Yukarıda açıklanan yöntem ile hazırlanan kan örnekleri Şekil 4.10’daki Nano Magnetics İnstruments AFM PLUS + ile Namık Kemal Üniversitesi Merkezi Laboratuarında (NABİLTEM) görüntülenmiştir. Bu AFM cihazı, XY Tarayıcı: Motorize 50 mm hareket, 50 nm çözünürlük, Z-tarayıcı: Motorize 50 mm hareket, 250 nm çözünürlük özelliklerine sahiptir. Optik mikroskobun görüş alanı 1.25 mm -0.25 mm’dir. Temaslı mod ve vurma modu bulunmaktadır.
Optik kamera açıldı. Cantileverin görüntüsünü Şekil 4.11’deki gibi ekranda görüldü. Çift taraflı bandın üstüne hazırlanan örnek tam ortaya gelecek şekilde yapıştırıldı. Kan hücresi örneği AFM kafasına konuldu. Sallanma payını belirlemek için genlik değeri verildi. Centilever’in iyi olup olmadığına bakmak için tanımlandı.
36
Şekil 4.10. Kırmızı kan hücrelerinin görüntülenmesi için kullanılan AFM.
37
Şekil 4.12. Bütün olarak AFM’nin şematik gösterimi (Prezi.com.atomik kuvvet mikroskopu)
Monitörden bakarak z yönünde hareket ettirerek yüksekliği, x ve y yönlerinde hareket ettirerek cismin konum ayarlaması yapıldı. Bu işlem yapılırken iğne ucu örneğe denk getirmek için önce kaba ayarda sonra ince ayarda ayarlama yapıldı. Yüzeye çarpmaması için yüzeye yaklaşılınca ince ayara geçildi Yükseklik değeri (Amplitude) 2,4V değerinden düşmeye başladı. Yaklaşınca slow moduna geçildi ve değer 1,2V gösterdiğinde yüzeyde olduğunu gösterir. Bu işlem otomatik olarak da yapılmaktadır ama işlem süresi uzundur. Ne kadar alan taranacak, hızı belirlendi ve tarama süresi yaklaşık 20 dakika sürdü.
Örnek konulduktan sonra AFM’de meydana gelenleri sıralayacak olursak (Şekil 4.12); ışık cantilevere çarptı; sivri uçlu iğne örneğe doğru hareketlendi; ışık cantileverden foto diyota yansıdı. Işık kuvvetlendiricide güçlendirilerek kontrol elemanına gönderilir. Işık kontrol elemanına, kontrol elemanı da bilgiyi bilgisayara ve sensöre aktarır. Sensör meydana gelen sapmayı elektriksel çıktıya çevirir. Böylece elde edilen veriler bilgisayarda görüntülenmiştir. Şekil 4.13’de AFM’den elde edilen kırmızı kan hücresinin görüntüsü görülmektedir.
38
39 4.4. SEM İle Kırmızı Kan Hücresinin İncelenmesi
Kan hücrelerinin görüntüsünün alındığı Şekil 4.14’deki SEM’nin cihazının markası FEİ, cihazın modeli QUANTA FEG 250’dir. Cihazda bulunan detektörler, Everhardt Thornley ETD (ikincil elektron detektörü), STEM Detektörü, EDS Detektörü, Geniş Alan Düşük Vakum ikincil elektron detektörü (LFD), Gaz ikincil elektron detektörü (GSED) Ayrıca sulu örnekler için WETSTEM kiti bulunmaktadır. Şekil 4.15’de SEM cihazında görüntü oluşumu için parametreler görülmektedir. (http:merkezlab.nku.edu.tr/atomik kuvvet mikroskopu).
Şekil 4.14. Kırmızı kan hücrelerinin görüntülenmesi için kullanılan SEM
40
Çift taraflı bandın üstüne yukarıda açıklanan yöntem ile hazırlanan kan örneği sput üzerine yapıştırıldı. SEM cihazının hazne kısmına yerleştirip vakumlandı. Şekil 4.15’de üst kısımda görüldüğü gibi, elektron tabancasının olduğu bölüm sürekli vakumlu halde olduğundan her zaman yeşil renktedir. Bu şekilde ölçüm için gerekli parametrelerin ayarlanması gösterilmektedir. Örneğin iletken olup olmamasına bağlı olarak uygun mod ayarlandı. Esem, high, low şeklindeki üç moddan high mod seçildi. Örneğin elektron demetinin çıktığı yere olan yani elektron kolonuna mesafesi (yaklaşık 10nm) belirlendi. Örneğe bağlı olarak basıncı 90Pa olarak ayarlandı. Spot gönderilen elektron demetinin çapı 1-7 arası bir değer seçildi ve yatay mesafe ayarlandı. Verilen değer düştükçe çözünürlüğü artmaktadır.
Uygun görüntü monitörden taratıldı (Şekil 4.16). Örnek için ideal olan büyüklüğe getirildi. Örneğimiz için büyütme 500x olarak ayarlandı. Farklı büyütmelerde görüntüler alınıp kaydedildi. Kaydedilen görüntüler Şekil 4.17’de verilmiştir.
41
42 5. TARTIŞMA ve SONUÇ
Bu çalışmada, farklı ölçüm sistemleriyle kırmızı kan hücresi ve epitel dokunun görüntüleri elde edildi. Öncelikl, bu tez çalışmasında kırmızı kan hücresinin görüntüsünü elde etmek için interferometre, CCD kamera ve mikroskop kullanılarak BKFM sistemi kurulmuştur. Örneklerin interferogramları elde edilmiştir ve bu görüntülerden faz hesaplamak için Fourier Dönüşümü kullanılmış ve 3D profil oluşturulmuştur.
Sonraki aşamada Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) kullanılarak kan hücresinin görüntüsü alınmıştır. Örnek yüzeyinin topografik görüntüsü, bir uç ve bir örnek yüzeyi arasındaki etkileşimlere dayanarak elde eden tarama mikroskobudur. İletken olmayan örneklerde de kullanılması, normal bir optik mikroskoptan çok daha (1000 kat) iyi çözünürlükte görüntü vermesi, sulu ortamdaki canlı hücreleri görüntüleyebilmesi avantajlarıdır. Hem iletken hem yalıtkan malzemeler, hem sert hem de yumuşak malzemeler mikro ve nano boyutta morfolojileri incelenebilmektedir. Ancak örneğin bir ön hazırlık işlemine tabi tutulması gerekir ve görüntünün alınması yavaştır. Elde edilen görüntünün çözünürlüğünün Z yönünde hassasiyeti düşüktür. AFM ile yapılan ölçümlere bakıldığında, incelenen kırmızı kan hücrelerinin boyut bilgileri BKFM ve SEM ile ulaşılan bilgilerden kısmen farklıdır. Ölçümün gerçekleştirildiği Tekirdağ Namık Kemal Üniversitesi Merkez Laboratuvarı NABİLTEM ile yapılan görüşmelerde AFM’de kalibrasyon ile ilgili bir problem olduğu anlaşılmış ancak bu problem düzeltilememiştir.
Son olarak kırmızı kan hücresi için NABİLTEM’de bulunan SEM ölçüm cihazıyla iki boyutlu görüntü elde edilebilmiştir. Yatay koordinatta hücre genişliği ölçekle verilmiştir Bu kalitatif (göreceli) bir ölçümdür. Kullanılan kan hücresinin yıkanmış olması önemlidir. İncelenebilecek örnek çeşidi oldukça geniştir. Örneklerin yüzey yapılarını incelemede ve element analizinde kullanılır. Elektrik ve manyetik alanların görüntüsü de elde edilebilir. Örneğin ön hazırlığa tabi tutulması şarttır. SEM’de görüntünün elde edilmesi odaklanmış elektron demetinin örnek yüzeyini taramasıyla elde edilir. Ayırım gücü, görüntü, analizleri birleştirme ve odak derinliği özelliklerinden bu tür çalışmalarda sıklıkla kullanılmaktadır. Ancak ölçüm sırasında örneğe temas ederek zarar vermektedir. Şekil 3.17’de SEM ile alınan kan hücresi örneğinin görüntüsü verilmiştir. SEM ile yapılan ölçümler sonunda kırmızı kan hücresi yaklaşık 7 𝜇𝑚 çapındadır. SEM ve BKFM’den elde edilen sonuçları karşılaştırdığımızda ölçüm hassasiyetinin birbirine yakın olduğu görülmüştür. Örnekle temas
43
etmemesi ve sonuçları 3D gösterebilmesi BKFM deney düzeneğinin üstün yönlerini göstermektedir.
Bu çalışmada önerilen BKFM deney düzeneği ile elde edilen görüntülerden Fourier dönüşümü ile faz hesaplanması ve oluşturulan 3D profiller her yönden izlenebilen, her noktada yüksekliği hesaplanabilen kantitatif sonuçlar elde edilmesiyle, tezin amacına ulaşılmıştır. AFM ve SEM görüntüleriyle sonuçlar denetlenmiştir. Bu ölçüm yönteminin biomedikal ve endüstri gibi alanlarda kullanımı bulunmaktadır. Kan hücresi morfolojisinin belirlenmesi, üretimi yapılan ince filmlerin yüzeylerinin analiz edilmesi ve üretiminin kaliteli olması hedeflerinde kullanışlı bir yöntem olarak öne çıkmaktadır.
44 6.KAYNAKLAR
Arkaz H. 2017. Atomik Kuvvet Mikroskobu İle Yüzey Topografi Görüntüsü Oluşturma. Erciyes Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Malzeme Bilimi Ve Mühendisliği Bölümü Malzeme Üretim Ve Karakterizasyon Laboratuvarı Dersi Laboratuvar Uygulamaları Berryman, Fiona, Paul Pynsent, and James Cubillo. 2003. A Theoretical Comparison of Three
Fringe Analysis Methods for Determining the Three-Dimensional Shape of an Object in the Presence of Noise. Optics and Lasers in Engineering, 39(1):35–50
Bhaduri, Basanta et al. 2014. Diffraction Phase Microscopy: Principles and Applications in Materials and Life Sciences. Advances in Optics and Photonics, 6(1):57
Blunt, Roy T. 2006. White Light Interferometry – a Production Worthy Technique for Measuring Surface Roughness on Semiconductor Wafers. CS MANTECH Conference, 44(0):59–62
Chen, Wenjing, Peng Bu, Suzhen Zheng, and Xianyu Su. 2007. Study on Fourier Transforms Profilometry Based on Bi-Color Projecting. Optics & Laser Technology, 39(4):821– 27.
Clementa A.V. Gloystein K. Frangis N. 2008. Principles of Atomic Force Microscopy (AFM), Physics of Advanced Materials Winter School
Dong, Jing-tao and Rong-sheng Lu. 2012. A Five-Point Stencil Based Algorithm Used for Phase Shifting Low-Coherence Interference Microscopy. Optics and Lasers in Engineering, 50(3):502–11.
Endo, Takashi, Yoshiaki Yasuno, and Shuichi Makita. 2005. Profilometry with Line-Field Fourier-Domain Interferometry. Optics Express, 13(3):1800–1802
Goldstein, J., Newbury, D.E., Joy, D.C., Lyman, C.E., Echlin, P., Lifshin, E., Sawyer, L., Michael, J.R. 2003. Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis, Springer.
Gorthi, Sai Siva and Pramod Rastogi. 2010. Fringe Projection Techniques: Whither We Are? Optics and Lasers in Engineering, 48(2):133–40.
Groot, Peter De. 2015. “Principles of Interference Microscopy for the Measurement of Surface Topography. Advances in Optics and Photonics,7(1): 1–65
Kemao, Qian. 2007. Two-Dimensional Windowed Fourier Transform for Fringe PatternAnalysis: Principles, Applications and Implementations.” Optics and Lasers in Engineering 45(2):304–17
Kocahan O. Tiryaki E., Durmuş Ç., Elmas M. N., Coşkun E., Özder S. 2017. Quantitative Phase Imaging of Red Blood Cell by Diffraction Phase Microscopy. Computing and Electromagnetics International Workshop, 8–9:21. İspanya.
Kocahan, Özlem. 2008. İntegral Dönüşümler Kullanılarak Cisimlerı̇n Profı̇llerinı̇n Belı̇rlenmesı̇. Doktora Tezi, Çanakkale Onsekiz Mart Universitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Türkiye.
45
Leonardi, M., A. Rmiie, and J. Lenarcic. n.d. A System for Measurement and Visualisation of Human Back Shape for Estimation of 3D Deformities. Proceedings of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society Region 8 International Conference IEEE:95–97
Leonhardt, K. 2005. Optical Topometry of Surfaces with Locally Changing Materials, Layers and Contaminations Part 2: Fringe Projection Topometry. Journal of Modern Optics, 52(10):1367–84. Retrieved July 1, 2014
Li, Sikun, Xianyu Su, and Wenjing Chen. 2010. Wavelet Ridge Techniques in Optical Fringe Pattern Analysis. Journal of the Optical Society of America A, 27(6):1245–54
Moore D.T. Truax B.E. 1979. Phase-locked moiré fringe analysis for automated contouring of diffuse surfaces. Applied Optics, 18(1):95-96
Nicchiotti, G. 2014. A System for 3D Reconstruction and VRML Conversion for Virtual Museums Applications. IEEE 13th International Conference on Digital Signal Processing, 1:421–24
Palucka T. 2002. Overview of Electron Microscopy.
http://authors.library.caltech.edu/5456/1/hrst.mit.edu/hrs/materials/public/ElectronMi
croscope/EM_HistOverview.htm (01.04.2018)
Pham, Hoa et al. 2011. Off-Axis Quantitative Phase Imaging Processing Using CUDA: Toward Real-Time Applications. Biomedical Optics Express, 2(7):1781
Pham, Hoa V, Christopher Edwards, Lynford L. Goddard, and Gabriel Popescu. 2013. Fast Phase Reconstruction in White Light Diffraction Phase Microscopy. Applied Optics, 52(1):A97-101
Quan, C., C. Tay, and H. Shang. 1999. Fringe Projection Technique for the 3-D Shape Measurement of a Hydroformed Shell. Journal of Materials Processing Technology, 89–90:88–91.
Quan, C., X. Y. He, C. F. Wang, C. J. Tay, and H. M. Shang. 2001. Shape Measurement of Small Objects Using LCD Fringe Projection with Phase Shifting. Optics Communications, 189(1–3):21–29. Retrieved July 11, 2014
Reolon, D., M. Jacquot, I. Verrier, G. Brun, and C. Veillas. 2006. Broadband Supercontinuum Interferometer for High-Resolution Profilometry. Optics Express 14(1):128–37 Sharma M.K., Gaur C. Senthilkumaran P. Khare K.2015. Imaging Using Spiral-Phase
Diversity. Applied Optics ,54(13):3979-3985
Shi, Hongjian, Hongwei Ji, Guobiao Yang, and Xiaoyuan He. 2013. Shape and Deformation Measurement System by Combining Fringe Projection and Digital Image Correlation. Optics and Lasers in Engineering, 51(1):47–53.
Singh, H. and J. S. Sirkis. 1994. Direct Extraction of Phase Gradients from Fourier-Transform and Phase-Step Fringe Patterns. Applied Optics, 33(22):5016–20.
Skydan, Oleksandr a., Michael J. Lalor, and David R. Burton. 2005. Using Coloured Structured Light in 3-D Surface Measurement. Optics and Lasers in Engineering, 43(7):801–14.
46
Su, Xianyu and Wenjing Chen. 2001. Fourier Transform Profilometry. Optics and Lasers in Engineering, 35(5):263–84.
Su, Xianyu and Wenjing Chen. 2001. Fourier Transform Profilometry:: a review. Optics and Lasers in Engineering, 35(5):263.
Şahin R. 2009. Çoklu Frekanslı Atomik Kuvvet Mikroskobu Ve Uygulamaları. Y.Lisans Tezi, İstanbul Teknik Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Türkiye.
Takeda, M. and K. Mutoh. 1983. Fourier Transform Profilometry for the Automatic Measurement of 3-D Object Shapes. Applied Optics, 22(24):3977
Thian, S. C. H. et al. 2007. Dimensional Measurement of 3D Microstruture Based on White Light Interferometer. Journal of Physics: Conference Series, 48:1435–46.
Thomas L. Ivan S.J. et al. 2015. Phase-Sharing Using a Mach – Zehnder Interferometer. Applied Optics, 54(4):699.
University of Cambridge (2018). www.doitpoms.ac.uk (06.05.2018)
Vanherzeele, J., Patrick Guillaume, and Steve Vanlanduit. 2005. Fourier Fringe Processing Using a Regressive Fourier-Transform Technique. Optics and Lasers in Engineering, 43(6):645–58.
Wilson R. A. and. Bullen H.A. 2006. Atomic Force Microscopy (AFM). Department of Chemistry, Northern Kentucky University
Xia, Shuman, Zhipeng Pan, and Jingwen Zhang. 2014. Optical Microscope for Three- Dimensional Surface Displacement and Shape Measurements at the Microscale. Optics Letters, 39(14):4267
Xue, Liang, Jiancheng Lai, Shouyu Wang, and Zhenhua Li. 2011. “Single-Shot Slightly-off- Axis Interferometry Based Hilbert Phase Microscopy of Red Blood Cells. Biomedical Optics Express, 2(4):987
Yaqoob, Zahid et al. 2011. Single-Shot Full-Field Reflection Phase Microscopy. Optics Express, 19(8):7587–95.
Zhou W. Wang, Z. L. 2007. Scanning Microscopy for Nanotechnology, Springer.
Zwemer, D. a., G. Petriccione, and R. Curry. 2006. Thermally-Induced Warpage Measurement on Small Packages by a Microscopic Fringe Projection System. Thermal and Thermomechanical Proceedings 10th Intersociety Conference on Phenomena in Electronics Systems, 953:60
47 ÖZGEÇMİŞ
Esra ERTÜRK 23.03.1977 yılında Aydın’da doğdu. İlkokulu Aydın Zafer İlkokulunda, ortaokulu Gazi paşa Ortaokulunda ve liseyi Denizli Lisesinde tamamlamıştır. 1995 yılında Uludağ Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Fizik bölümünde lisans eğitimine başlamıştır. Tekirdağ Namık Kemal Üniversitesi Fen-Bilimleri Enstitüsü Fizik Anabilim dalında Yüksek Lisans öğrenimini tamamlamıştır.