Fitoterápico é todo medicamento obtido empregando-se exclusivamente matérias-primas ativas vegetais. É caracterizado pelo conhecimento da eficácia e dos riscos de seu uso, assim como pela reprodutibilidade e constância de sua qualidade. Sua eficácia e segurança é validada através de levantamentos etnofarmacológicos de utilização, documentações tecnocientíficas em publicações ou ensaios clínicos fase 3. Não se considera medicamento fitoterápico aquele que, na sua composição, inclua substâncias ativas isoladas, de qualquer origem, nem as associações destas com extratos vegetais (BRASIL, 2004).
Como produto final de uma série de sugestões apresentadas por diferentes segmentos da sociedade, foi estabelecido uma legislação para a área de fitoterápicos (Portaria 6/SVS de 31/01/1995), que definiu claramente que fitoterápico é um medicamento com componentes ativos exclusivamente de origem vegetal, e que deve apresentar comprovação de eficácia, segurança e qualidade. Também importante foi o estabelecimento no Ministério da Saúde, e posteriormente na Agencia Nacional de Vigilância Sanitária-ANVISA, de uma divisão direcionada especificamente para fitoterápicos (SIMÕES & SCHENKEL, 2002).
A Resolução-RDC nº 48 de 16 de Março de 2004 dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos e este regulamento abrange medicamentos cujos princípios ativos são exclusivamente derivados de drogas vegetais. Não é objeto de registro ou cadastro planta medicinal ou suas partes, após processos de coleta, estabilização e secagem, podendo ser íntegra, rasurada, triturada ou pulverizada (BRASIL, 2004). No entanto a RDC 48/2004 foi revogada pela RDC 14 de 31 de Março de 2010, com o objetivo de atualizar o regulamento para o registro de medicamentos fitoterápicos. As principais modificações foram relativas a conceitos e a adoção de alternativas ao controle de qualidade. O documento traz uma reforma da RDC 48 de 2004, com o enquadramento correto para cada exigência nas diferentes fases de análise de registro de um medicamento fitoterápico (BRASIL, 2010).
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É exigência da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), Resolução (RDC nº 48), a elaboração de um relatório de controle de qualidade, incluindo análises qualitativas e quantitativas dos princípios ativos e/ou marcadores, quando conhecidos, ou classes de compostos químicos característicos da espécie (LIMA et al., 2006).
A validação é parte integrante da garantia da qualidade e se define como um ato documentado que atesta se qualquer procedimento, processo, equipamento, material, operação ou sistema realmente conduz aos resultados esperados. Portanto, a validação de procedimentos analíticos tem por objetivo demonstrar que os métodos de ensaio utilizados apresentam resultados que permitam avaliar objetivamente a qualidade dos medicamentos, conforme os parâmetros especificados (BRASIL, 2003).
Segundo a Resolução-RE nº 899, de 29 de Maio de 2003, a validação deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados. Para tanto, deve apresentar especificidade e seletividade, linearidade, intervalo, precisão, limite de detecção, limite de quantificação e exatidão adequadas à análise (RE 899, 2003).
Ainda de acordo com a RESOLUÇÃO nº 899/2003, ela define estes parâmetros analíticos da seguinte forma:
9.1.1 Especificidade e seletividade:
É a capacidade que o método possui de medir exatamente um composto em
presença de outros componentes tais como impurezas, produtos de degradação e componentes da matriz.
A avaliação da seletividade do método é um importante modo para demonstrar a sua especificidade. Um método é dito específico se produz apenas uma resposta para um simples analito. Seletividade de um método é a capacidade do método de produzir respostas para um analito alvo distinguindo-o de todas as outras respostas uma vez que os métodos cromatográficos não produzem respostas apenas para um analito de interesse, mas também para outras substâncias de interesse, o termo seletividade é sempre mais apropriado neste contexto que especificidade (NASCIMENTO, 2004).
______________________________________________________________________ 9.1.2 Linearidade:
É a capacidade de uma metodologia analítica demonstrar que os resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo especificado. Recomenda-se que a linearidade seja determinada pela análise de no mínimo 5 concentrações diferentes.
Os dados podem ser tratados por regressão linear pelo método dos mínimos quadrados dos pontos médios de 3 (três) curvas de calibração autênticas (LIMA, 2006).
O critério mínimo aceitável do coeficiente de correlação (r) deve ser = 0,99. A quantificação do composto de interesse em validação pode ser obtida por meio dos seguintes métodos: padronização externa, padronização interna, superposição de matriz, adição-padrão (MOREAU, 2008).
O método de padronização externa compara a área da substância a ser quantificada na amostra com as áreas obtidas com soluções de concentração conhecidas preparadas a partir de um padrão. Esse método é sensível a erros de preparo das amostras e dos padrões e de injeção das soluções padrão e das amostras e por isso deve ser feito a cada análise (MOREAU, 2008).
O método de padronização interna consiste na preparação das soluções-padrão de concentrações conhecidas da substância de interesse, as quais se adicionam a mesma quantidade conhecida de um composto chamado padrão interno. Após análise dessas soluções, se constrói um gráfico, relacionado à razão de áreas (área da substância/área do padrão interno que tem concentração constante) com a concentração da substância. A amostra também é analisada após a adição da mesma quantidade conhecida do padrão interno (MOREAU, 2008).
O método de superposição de matriz consiste na adição do padrão da substância em diversas concentrações em uma matriz similar a da amostra, isenta da substância, e na construção do gráfico de calibração relacionado às áreas obtidas com as concentrações dos padrões. (MOREAU, 2008).
O método de adição-padrão consiste na adição de quantidades conhecidas da substância de interesse que esta sendo analisada a quantidades conhecidas da amostra, antes do preparo. Constrói-se uma curva analítica relacionado às quantidades da substância adicionada à amostra com as respectivas áreas obtidas.
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O ponto em que a reta corta o eixo das ordenadas corresponde à área do pico da substância que esta sendo determinada, sem nenhuma adição do padrão. A extrapolação da reta define, no eixo das abscissas a concentração da substância na amostra analisada. O método da adição-padrão é trabalhoso, mas é especialmente importante quando a amostra é muito complexa, quando as interações com a matriz são significativas e quando há dificuldade de se encontrar um padrão interno adequado ou uma matriz isenta da substância de interesse (MOREAU, 2008). A Figura 25 exibe um exemplo da aplicação da adição-padrão na determinação da concentração de milonina, warifteína e metilwarifteína no extrato etanólico bruto das folhas de Cissampelos sympodialis por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).
25 50 75 100 125 -1000000 0 1000000 2000000 3000000 Milonina, r2=0,9996 Warifteína, r2=0,9990 Metilwarifteína, r2=0,9989 Á rea ( u n id ad es ar b it rár ias) [µg/mL]
Figura 25: Exemplo da adição-padrão na determinação da concentração de milonina, warifteína e metilwarifteína em amostras de extrato etanólico bruto das folhas de C.
______________________________________________________________________ 9.1.3 Intervalo:
É a faixa entre os limites de quantificação superior e inferior de um método analítico. Normalmente é derivado do estudo de linearidade e depende da aplicação pretendida do método.
9.1.4 Precisão:
É a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma série de medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra. Esta se divide em três níveis:
Repetibilidade (precisão intra-corrida): concordância entre os resultados dentro
de um curto período de tempo com o mesmo analito e mesma instrumentação.
A repetibilidade do método é verificada por no mínimo 9 determinações, ou seja, 3 concentrações: baixa, média e alta, com 3 réplicas cada ou mínimo de 6 determinações a 100% da concentração teste.
Precisão intermediária (precisão inter-corridas): concordância entre os resultados do mesmo laboratório, mas obtidos em dias diferentes, com analistas diferentes e/ou equipamentos diferentes. Recomenda-se um mínimo de 2 dias diferentes com analistas diferentes.
Reprodutibilidade: concordância entre os resultados obtidos em laboratórios diferentes como em estudos colaborativos, geralmente aplicados à padronização de metodologia analítica.
A precisão pode ser expressa como desvio padrão relativo (DPR) ou coeficiente de variação (CV%), segundo a fórmula:
DPR = DP x 100, CMD
em que DP é o desvio padrão e CMD a concentração média determinada. Não se admite valores superiores a 5%.
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