A confirmação da presença de óleo essencial de L. sidoides nas nanocápsulas foi feita através de análises de RMN. O espectro de RMN 1H (600 MHz, CDClγ) do timol (FIGURA βζ) e do óleo (FIGURA βη) exibiu sinais em d 7,11, 6,78 e 6,61, associados ao anel benzênico trissubstituído, e sinais em d γ,ββ, β,γ1 e 1,β8 relacionados aos hidrogênios
89
alifáticos (FIGURAS βζ e βη). Além disso, o espectro do óleo essencial apresentou sinais menos intensos correspondentes aos constituintes terpênicos minoritários. O espectro do polímero PCL (600 MHz, CDClγ) consistiu de dois tripletos em d ζ,0ζ e β,β8, referentes a hidrogênios de éster, e sinais em d 1,61 e 1,γ6, pertencentes a hidrogênios alquílicos (FIGURA βζ). O espectro do tensoativo Kolliphor (600 MHz, DβO) apresentou sinais na região de d γ,6η-γ,γβ de hidrogênios de carbonos oxigenados e um singleto em d 0,9β de hidrogênios metílicos (FIGURA βζ). No espectro das nanocápsulas do óleo essencial (600 MHz, CDClγ) foram observados todos esses sinais, evidenciando o encapsulamento (FIGURA β6).
90
Fonte: elaborado pelo autor.
Figura βη – Espectro RMN do timol comercial (99%).
91
Figura β6 – Espectro RMN do (a) conjunto PCL (10 mg) + Kolliphor P188 (β mg) +OELS (βmg) e da (b) suspensão de nanocápsulas contendo OELS.
Fonte: elaborado pelo autor.
5.5 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
A morfologia externa e o tamanho médio das nanocápsulas de OELS, contidas na formulação FRTβ, foram analisados através da técnica de MEV e obtidas imagens com aumentos de 1.000 à β0.000 vezes.
As fotomicrografias obtidas das nanocápsulas em suspensão concentrada (Figura β7), bem como das nanocápsulas recuperadas por ultracentrifugação (FIGURA β8), revelam formas esféricas, ausência de fissuras, indicando a formação de um filme contínuo na parede externa das cápsulas. As micrografias da população de nanocápsulas em suspensão concentrada apresentaram partículas com diâmetros médios acima de 1 µm. Imagens com menores aumentos revelaram pontos de aglomeração, com tamanhos acima de 10 µm. Esse processo pode ocorrer pela deposição de nanocápsulas no momento do preparo da amostra,
9β
visto que o gotejamento subsequente da suspensão concentrada, ainda que diluída, pode promover formação de aglomerados.
Figura β7 – Fotomicrografia das nanocápsulas em suspensão concentrada por MEV (Formulação FRTβ).
Fonte: elaborado pelo autor.
A formação de aglomerados é frequentemente presenciada em imagens obtidas por MEV e microscopia eletrônica de transmissão (MET) em dispersões de nanocápsulas, quando o tensoativo ainda está presente na amostra (HABIB et al., β01β; SURASSMO et al., β010; CHOI et al., β009). Isso mostra que o tensoativo possivelmente, seja um fator relevante para que ocorra a aglomeração das nanocápsulas durante o gotejamento da suspensão concentrada, intensificando a formação de partículas em dimensões micro (10-6).
9γ
Figura β8 – Fotomicrografia das nanocápsulas recuperadas por ultracentrifugação por MEV (Formulação FRTβ).
Fonte: elaborado pelo autor.
No preparo das amostras de nanocápsulas recuperadas, a concentração de tensoativo foi reduzida a ponto de não exercer o efeito de aglomeração das partículas, tal como observado anteriormente na amostra de suspensão concentrada. A lavagem da suspensão concentrada seguida do processo de separação por ultracentrifugação permitiu a visualização de cápsulas esféricas bem definidas em escala nano, representadas na Figura β8. Foram observadas partículas com diâmetros abaixo de η00 nm, assim como registrado nas análises realizadas pela técnica de espalhamento dinâmico de luz. Nessa metodologia, também foi possível a redução de aglomeração devido a menor frequência de gotejamento para análise e ausência do processo de liofilização empregado em algumas metodologias de recuperação de nanocápsulas (YOUM et al., β011).
9ζ
5.6 Análises Térmicas
Para verificar a estabilidade térmica das nanocápsulas poliméricas formadas foram realizadas análises através das técnicas de Termogravimetria (TGA) e Calorimetria diferencial de varredura (DSC).
5.6.1. Termogravimetria (TGA)
A Tabela 19 indica as temperaturas em que ocorreram 10, η0 e 90 % de perda da massa total. Uma redução da massa total dos componentes Kolliphor P 188, PCL e óleo essencial, ocorreu em temperaturas de, aproximadamente, ζ00, ζη0 e β10 ºC, respectivamente. Observa-se que maior energia foi requerida para provocar a degradação química do polímero de revestimento, assim como previsto. O PCL, formador da parede polimérica, tem a função de isolar e proteger o núcleo contendo o óleo volátil, que exigiu energia inferior de degradação, cerca de ζ7 % menor. O Kolliphor P 188®, também apresentou perda de massa total em temperatura inferior ao do PCL. No entanto, foi possível observar que seu processo de degradação foi mais lento. As temperaturas necessárias para perda de 10 a η0 % e de η0 a 90 % da sua massa total foram de 7β ºC e ζγ ºC, respectivamente, demonstrando boa estabilidade.
Tabela 16 – Temperaturas de degradação dos componentes Kolliphor P 188®, PCL e óleo essencial de Lippia sidoides (OELS).
Componente T0.1a (ºC) T0.ηb (ºC) T0.9c (ºC) ΔT0.9d (ºC)
Kolliphor P188® β70 γζβ γ8η 18η
PCL γ71 ζ0ζ ζγ0 βγ0
OELS 1β7 176 β00 -
a Temperatura em que ocorreu 10 % de perda de massa total; b Temperatura em que ocorreu η0 %; c Temperatura
em que ocorreu 90 % de perda da massa total; d Diferença de temperatura em que ocorreu 90% de perda da
massa total entre o PCL e o OELS e o Kolliphor P188® e o OELS. Fonte: elaborado pelo autor.
Os perfis da primeira derivada da curva de TGA (DTG) fornecem informações mais detalhadas sobre o comportamento da troca de massa ocorrida durante o processo de oxidação. As curvas termogravimétricas para cada componente da suspensão de nanocápsulas estão apresentadas nas Figuras β9, γ0 e γ1. Curvas nas cores azuis representam os perfis de
9η
TGA em percentual de perda de massa, enquanto as linhas vermelhas correspondem à primeira derivada da curva de TGA.
Foi possível observar que as perdas de massa ocorreram em um único estágio para todas as amostras analisadas, conforme as curvas vermelhas indicadas (FIGURA β9, γ0 e γ1). A taxa de perda máxima dos componentes Kolliphor P188®, PCL e OELS ocorreu em torno de -10, -β1 e -1η% por minuto, respectivamente, com faixa de temperatura variando entre ζ00 e β00 ºC. O PCL e o Koliphor P 188® apresentaram temperatura da taxa de perda aproximadas, com diferença de β8,ζ ºC. Portanto a magnitude do efeito protetor conferido pelo PCL possivelmente não será afetada na formação das nanocápsulas. Enquanto que a presença de agente tensoativo Kolliphor P 188® poderá fornecer melhor estabilidade físico- química para as nanocápsulas contendo OELS.
Figura β9 – Curva de TGA do tensoativo Kolliphor P188®.
96
Figura γ0 – Curva de TGA do polímero de revestimento PCL.
Fonte: elaborado pelo autor.
Figura γ1 – Curva de TGA do óleo essencial de L. sidoides.
Fonte: elaborado pelo autor.
5.6.2 Calorimetria diferencial de varredura (DSC)
Análise com taxa de aquecimento 10ºC.min-1 foi realizada na suspensão de nanocápsulas liofilizada, bem como em cada componente da formulação. O termograma das
97
nanocápsulas gerada apresentou uma transição endotérmica de fusão na temperatura de ηβ,8γ ºC conforme Figura γβ. Nesse evento foi possível observar uma discreta sobreposição de picos, sugerindo a formação de um segundo evento térmico. Altas razões de aquecimento tendem a alargar a forma do pico (BERNAL et al., β00β) e, dessa forma, análises utilizando menor taxa de aquecimento (η ºC.min-1) foram realizadas a fim de observar a máxima de eventos térmicos das amostras (FIGURA γβ).
Figura γβ – Termogramas de DSC da suspensão de nanocápsulas liofilizada (NC) com taxas de aquecimento de 10 ºC.min-1 e ηºC.min-1.
Fonte: elaborado pelo autor.
Nas análises de DSC com razão de aquecimento de η ºC.min-1, pôde-se observar que houve um discreto deslocamento nas temperaturas de fusão com relação ao termograma gerado ao aplicar razão de 10 ºC.min-1. Foi observado também que em menor razão de aquecimento, mais agudo e menos intenso foram os picos gerados. Com isso, foi possível detectar a separação de picos sobrepostos no termograma obtido da suspensão de nanocápsulas liofilizada, indicando dois picos de fusão nas temperaturas de η1 ºC e η8 ºC, aproximadamente. A separação dos picos evidencia que, possivelmente, não houve interação entre o agente tensoativo e o polímero de revestimento da formulação.
Os termogramas da suspensão de nanocápsulas liofilizada e de cada componente da formulação representadas na Figura γγ mostram que, no ciclo de aquecimento com η
98
ºC.min-1 os eventos térmicos foram predominantemente de primeira ordem, com variações de entalpia do tipo endotérmica entre as temperaturas de γ0 ºC e 80 ºC.
Figura γγ – Termogramas de DSC da suspensão de nanocápsulas liofilizada (NC), o Kolliphor P188® (KOL), o óleo essencial de L. sidoides (OELS) e o policarpolactona (PCL) com taxa de aquecimento ηºC.min-1.
Fonte: elaborada pelo autor.
Conforme a Tabela β0, o PCL e o Kolliphor P188®, exibiram variações de entalpia endotérmicas de fusão, nas temperaturas de η8,β ºC e 1β8,ζ ºC, respectivamente.
Tabela β0 – Eventos térmicos do DSC para a suspensão de nanocápsulas liofilizada e de cada componente da formulação com taxa de aquecimento de ηºC.min-1.
Amostras
Taxa de aquecimento ηºC.min-1 Temperatura endotérmica (ºC) Entalpia endotérmica (J.g-1) Temperatura exotérmica (ºC) Entalpia exotérmica (J.g-1) Kolliphor P188® ηβ,β1 1β8,ζ 1ηγ,70 β7,7η PCL 60,87 η8,1η βηβ,ζζ β6,97 OELS γ1,71 βζ8,1β γγ,8ζ β76,ζ - - NC liofilizadas η1,1η 119,γ0 β1ζ,γζ β0,ζ7
99
Foi observado ainda, a presença de picos exotérmicos nos termogramas do Kolliphor P188® e do PCL nas temperaturas de 1ηγ,70 ºC e βηβ,ζζ ºC, correspondente à uma possível reação de decomposição destes materiais (TABELA β0).
O óleo essencial apresentou pico endotérmico em temperatura (γ0 ºC) diferente do ponto de fusão do timol 99 % (Sigma-Aldrich) obtido experimentalmente (Figura γζ), que foi de 6β ºC, aproximadamente. O abaixamento da temperatura de fusão se deveu a influência dos outros constituintes da mistura oleosa.
Figura γζ – Termograma de DSC do timol comercial 99 %.
Fonte: elaborada pelo autor.
Os pontos de fusões de cada componente da formulação se mantiveram reunidos numa faixa próxima de temperaturas (ηβ-61 ºC), indicando que as nanocápsulas em suspensão se mantiveram termicamente estáveis, pois apresentaram picos de transição térmica de fusão dentro da faixa observada para cada componente, não sofrendo variação de temperatura. Além disso, um evento exotérmico foi observado na temperatura de ~βζ1 ºC, indicando elevada estabilidade de degradação das nanocápsulas liofilizadas.
5.7 Teste de estabilidade acelerada
O teste de estabilidade foi empregado para acelerar possíveis reações entre os componentes da formulação e o surgimento de sinais que foram observados e analisados de acordo com as temperaturas de η, βη e ζ0 ºC, no tempo de armazenamento de 60 dias
100
(ANVISA, β00ζ). Os parâmetros adotados para avaliação durante o período de estudo foram o diâmetro médio e distribuição de partículas, potencial zeta e teor de timol encapsulado. Na Tabela β1 encontram-se os resultados obtidos para as nanoformulações submetidas ao armazenamento em temperaturas de η±β ºC, βη±β ºC e ζ0±β ºC.
Tabela β1 – Diâmetro médio das partículas, índice de dispersibilidade, potencial zeta, teor de timol e classificação macroscópica das formulações armazenadas à temperatura de η, βη e ζ0 ºC.
Temperatura η ºC
Tempo DM A (nm) PdIB C (mV) Teor de timol (%)
βζh 19γ,β±0,9a 0,1γ±0,01ª -ζη,γ±ζ,ηª βζ,ζ9±10,6γª 7dias 19ζ,η±η,9a 0,11±0,0γª -ζ1,7±η,9ª 17,1β±1,γηª 1ηdias 19ζ,β±β,7a 0,1γ±0,01ª -γη,9±β,ηª 18,7ζ±0,68ª γ0dias 19ζ,7±η,7a 0,1γ±0,0γª -γ7,8±β,ζª β0,ηη±1,07ª 60dias 19β,7±β,βa 0,1γ±0,0βª -ζγ,ζ±ζ,βª βη,ηη±β,9βª Temperatura βη ºC
Tempo DMA (nm) PdIB C(mV) Teor de timol (%)
βζh β0η,γ±11,βa 0,16±0,0ζª -ζβ,β±γ,0c 10,β9±11,0βb 7dias β00,1±ζ,6a 0,1η±0,0βª -ζη,η±η,ζc 18,77±0,80a 1ηdias 196,ζ±γ,1a 0,1ζ±0,0βª -β9,γ±6,7b 18.ζγ±0,ζ9a γ0dias 197,1±1,8a 0,1γ±0,00a -17,β±0,8ª 19,β9±1,97a 60dias 19γ,8±0,7a 0,11±0,01ª -β1,γ±6,γªb β6,8γ±β,19a Temperatura ζ0 ºC
Tempo DMA (nm) PdIB C (mV) Teor de timol (%)
βζh 19ζ,β8±7,γa 0,1γ±0,0βª -ζβ,6±ζ,1ª 8,1η±1β,η1ª
7dias 190,β0±η,ζa 0,1β±0,0βª -γ1,9±11,9ª 16,79±0,ζ0ª 1ηdias 191,βη±ζ,γa 0,1ζ±0,0βª -6,8±9,βc 18,69±1,γβª γ0dias 190,ζη±7,9a 0,11±0,0γª 0,9±11,1b β1,γ6±1,17ª 60dias 188,8γ±η,γa 0,11±0,0βª -γ,η±β0,9bc γ9,9η±1,06b
A Diâmetro Médio; B Índice de disperasibilidade; C Potencial zeta e D Classificação Macroscópica. a-cMédias com
sobrescritos diferentes dentro de mesma coluna são significativamente diferentes (P <0,0η). Fonte: elaborada pelo autor.
101
5.7.1 Diâmetro médio e distribuição das partículas
A análise do tamanho de partícula pode indicar a tendência à agregação e sedimentação das nanocápsulas dispersas em função do tempo, podendo ser monitorado pela determinação de mudanças na distribuição de tamanho de partículas, demonstrando ser uma ferramenta importante na avaliação da estabilidade de sistemas coloidais (BOUCHEMAL et al., β006).
Os resultados de diâmetro médio das partículas em suspensão concentrada não apresentaram diferença significativa em todas as temperaturas estudadas durante os 60 dias de armazenamento (TABELA β1). O tamanho médio das partículas sob as diferentes condições de temperatura foi de 19η,6±η,6 nm, com baixo desvio padrão entre as amostras analisadas, embora uma diferença significativa no tamanho tenha sido avaliada entre as temperaturas de η ºC e βη ºC nas primeiras βζ horas, após o preparo das formulações. (FIGURA γη).
Figura γη – Diâmetro médio de partículas em suspensão concentrada de nanocápsulas sob diferentes condições de armazenagem durante teste de estabilidade de 60 dias.
Fonte: elaborada pelo autor.
Os aspectos macroscópicos das formulações também permaneceram estáveis, não tendo sido observado sinais de instabilidade como mudança de cor decorrente de reações entre os componentes, separação de fases ou sedimentação, classificada como macroscopicamente normal.
10β
As suspensões concentradas de nanocápsulas apresentaram baixos índices de dispersibilidade, com valores compreendidos entre 0,1 e 0,β, em todas as condições de temperatura. A distribuição de partículas obtidas para os sistemas foi do tipo monomodal, representando suspensões estáveis e baixo efeito do fator temperatura na análise desse parâmetro (FIGURA γ6).
Figura γ6 – Índice de dispersibilidade em suspensão concentrada de nanocápsulas sob diferentes condições de armazenagem durante teste de estabilidade de 60 dias.
Fonte: elaborada pelo autor. 5.7.2 Potencial zeta
O potencial zeta é uma medida da magnitude da repulsão ou da atração eletrostática das cargas entre partículas, sendo um dos parâmetros fundamentais que afetam a estabilidade. Sua medição permite avaliar sobre as causas da dispersão, agregação ou floculação, podendo ser aplicada para melhorar a formulação de dispersões, emulsões e suspensões (MALVERN, β01ζ).
No tempo de βζ horas de análise, todas as formulações exibiram um elevado potencial zeta. As nanocápsulas em suspensão concentrada se apresentaram carregadas negativamente com valor de potencial zeta dentro da faixa que representa uma boa estabilidade das suspensões (-ζ1 a -η0) conforme Figura γ7. Nesta faixa, prevalece a força
10γ
eletrostática de repulsão que supera a tendência natural aos processos de agregação e precipitação (SCHRAMM et al., β00η).
Durante sete dias, os valores permaneceram em faixa estável. Porém, a partir do 1ηº dia foi observada alteração significativa de potencial zeta nas formulações armazenadas a temperaturas mais elevadas (βη e ζ0 ºC). Na temperatura de βη ºC, as amostras sofreram redução de estabilidade, passando de um potencial zeta de -ζη,η para -β1,γ, contudo os aspectos macroscópicos não demonstraram sinais de modificação.
As formulações acondicionadas em temperatura de ζ0 ºC obtiveram potenciais bastante modificados, chegando à um valor médio próximo do ponto isoelétrico (0,9±11,1). No ponto isoelétrico as partículas em dispersão encontram-se com cargas negativas e positivas igualmente distribuídas, com tendência à formação de agregados, exercida pela força de atração promovida entre cargas opostas. Contudo, não demonstrou efeito sobre o aspecto visual, tido como normal durante os 60 dias de observação.
Figura γ7 – Potencial zeta em suspensão concentrada de nanocápsulas sob diferentes condições de armazenagem durante teste de estabilidade de 60 dias.
Fonte: elaborada pelo autor. 5.7.3 Teor de Timol
O teor de timol se manteve estável durante 60 dias de armazenamento nas formulações submetidas à temperatura de η ºC, não apresentando diferenças significativas
10ζ
(TABELA β1). Enquanto que nas temperaturas mais elevadas (βη e ζ0 ºC) os teores sofreram variações significativas, observando-se efeito crescente do teor de timol ao longo dos 60 dias de acondicionamento. Essa tendência também foi observada nas formulações armazenadas à ηºC embora não tenha apresentado diferença estatística (FIGURA γ8).
Em temperaturas mais elevadas o timol livre, ou seja, não encapsulado, tende a diminuir mais abruptamente, gerando o resultado inusitado do aumento do seu teor. Isso porque o teor de timol foi determinado a partir da diferença entre o total de óleo essencial utilizado na formulação e a quantidade de óleo livre extraído através da partição com hexano.
É possível também que haja, durante esse período, a degradação do PCL. Polímeros poliésteres alifáticos podem ter sua cinética de degradação in vitro afetada por fatores como: método de preparação do sistema de liberação; propriedades do polímero utilizado como sua massa molar inicial e por parâmetros físico-químicos que incluem temperatura, pH, força iônica e exposição à radiação gama (LEMOINE et al., 1996).
Nanocápsulas de PCL são afetadas pela degradação polimérica entre 10 a 1η semanas, dependendo da presença e tipo de tensoativo (LAMPRECHT et al., β00β). Nesse caso, a liberação do óleo volátil ocorre por degradação da parede polimérica e, como consequência, o aumento da concentração de timol livre na suspensão de nanocápsulas com o tempo de acondicionamento poderia ser observado. Assim, o teor de timol núcleo encapsulado seria menor com o tempo, o que não foi observado.
Figura γ8 – Teor de timol em suspensão concentrada de nanocápsulas sob diferentes condições de armazenagem durante teste de estabilidade de 60 dias.
10η
6. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS
Nanocápsulas foram produzidas a partir de emulsões O/A do óleo essencial de L. sidoides (~77 % de timol) através do método emulsão-difusão, apresentando sistemas estáveis utilizando o tensoativo Kolliphor P 188®, com eficiência de ~η0 %. O tamanho das nanopartículas, bem como a eficiência de encapsulação foram significativamente influenciados pela variação da concentração do polímero e da velocidade de agitação no processo de emulsificação. A otimização do processo, obtida através da estimativa do efeito padronizado da velocidade e tempo de agitação no processo de emulsificação, apresentou redução no tempo de processo de 10 para η minutos. As partículas mostraram uma estrutura morfológica esférica, com ausência de fissuras e tamanho de partículas abaixo de η00 nm, assim como registrado nas análises realizadas pela técnica de espalhamento dinâmico de luz. As análises térmicas evidenciaram alta estabilidade térmica (~β1ζ ºC) da suspensão de nanocápsulas liofilizadas. Durante o teste de estabilidade as nanopartículas permaneceram com tamanhos e distribuições estáveis durante 60 dias de armazenamento, em todas as temperaturas estudadas. Porém, uma variação no potencial zeta foi observada com 1η dias de armazenamento nas temperaturas de βη e ζ0 ºC, tornando-as mais suceptíveis à sinais de instabilidade que, no entanto, não foram observados macroscopicamente. O teor de timol presente se manteve inalterado em temperatura de η ºC, mostrando-se como temperatura ótima para armazenamento da nanoformualção. Dessa forma, a nanoencapsulação do óleo essencial de L. sidoides se mostra uma opção promissora para produção em escala de sistemas estáveis para potenciais aplicações antimicrobiana.
Espera-se que o estudo de preparação de nanocápsulas do óleo essencial de L. sidoides resulte na produção de nanoformulações dotadas de propriedades físico-químicas, capazes de potencializar a ação biológica do óleo essencial, devido à maior solubilidade em meio aquoso, à estabilidade contra agentes fisicos e químicos, à possibilidade de liberação controlada e maior poder de penetração em seu alvo-biológico. Para isso, estudos complementares posteriores podem ser realizados a fim de reforçar estas hipóteses, tais como: análise de cor e pH como parâmetros de medida de estabilidade, combinação de tensoativos através de estudos do EHL, comportamento reológico, cinética de liberação controlada e testes in vitro e in vivo para estudo da concentração tóxica antimicrobiana.
106
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