Ebeveyn Kabul Red/Kontrol Ölçeği (Çocuk/Ergen Kısa Formu)

Desta forma, um estudo sistemático dos parâmetros experimentais que influenciam a resposta por DPV foi realizado na presença de catecol 5,0 × 10−5 mol L−1 em tampão fosfato 0,1 mol L−1 (pH 7,0). A velocidade de varredura (v_{) foi avaliada}

no intervalo de 1 a 25 mV s−1, a amplitude de pulso de potencial (a_{) na faixa de 10 a}

150 mV e o tempo de modulação (t_{) no intervalo de 5 a 50 ms. Os valores ótimos}

encontrados para estes parâmetros, empregados para a construção da curva analítica foram: v _{= 15 mV s}−1_, a _{= 90 mV, e} t _{= 20 ms. Os melhores resultados}

levaram em conta reprodutibilidade, a estabilidade da linha de base, precisão e sensibilidade do Tyr-BMIM-MWCNTs-DHP/GCE para a determinação de catecol. Na FIGURA 3.13 são apresentados os voltamogramas de pulso diferencial e a curva analítica (inserida) obtidos para catecol usando o biossensor Tyr-BMIM-MWCNTs- DHP/GCE proposto.

O biossensor proposto utilizando a técnica de DPV apresentou uma resposta linear para catecol na faixa de concentração de 5,1 × 10−6 a 1,0 × 10−4 mol L−1, segundo a equação ∆Ipc (µA) = 0,24 + 6,95 × 104 C (mol L−1) com coeficiente de

correlação de 0,994. O limite de detecção obtido (calculado a partir da relação: três vezes o desvio padrão para a solução do branco (n = 10), dividido pelo coeficiente angular da curva analítica) foi de 7,2 × 10−7 mol L−1.

-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 -8 -6 -4 -2 0 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 −Δ I / μ A [Catecol] × 10−5 mol L−1

I

/

μ

A

E / V vs. Ag/AgCl (KCl 3,0 mol L

)

FIGURA 3.13 – Voltamogramas de pulso diferencial, obtidos com o biossensor Tyr- BMIM-MWCNTs-DHP/GCE em tampão fosfato 0,1 mol L−1 (pH 7,0) contendo diferentes concentrações de catecol: (a) 5,1 × 10−6, (b) 7,6 × 10−6, (c) 1,0 × 10−5, (d) 2,3 × 10−5, (e) 3,5 × 10−5, (f) 4,8 × 10−5, (g) 6,1 × 10−5, (h) 7,3 × 10−5, (i) 8,6 × 10−5 e (j) 1,0 × 10−4 mol L−1. Inserido: Curva analítica obtida para catecol.

Após a otimização dos parâmetros relacionados às duas técnicas empregadas e a construção das curvas analíticas para a determinação de catecol, foi possível realizar uma comparação entre os resultados obtidos. Na TABELA 3.2 são apresentados os dados obtidos empregando-se as técnicas LSV e DPV, nos procedimentos propostos para a determinação de catecol com o biossensor Tyr- BMIM-MWCNTs-DHP/GCE.

TABELA 3.2 – Comparação entre as técnicas utilizadas na determinação de catecol empregando o biossensor Tyr-BMIM-MWCNTs-DHP/GCE

Condições Analíticas LSV DPV

Equação da reta (µA) ∆Ipc = 0,69 + 3,28 × 104 C ∆Ipc = 0,24 + 6,95 × 104 C

LD (mol L−1) 5,8 × 10−7 7,2 × 10−7

Faixa linear (mol L−1) 4,9 × 10−6 a 1,1 × 10−3 5,1 × 10−6 a 1,0 × 10−4 Sensibilidade

(µA mol−1 L) 3,28 × 10

4

O procedimento proposto empregando a técnica de LSV apresentou maior faixa linear (uma década maior) e melhor limite de detecção. Por esta razão foi empregada na determinação de catecol em amostras de águas naturais. Os parâmetros analíticos do procedimento proposto (LSV) foram comparados aos métodos já descritos na literatura usando diferentes biossensores de Tyr para determinação de catecol (TABELA 3.3).

TABELA 3.3 – Comparação dos parâmetros analíticos obtidos usando diferentes biossensores de tirosinase para determinação de catecol

Eletrodo Faixa linear

(µmol L−1)

Limite de detecção (µmol L−1)

Sensibilidade

(mA mol−1 L) Estabilidade Referência

Tyr-DNA/CP 1,0 – 50 1,0 – Tempo de prateleira: 2 meses 110

Tyr-PAPCP/ITO 1,6 – 140 1,2 3,5 80% após 120 dias 112

Tyr/SPPtE – 1,7 – 50-60% após 150 medidas 123

Tyr-Oscomplexo-funcionalizado/Pt – 0,01 6,1 – 113

Tyr-Agarose-guar gum/GCE 60 – 800 6,0 – Tempo de prateleira: 2 meses 125

Tyr-MWCNT-PPy/GCE 3,0 – 50 0,67 8,0 85% após 70 dias 126

Tyr/MWCNTs/AuNPs/AEP/Au 1,0 – 500 0,8 150 80% após 42 dias 127

Tyr-MWCNTs-MNP/SPE 10 – 80 7,6 4,8 Tempo de prateleira: 1 mês 48

Tyr-PO4–PPy/Pt 10 – 120 0,84 47 80% após 30 dias

99

Tyr-PANI/Pt 5,0 – 140 0,05 – 90% após 120 dias 122

Tyr-HTLc/GCE 3,0 – 300 0,1 – 72% após 30 dias 128

Tyr-BMIM-MWCNTs-DHP/GCE 4,9 – 1100 0,58 32,8 *95% após 30 dias Este trabalho

CP: Pasta de carbono; PAPCP: Poli (N-3-aminopropil pirrol-co-pirrol); ITO: Óxido de índio-estanho; SPPtE: Eletrodo impresso de platina; Os: Ósmio; Pt: Eletrodo de platina; PPy: Polipirrol; AuNPs: Nanopartículas de ouro; AEP: Acetona extraída de própolis; Au: Eletrodo de ouro; MNP: Nanopartículas magnéticas; PANI: polianilina; HTLc: Mg–Al–CO3 hidrotalcita. *190 determinações.

Observa-se que o procedimento proposto empregando o biossensor Tyr-BMIM-MWCNTs-DHP/GCE apresentou uma ampla faixa linear, de quase três décadas, maior do que as relatadas em outros procedimentos com biossensores para catecol48,99,110,112,113,122,123,125-128. O limite de detecção obtido neste trabalho também se apresentou inferior aos obtidos com os biossensores48,99,110,112,123,125-127 e superior aos obtidos com os biossensores113,122,128. A sensibilidade do método voltamétrico proposto foi maior do que as obtidas na maioria dos métodos da literatura48,112,113,126. Além disso, o biossensor proposto apresentou uma boa estabilidade com diminuição de sua atividade de apenas 5% após 30 dias.

A constante cinética aparente de Michaelis-Menten ( _M ) fornece informação importante sobre a atividade catalítica e afinidade entre enzima e o substrato. O valor de _M é inversamente proporcional à probabilidade de formação do produto por ligação entre o centro ativo da enzima e o substrato. É possível estimá-lo a partir da equação de Lineweaver-Burk62,125 (Equação 19):

á

M

á Eq. 19

onde Is é a corrente no estado estacionário medida para produto enzimático e Imáx, é

a corrente máxima sob condição de saturação do substrato (catecol).

Os coeficientes angular e linear do gráfico de 1/Is versus 1/[catecol],

são iguais a _M /Imáx e 1/Imáx, respectivamente. Então, _M é obtida multiplicando o

slope por Imáx.

O gráfico de Lineweaver-Burk para o biossensor Tyr-BMIM-MWCNTs- DHP/GCE foi obtido seguindo a equação 1/Is = 0,203 + 38,61 × 1/[catecol]

(coeficiente de correlação de 0,995). A TABELA 3.4 apresenta os valores de _M relatados na literatura para diferentes biossensores de tirosinase, utilizando catecol como substrato. O valor de _M obtido neste trabalho foi de 0,19 mmol L−1, que está de acordo com os valores previamente reportados para biossensores contendo MWCNTs e nanopartículas magnéticas48, monocamadas auto-montadas em eletrodo de ouro157, eletrodos à base de grafite158 e carbono vítreo reticulado com resina epóxi159. Maiores valores de _M do que o obtido neste trabalho foram reportados por CAMPUZANO et al. para Tyr imobilizada em monocamadas auto-montadas160, por KIRALP e colaboradores para Tyr imobilizada em polipirrol161 e por outros

autores para Tyr livre161-164. Isto sugere que a enzima imobilizada em BMIM- MWCNTs, tem uma elevada afinidade pelo catecol, devido a um aumento na transferência eletrônica.

TABELA 3.4 – Valores de _M para diferentes biossensores de Tyr empregados na determinação de catecol

Biossensor /mmol L−1 Reference

Tyr-MWCNTs-MNP/SPE 0,18 48

Tyr-SAMs/Au 0,18 157

Tyr-BMIM-MWCNTs-DHP/GCE 0,19 Este trabalho

Tyr/GE 0,19 158 Tyr/RVC-ER 0,20 159 Tyr livre 0,28 162 Tyr-MPA-SAMs/Au 0,33 160 Tyr livre 0,44 163 Tyr livre 4,0 164 Tyr-PPy/Pt 100 161 Tyr-PPy-MM/Pt 200 161

SPE: Eletrodo impresso; MNP: Nanopartículas magnéticas; Au: Eletrodo de ouro; SAMs: Monocamadas auto-montadas; GE: Eletrodo de grafite; RVC-ER: Carbono vítreo reticulado com resina epóxi; MPA: Ácido 3-mercaptopropiônico; PPy: Polipirrol; MM: metil monômero.

A repetibilidade (n = 10) de um biossensor Tyr-BMIM-MWCNTs- DHP/GCE foi avaliada em presença de catecol 5,0 × 10−5 mol L−1 e tampão fosfato 0,1 mol L−1 (pH 7,0). O valor do desvio padrão relativo (RSD) obtido para repetibilidade intra-dias foi de 1,16% e repetibilidade inter-dia foi de 2,94%, indicando uma boa estabilidade do filme. Ademais, a repetibilidade da fabricação de cinco biossensores Tyr-BMIM-MWCNTs-DHP/GCE diferentes na presença de catecol de 5,0 × 10−5 mol L−1 em tampão fosfato 0,1 mol L−1 (pH 7,0) foi também objeto de estudo nesta tese. O desvio padrão relativo (RSD) foi de 4,86%, indicando uma boa repetibilidade do preparo dos biossensores.