MR13).

Subgrupo J2 (frações 90-92). Nesse subgrupo (244,7 mg), após a adição de hexano ocorreu precipitação de um sólido branco (83,8 mg), o qual apresentou duas manchas em CCD com valores de Rf muito próximos mesmo após várias

tentativas utilizando diferentes misturas de solventes como eluentes. O sólido foi identificado a partir de espectros no IV e de RMN como mistura de ácido 3,4- seco-friedelan-3-óico (MR13) e sitosterol (MR14). Fez-se CCD preparativa na tentativa de separar as substâncias, mas não foi possível obtê-las puras.

Do extrato hexânico foi possível isolar 11 substâncias (algumas como misturas), conforme está representado na Figura 14.

EHF (31,433 g) C2 4 C1 3 C3 6-7 C4 104-106 C5 107-130 C7 138-150 MR07 (3,2%) MR08 MR01 MR02 (1,8%) MR01 (2,0%) MR06 C6 131-137 C8 151-172 MR12 MR10 MR14 MR13 MR10 (1,63 %; I2 + G1) MR01: 3-oxofriedelano MR02: 3β-hidroxifriedelano MR06: mistura de hidrocarbonetos MR07: 2,6,11-trimetildodeca-2,6,10-trieno MR08: 3-oxo-21β-H-hop-22(29)-eno MR09: 3,4-seco-friedelan-3,11β-olídeo MR10: 3β-hidroxi-21β-H-hop-22(29)-eno MR11: ácido hentriacontanóico MR12: ácido 3,4-seco-21β-H-hop-22(29)-en-3-óico MR13: ácido 3,4-seco-friedelan-3-óico MR14: sitosterol C9 173-209 D1 59-79 MR01 MR02 Coluna C Coluna D Coluna E Coluna G Coluna H Coluna I E1 52-71 E2 72-99 F1 31-39 Recristalização (EtOH) Sólido Sobrenadante G1 20-35 G2 42-53 MR11(0,05%) H1 28-53 I1 53-57 I2 58-93 J1 88-89 J2 90-92 Coluna F MR09 (0,04%) MR13 MR06 (0,4%; C1 + C2) (0,04%) (0,3%) (0,02%) (0,03%) Coluna J Figura 14: Esquema utilizado para o fracionamento de EHF.