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Foram utilizadas para as análises moleculares alíquotas de tecido hepático ou muscular, preservadas em álcool etílico absoluto ou em solução tampão, de 49 espécimes (12

Akodon, oito Brucepattersonius, um Oxymycterus, três Euryoryzomys, 14 Oligoryzomys, três Trinomys, dois Phyllomys e seis Marmosops) provenientes da EEB e depositadas no Museu

de Zoologia da Universidade de São Paulo (MZUSP). Para o desenvolvimentos das análises, utilizou-se ainda sequências comparativas depositadas no GenBank e sequências cedidas pelo Dr. James L. Patton.

2.2.2.2 Extração, amplificação e sequenciamento

A extração do DNA total das alíquotas de tecido foi realizada com a utilização do kit DNeasy® Blood & Tissue, com o protocolo fornecido pelo fabricante (QIAGEN INC.); com exceção das alíquotas dos espécimes de Phyllomys, para as quais utilizou-se o protocolo descrito em Bruford et al. (1992). O marcador genético selecionado para amplificação e sequenciamento foi o gene mitocondrial do citocromo b (Cytb). A amplificação deste marcador foi realizada via Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) com os oligonucleotídeos iniciadores (primers) e protocolos específicos para cada táxon.

Para os gêneros Akodon e Brucepattersonius foram utilizados os primers externos MVZ05 (SMITH; PATTON, 1993) e UMMZ04 (JANSA; GOODMAN; TUCKER, 1999) juntamente com dois novos primers internos, BRUCE793 e BRUCE664 (Figura 4; Tabela 1). As amplificações ocorreram em reações com volume total de 25 µ l utilizando 1 µ l de cada

primer, 5 µl de solução tampão (buffer), 2 µl de MgCl2, 0,5 µl de dNTP, 0,125 µl de Go Taq® DNA polimerase (PROMEGA CORP.), 1 µl de DNA da amostra e 14,375 µl de dH2O. O Cytb foi amplificado em 30 ciclos com desnaturação a 95°C por 15 s, anelamento a 50°C por 15 s e extensão a 72°C por 1 min. A desnaturação inicial ocorreu a 95°C por 2 min e a extensão final ocorreu a 72°C por 7 min. Quando o resultado da primeira amplificação não foi satisfatório conduziu-se uma reamplificação, utilizando o mesmo protocolo, apenas substituindo o DNA da amostra pelo produto da primeira PCR e diminuindo o número de ciclos para 25.

Figura 4 – Desenho esquemático mostrando a localização dos primers utilizados para a amplificação do Cytb de espécimes dos gêneros Brucepattersonius e Akodon

Tabela 1 – Primers internos desenhados para a amplificação e sequenciamento do gene Cytb para os gêneros

Akodon, Brucepattersonius, Euryoryzomys e Oligoryzomys. Primers com a letra “F” após o nome

correspondem a “Forward primers” e com a letra “R” correspondem a “Reverse primers”

Primer Sequência BRUCE664F 5’ CTGATAAAATTCCATTCCACC BRUCE793R 5’ ATTCTGGTTTAATGTGTGCTGG EURY544F 5’ AAAGCCACATTAACACGATTCTTC EURY829R 5’ GTAGGATGGCATAAGCGAATAGG EURY745R 5’ TAATTATCGGGGTCTCCGAGAAC

Para parte dos espécimes do gênero Euryoryzomys o Cytb foi amplificado utilizando apenas os primers externos MUS14095 e MUS 15398 (ANDERSON; YATES, 2000). Este processo ocorreu em reações com volume total de 25 µl utilizando 0,5 µl de cada primer, 2,5 µ l de buffer, 0,75 µl de MgCl2, 0,5 µl de dNTP, 0,1 µl de Platinum® Taq DNA polimerase (LIFE TECHNOLOGIES CORP.), 1 µl de DNA da amostra e 19,15 µl de dH2O. Foi utilizado um programa em touchdown para amplificação com desnaturação a 95°C por 15 s, extensão a 72ºC por 2 min e anelamento a 54, 52 e 50°C por 15 s correspondendo a 5, 5 e 25 ciclos respectivamente. A desnaturação inicial ocorreu a 95°C por 2 min e a extensão final a 72°C por 7 min. Quando o resultado da primeira amplificação não foi satisfatório conduziu-se uma reamplificação, utilizando o mesmo protocolo, apenas substituindo o DNA da amostra pelo produto da primeira PCR e utilizando um programa simples de amplificação com uma única temperatura (54°C) e 30 ciclos.

A segunda parte de espécimes de Euryoryzomys, para as quais o protocolo de amplificação acima descrito não gerou bons resultados de sequenciamento, foi trabalhada de forma diferente, amplificando o Cytb em dois fragmentos. Para a primeira porção do gene utilizou-se os primers MUS14095 (ANDERSON; YATES, 2000) e EURY829 (Figura 5; Tabela 1) e para a segunda porção os primers EURY544 (Figura 5; Tabela 1) e ORYZO1 (PERCEQUILLO; WEKSLER; COSTA, 2011). Neste caso, as amplificações ocorreram em reações com volume total de 25 µ l utilizando 1 µ l de cada primer, 5 µ l de buffer, 2 µl de

MgCl2, 0,5 µ l de dNTP, 0,125 µl de Go Taq® DNA polimerase (PROMEGA CORP.), 1 µl de DNA da amostra e 14,375 µl de dH2O. A desnaturação inicial ocorreu a 95°C por 2 min e a extensão final ocorreu a 72°C por 7 min, sendo o Cytb amplificado em 30 ciclos com desnaturação a 95°C por 15 s, anelamento a 58°C por 15 s e extensão a 72°C por 1 min.

Figura 5 - Desenho esquemático mostrando a localização dos primers utilizados para a amplificação do Cytb de espécimes dos gêneros Euryoryzomys e Oligoryzomys

O Cytb dos indivíduos do gênero Oligoryzomys foi amplificado em dois fragmentos com os primers MUS14095 (ANDERSON; YATES, 2000) e EURY745 (Figura 5; Tabela 1), para a primeira porção do gene, e EURY544 (Figura 5; Tabela 1) e ORYZO1 (PERCEQUILLO; WEKSLER; COSTA, 2011), para a segunda porção; em reação de amplificação como a descrita para Akodon e Brucepattersonius. O programa de amplificação correspondeu a 30 ciclos com desnaturação a 95°C por 15 s, anelando a 56°C (para a primeira porção) e 58°C (segunda porção) por 15 s e extensão a 72°C por 1 min. A desnaturação inicial ocorreu a 95°C por 2 min e a extensão final a 72°C por 7 min.

Para o espécime do gênero Oxymycterus e os espécimes de Trinomys o Cytb foi amplificado com os primers MVZ05 (SMITH; PATTON, 1993) e UMMZ04 (JANSA; GOODMAN; TUCKER, 1999) e solução de reação, novamente, como a descrita para os gêneros Akodon e Bruceppatersonius. Foi utilizado um programa em touchdown para amplificação com desnaturação a 95°C por 15 s, extensão a 72ºC por 2 min e anelamento a 54, 52, 50 e 48°C por 15 s correspondendo a 5, 5, 5 e 25 ciclos respectivamente. A desnaturação inicial ocorreu a 95°C por 2 min e a extensão final a 72°C por 7 min.

Para os espécimes de Phyllomys foram amplificados apenas os primeiros 801 pares de base do Cytb, utilizando os primers MVZ05 e MVZ16 (SMITH; PATTON, 1993). As amplificações ocorreram em reações com volume total de 25 µl utilizando 0,3 µl de cada

primer (10 µM), 2,5 µl de solução tampão (buffer), 1 µl de MgCl2, 0,5 µl de dNTP, 3

unidades de Platinum® Taq DNA polimerase (LIFE TECHNOLOGIES CORP.) e 1 µl de DNA da amostra, completando os 25 µl da solução de reação com dH2O. O Cytb foi

amplificado em 39 ciclos com desnaturação a 94°C por 30 s, anelamento a 48°C por 45 s e extensão a 72°C por 45 s. A desnaturação inicial ocorreu a 94°C por 5 min e a extensão final ocorreu a 72°C por 5 min.

Com relação ao gênero de marsupial Marmosops, o Cytb foi amplificado através dos

primers externos CYTB-F1-Didelphidae (GIARLA; VOSS; JANSA, 2010) e CYTB-R1-

Didelphidae (VOSS et al., 2013) e, eventualmente, em dois fragmentos com os primers internos CYTB-400F-Marmosops (VOSS et al., 2013) e CYTB-670R-Marmosops (VOSS et

al., 2013). A solução de reação foi a mesma relatada para os gêneros Akodon e Brucepattersonius. O gene foi amplificado em touchdown, com desnaturação a 95°C por 15 s,

extensão a 72ºC por 2 min (quando utilizados os primers externos) ou 1 min (quando amplificado em dois fragmentos) e anelamento a 61, 59 e 56°C por 15 s correspondendo a 5, 5 e 25 ciclos respectivamente. A desnaturação inicial ocorreu a 95°C por 2 min e a extensão final a 72°C por 7 min.

Os produtos de PCR foram purificados e sequenciados por Beckman Coulter Genomics Services (Danvers, Massachusetts). A purificação ocorreu através da tecnologia SPRI (BECKMAN COULTER INC.) e o sequenciamento pelo sistema Sanger, sendo realizado em ambas as direções pelo sequenciador com 96 capilares ABI PRISM 3730xl utilizando os primers de amplificação e BigDye Terminator 3.1 (LIFE TECHNOLOGIES CORP.). Apenas os produtos do gênero Phyllomys foram purificados e sequenciados separadamente, sendo realizados junto ao Laboratório de Mastozoologia e Biogeografia da Universidade do Espírito Santo, com os procedimentos descritos em Loss e Leite (2011).

2.2.2.2 Edição e análise das sequências

As sequências geradas foram montadas e editadas no software Geneious® 6.1.4 (BIOMATTERS LTD.), onde também, foram elaborados os alinhamentos através do algoritmo MUSCLE (EDGAR, 2004) implementado no Geneious. Os alinhamentos foram analisados através de métodos de máxima verossimilhança (i. e. maximum likelihood – ML) e/ou inferência bayesiana (i. e. bayesian inference – BI), executados nos softwares RaxML 7.0.3 (STAMATAKIS, 2006) e MrBayes 3.2.0 (RONQUIST et al., 2012), respectivamente. Os modelos evolutivos para as matrizes foram gerados no software jModelTest 2.1.2 (DARRIBA et al., 2012; GUINDON; GASCUEL, 2003). Para avaliar os parâmetros posteriores e os outputs fornecidos pela análise de BI utilizou-se o software Tracer 1.5 (RAMBAUT; DRUMMOND, 2007). As árvores geradas foram editadas no software FigTree

1.4.0 (RAMBAUT, 2012). Especificações das análises desenvolvidas, para os diferentes táxons, estão apresentadas junto destes nos resultados e nas legendas das topologias.