Bakteri Deneyleri

3.1.3.1. Bakteri kültürlerindeki ADF aktivitesinin karıncalarda test edilmesi Kadavra deneylerinin ardından aynı karınca kolonisi ile bakteri deneylerine devam edilmiştir. Deneylerde 24 gözenekli hücre kültür kapları (Nest Biotechnology Co., Ltd. veya Corning® Inc.) kullanılmıştır. Stok kültürden alınan P. luminescens bakterileri deneylerden önce NBTA agarda üretilip koloni morfolojisi ve

mikroskobik incelemelerle kontrol edilmiştir. Daha sonra bu koloniler TSB ortamına aktarılıp 24 saat boyunca 28°C’de ve çalkalamalı inkübatörde 100 rpm’de inkübe edilmiştir. Bu başlangıç kültüründen 24 saat sonra yeni bir TSB (50 ml) ortamına 100 µl bakteri süspansiyonu aktarılmıştır. Aynı işlem her 24 saatlik kültür ile 16 gün boyunca tekrarlanmıştır. Bu şekilde 24-384 saatlik bakteri kültür serisi elde edilmiştir. Bu kültürlerden 24 gözenekli hücre kültür kaplarının kuyucuklarına 1’er ml konmuştur. Kuyucuklardaki ortamlara karıncaları çekmek için bakteri kültürlerinin toplam hacminin %5’i olacak şekilde %100 lük Sükroz çözeltisinden 0,05 ml ilave edilmiştir (Zhou vd., 2002). Tesadüfi dağıtılarak hazırlanan deney düzenekleri karınca yuvalarının girişine veya kullandıkları yollara bırakılmıştır. Üç saat sonunda kuyucuklarda kalan sıvı miktarları tartılarak tüketim oranları hesaplanmıştır. Deneyin başlangıcından bir saat sonra kuyucuklarda beslenen karıncalar sayılarak kaydedilmiştir. Kontrol grubu olarak %5’lik sükroz çözeltisi kullanılmıştır. Bununla beraber sıvılardaki buharlaşma oranını da göz önüne almak için deney sahasına başka bir 24 gözenekli hücre kültür kabı içerisinde ve karıncaların ulaşamadığı bir yerde aynı miktarda (1 ml) distile su bırakılmıştır. Deneyler 3 defa tekrarlanmıştır (Zhou vd., 2002).

3.1.3.2. Bakteri kültürlerindeki ADF aktivitesinin yabanarıları (wasp) ile test edilmesi

Yabanarılarının ADF’ye verdiği tepkiler P. luminescens ve E. coli kültürlerinin süpernatantları kullanılarak test edilmiştir. P. luminescens’in 8 günlük kültürü ve kontrol grubu olarak da 24 saatlik E. coli kültürü hazırlanmıştır. Bakteri kültürleri 20000xG’de +4°C de 15 dakika santrifüjlenerek süpernatantları elde edilmiştir. P. luminescens süpernatantı 2 farklı şekilde denenmiştir. İlk olarak süpernatant hiçbir işlem uygulanmadan doğrudan kullanılmıştır. Yabanarısı kolonisine P. luminescens ve E. coli süpernatantları içerisinde 1 saat bekletilmiş kuzu karaciğeri parçaları verilmiştir. İkinci denemede ise süpernatant önce -80°C’de 24 saat dondurulmuştur. Ardından -52°C’de liyofilize edilmiştir. Toz haline getirilen süpernatant 1/1 oranında sulandırılmış ve içerisine karaciğer ve et parçaları atılarak 1 saat bekletilmiştir. Bir başka kontrol grubu olarak ise sadece su içerisinde bekletilmiş karaciğer ve et parçaları kullanılmıştır. Bu çalışma iki farklı bölgede gerçekleştirilmiştir. Birinci seçilen bölge Aydın iline bağlı Germencik ilçesinin Habibler köyü olup, burada karaciğer parçaları kullanılmıştır. İkinci

seçilen bölge ise Adnan Menderes Üniversitesi Merkez Kampüs alanı olup, burada ise et parçaları kullanılmıştır. Her iki deneme de alana gelen Vespa orientalis ve Paravespula sp. türlerine ait yabanarılarının beslenme davranışları 3 saat boyunca gözlenmiştir.

3.1.3.3. Bakteri kültürlerindeki ADF aktivitesinin leş sinekleri (Calliphoridae) üzerinde test edilmesi

Aydın iline bağlı Germencik ilçesinin Habipler köyünden elde edilen leş sineği (Diptera: Calliphoridae) yumurtaları ile laboratuvar kolonisi kurulmuştur. Koloniler yaklaşık 200 bireyden oluşan gruplar halinde 30x30x45 cm ebatlarındaki kafeslerde 25°C ve % 20-40 nem değerlerinde tutulmuştur. Yumurtadan çıkan sinek larvaları et parçaları ile beslenmiştir. Erginlere şeker süttozu karışımı ve doğurganlıklarını sağlamak için et parçaları verilmiştir. Çiftleşen dişilerin yumurtlamaları için plastik kaplar içerisinde et parçaları bırakılmıştır (Wolff ve Hansson, 2005).

Bu çalışmada leş sineklerinin erginlerinin ADF maddesine duyarlılıkları yumurtlama davranışları takip edilerek test edilmiştir. Bunun için yabanarısı deneylerindeki yöntemle hazırlanmış olan süpernatantların içerisinde bekletilen et parçaları kullanılmıştır. Deneyden 48 saat önce dişilerin yumurtlamaları için önceden bırakılan et parçaları kafeslerden uzaklaştırılmıştır. Böylece dişilerin yumurtlamaya hazır hale gelmeleri sağlanmıştır. Ardından 10 cm’lik petriler içerisinde P. luminescens bakterilerinin süpernatantında 1 saat bekletilmiş et parçaları konmuştur. Kontrol grubu olarak ise suda bekletilmiş et parçaları kullanılmıştır. Etler kafeslere bırakıldıktan sonra 24 saat boyunca sineklerin davranışları gözlenmiştir.

3.1.3.4. Yüksek sıcaklığın bakterilerin ürettiği ADF maddesi üzerine etkisinin araştırılması

Yüksek sıcaklığın ADF’ye etkisini gözlemlemek için P. luminescens bakterisinin 24-192 saatlik sıvı kültürleri hazırlanmıştır. Hazırlanan kültürlerin her birinden 25’er ml alınıp 121°C de 20 dk otoklavlanmıştır. Her iki gruba (Otoklavlanmış ve otoklavlanmamış) ait bakteri kültürlerinden 24 gözenekli hücre kültür kaplarının kuyucuklarına 1’er ml konmuştur. Kuyucuklardaki kültürlere karıncaları çekmek

için aynı şekilde %100’lük sükroz çözeltisinden 0,05 ml ilave edilmiştir. Böylece deney gruplarıyla kontrol grubunun sükroz oranları eşitlenmiştir. Deney düzenekleri yine aynı L. frauenfeldi kolonisinin yuva girişine bırakılmıştır. Karıncaların davranışları 3 saat boyunca gözlenmiştir. Deney sonunda her kuyucukta kalan sıvı miktarları tartılarak hesaplanmıştır.

Aynı çalışma 144 saatlik P. luminescens bakteri kültürünün süpernatant ve peleti ile tekrarlanmıştır. Hazırlanan bakteri kültürü 20000xG +4°C’de 15 dk santrifüjlenmiştir. Santrifüj işlemi SIGMA 3K 30 model soğutmalı santrifüj cihazı ile yapılmıştır. Elde edilen süpernatantın bir kısmı 121°C’de 20 dk. otoklavlanmıştır. Peletin bir kısmı %0,9’luk NaCl çözeltisi ile yıkanmıştır. Bu sayede bakteri hücrelerinin yüzeyleri temizlenmiştir. Yıkama işleminde pelet önce %0,9’luk NaCl’de çözülmüş ve ardından 20000xG’de +4°C’de 15 dk. santrifüjlenmiştir. Üstteki sıvı uzaklaştırıldıktan sonra bu işlem 2 defa daha tekrarlanmıştır. Böylece sonuçta 144 saatlik P. luminescens süpernatantı, peleti, otoklavlanmış süpernatantı ve yıkanmış peleti olmak üzere 4 farklı deney grubu hazırlanmıştır. Deneyde 2 farklı kontrol grubu kullanılmıştır. Bunlardan birisi %5’lik sükroz çözeltisi, diğeri Nütrient Broth (Merck) besiyerinde üretilmiş 24 saatlik Escherichia coli ATCC 25922 kültürünün aynı şekilde santrifüjlenerek elde edilmiş olan süpernatant ve peletidir. Deney sırasında kuyucuklardan beslenen karınca sayıları ve son olarak kuyucuklarda kalan sıvı miktarları kaydedilmiştir. Deneyler 3 saat süresince devam etmiştir.