BĠYOKĠMYASAL MARKERLER VE KARDĠYOTOKSĠSĠTE

A identificação dos fragmentos amplificados pode ser realizada em gel de poliacrilamida. Uma fração de cada uma das diferentes amostras de DNA a ser analisado, bem como amostras já conhecidas de DNA para servirem como controle e indicadores de posição dos possíveis alelos a serem encontrados, são submetidos a um processo de eletroforese que promove, sob um campo elétrico, a migração diferencial dos fragmentos de DNA determinada pelo tamanho deles, sendo maiores as distâncias percorridas pelos fragmentos mais curtos.

Após a eletroforese, de acordo com os reagentes utilizados na amplificação do DNA, a identificação dos fragmentos pode se dar pela coloração do gel em prata ou pela detecção de sinal de fluorescência dos primers marcados com fluorocromos que permitem sua identificação por analisadores automáticos com tecnologia laser. Os resultados da detecção do DNA pela coloração do gel por precipitação de prata são bandas que correspondem aos alelos identificados. Já na detecção por fluorescência através de analisador automático, os alelos podem ser apresentados em bandas ou em picos, conforme ilustram as Figuras 5, 6, 7 e 8.

Figura 5 – Sistemas STR triplex de detecção por prata. Os sistemas multiplex CTT, FFv, e

SilverSTR™III são mostrados nos painéis A, B e C, respectivamente. Cada uma das linhas

numeradas de 1 a 4 contém individualmente amostras de DNA amplificado e as linhas denominadas como L contêm uma escada alélica21 para os respectivos loci em cada sistema multiplex. Os fragmentos amplificados e as escadas alélicas foram separados em gel de poliacrilamida 4% e detectados por um sistema de coloração por precipitação de prata (adaptado de LINS et al., 2000).

21 _{Allelic ladder: marcador utilizado para identificar os alelos de um lócus STR específico. Tais alelos são} gerados por amplificação em PCR.

Figura 6 – Sistemas STR quadriplex de detecção por fluorescência. Os sistemas multiplex CTTv,

FFFL, e GammaSilverSTR™ são mostrados nos painéis A, B e C, respectivamente. Cada uma

das linhas numeradas de 1 a 6 contém individualmente amostras de DNA amplificado e as linhas denominadas como L contêm uma escada alélica para os respectivos loci em cada sistema multiplex. Os fragmentos amplificados e as escadas alélicas foram separados em gel de poliacrilamida 4% e detectados por scanner Hitachi FMBIO®II fluorescente (adaptado de LINS et al., 2000).

Figura 7 – Sistema GenePrint™ PowerPlex™ 1.1. Seis amostras de DNA (linhas de 1 a 6) foram

amplificadas usando o sistema PowerPlex™ 1.1, separadas em gel de poliacrilamida 4% e

detectadas por scanner Hitachi FMBIO®II fluorescente. O painel A mostra a imagem do gel escaneado em três cores. As cores da imagem foram separadas em escaneamento individuais (painéis B, C e D). O painel B representa os loci que são marcados com fluoresceína (D16S539, D7S820, D13S317 e D5S818) que são mostrados em verde no painel A. O painel C representa os

loci marcados com o corante fluorescente TMR (CSF1PO, TPOX, TH01 e vWA) que são

mostrados em vermelho no painel A. O painel D representa o padrão interno CRX e está representado em azul no painel A. As linhas denominadas L contêm a escada alélica para os respectivos loci em cada cor (adaptado de LINS et al., 2000).

Figura 8 – Eletroferograma22 obtido em análise do Sistema GenePrint™ PowerPlex™ 1.2. Uma

única amostra de DNA foi amplificada usando o sistema PowerPlex™ 1.2 e detectadas pelo

analisador automático ABI PRISM®. O painel superior mostra os loci que são marcados com fluoresceína (D5S818, D13S317, D7S820 e D16S539). O painel central mostra os loci marcados com o corante fluorescente TMR (vWA, TH01, amelogenina, TPOX e CSF1PO) e o painel inferior mostra o padrão interno CRX (adaptado de LINS et al., 2000).

Atualmente, dado o grande volume de análises nos laboratórios forenses, mormente os sistemas multiplex são analisados e tipificados pela utilização de analisadores automáticos. Para facilitação do processo analítico, tem-se optado pela escolha de sistemas de eletroforese capilar com multicanais para detecção e que são combinados, nos laboratórios de grande porte, com sistemas robotizados e sistemas de gerenciamento de informações, incluindo código de barra das amostras para reduzir erros de operação.

Gráfico resultante da eletroforese em analisador automático, mostrando a intensidade da fluorescência como uma função do peso molecular; o pico em um determinado comprimento de onda (cor) corresponde a uma molécula especificadamente marcada e de tamanho particular.

A automação reduz custos e aumenta o ritmo de obtenção de resultados. A interpretação dos resultados, ou seja, a definição do perfil alélico, é mais difícil de automatizar. Contudo, tem havido progresso em se converter a tradicional e subjetiva interpretação do analista forense em regras heurísticas para programas de informática, conhecidos como expert systems (WERRETT; PINCHIN; HALE, 1998). Estes programas levam em conta o tamanho (medido com acurácia por meio do padrão interno e da escada alélica); a altura e a área dos picos do eletroferograma, com avaliação do balanço heterozigótico23; e incluem, ainda, uma checagem automática para interpretação de artefatos da PCR como os stutters (JOBLING; GILL, 2004).

A qualidade do DNA oriundo de amostras-referência é geralmente boa e isto faz com que a automação da tipagem e da identificação sejam relativamente simples. Nas amostras questionadas, uma avaliação preliminar é vital para determinar o melhor método de processamento, porém a automação é mais dificultosa porque a qualidade e a quantidade de DNA são variáveis e também porque misturas são freqüentemente encontradas, bem como perfis anômalos provenientes de mutações podem também aparecer, complicando a interpretação. Deve-se levar em conta ainda que se os métodos usados são sensíveis o suficiente para detectar moléculas de LCN-DNA (baixo número de cópias de DNA), então, a contaminação, seja por um ou por múltiplos alelos, apesar de severas precauções laboratoriais para evitá-la, possui forte possibilidade de ocorrência e para lidar com ela são necessárias determinadas estratégias para interpretação.

7. Significância e interpretação dos resultados24