Akut Atakların Tedavisi

Outro parâmetro importante para a ativação das DCs, além das moléculas co- estimuladoras CD80 e CD86 e da molécula CD83, é a citocina IL-12. DCs maduras, principalmente aquelas maturadas com ligantes de TLRs são descritas como produtoras de IL-12. A IL-12 está também relacionada à ativação de linfócitos T CD8+ e como auxiliares na aquisição de atividade citotóxica por essas células. Decidimos, portanto,

analisar se o tratamento das DCs com as partículas exerceria alguma influência nesse parâmetro (figura 10).

Figura 10 - Detecção de IL-12p70 no sobrenadante de DCs no dia sete da cultura.

Células mononucleares separadas por gradiente de Ficoll-Paque foram enriquecidas por aderência em Placa de Petri e cultivadas em meio R-10 na presença de GM-CSF e IL-4 e submetidas às diferentes condições de cultura, especificadas em Material e Métodos. Após a cultura (no dia sete), o sobrenadante dessas células foi coletado e a presença da IL-12p70 quantificada por ELISA. O p obtido no teste t pareado (Sem tratamento x grupo tratato); *p< 0,05; **p< 0,01; ***p< 0,001. A barra indica o erro padrão da média. n= 13.

Conforme apresentado na figura 10, a adição de partículas contendo P2C causou um aumento na secreção de IL-12 pelas DCs.

5.6 Internalização das partículas e localização intracelular dos peptídeos/P2C a elas associados

Para nos certificarmos de que as DCs haviam capturado as partículas contendo peptídeo e/ou P2C, foi utilizada a análise por microscopia confocal. Essa técnica microscópica apresenta a vantagem de se poder visualizar a célula em vários níveis de profundidade, permitindo assim, afirmar com exatidão quando as partículas estavam contidas no interior da célula. Além da internalização das partículas pelas DCs, queríamos saber se os peptídeos e/ou P2C a elas associados eram liberados e, no caso particular dos peptídeos, se iriam para a superfície das células. Para que esses objetivos pudessem ser alcançados, foram usados, associados às partículas “fluorescentes”, peptídeos/P2C também marcados com um corante fluorescente, a rodamina.

Para que essa identificação pudesse ser feita, as DCs (imaturas) receberam no dia cinco da cultura, partículas coradas com fluorocromo, associadas a um peptídeo ou P2C também marcado com fluorocromo. Vinte e quatro horas depois de receber as partículas, as células foram coletadas e preparadas, conforme descrito em Material e métodos. A presença (ou não) das partículas dentro das células, assim como a distribuição dos peptídeos/P2C a elas associados foi checada em microscópio confocal de fluorescência. As figuras 11-14 mostram as partículas internalizadas pelas DCs, assim como a distribuição do peptídeo/P2C a elas associados.

Figura 11 - Internalização das partículas contendo peptídeos e/ou P2C e localização intra-celular do peptídeo a elas associados.

Em (A) partículas marcadas com FITC (em verde) contendo GILG. É possível visualizar também a membrana das células, que foi marcada com anticorpo anti-MHC de classe I (FITC), em verde; em (B) o peptídeo GILG, marcado com rodamina (em vermelho), onde é possível observar sua distribuição dentro da célula; em (C) uma fotomicrografia em microscopia de transmissão das mesmas células mostradas em (A). Em (D) é possível visualizar as imagens em (A e B) sobrepostas. Experimento representativo de trê_{s. Aumento original de 1000x e zoom} eletrônico adicional.

Figura 12 - Internalização das partículas contendo peptídeos e/ou P2C e localização intra-celular do peptídeo a elas associados.

Em (A) partículas marcadas com FITC (em verde) contendo GILG e P2C. É possível visualizar também a membrana da célula, que foi marcada com anticorpo anti-MHC de classe I (FITC), em verde; em (B) o peptídeo GILG, marcado com rodamina (em vermelho), onde é possível observar sua distribuição dentro da célula; em (C) partículas marcadas com Cy5 (em azul) contendo o peptídeo NLVP; em (D) uma fotomicrografia em microscopia de transmissão da mesma célula mostrada em (A). Em (E) é possível visualizar as imagens em (A, B e C) sobrepostas. Experimento representativo de três. Aumento original de 1000x e zoom eletrônico adicional.

Figura 13 - Internalização das partículas contendo peptídeos e/ou P2C e localização intra-celular do peptídeo a elas associados.

Em (A) partículas marcadas com FITC (em verde) contendo GILG. É possível visualizar também a membrana das células, que foi marcada com anticorpo anti-MHC de classe I (FITC), em verde; em (B) o peptídeo GILG, marcado com rodamina (em vermelho), onde é possível observar sua distribuição dentro da célula; em (C) partículas marcadas com Cy5 (em azul) contendo o P2C; em (D) uma fotomicrografia em microscopia de transmissão das mesmas células mostradas em (A). Em (E) é possível visualizar as imagens em (A, B e C) sobrepostas. Experimento representativo de três. Aumento original de 1000x e zoom eletrônico adicional.

Figura 14 - Internalização das partículas contendo P2C e localização intra-celular do mesmo associado às partículas.

Em (A) é possível visualizar a membrana das células, que foi marcada com anticorpo anti-MHC de classe I (FITC), em verde; em (B) o P2C, marcado com rodamina (em vermelho), onde é possível observar sua distribuição dentro da célula; em (C) partículas marcadas com Cy5 (em azul) contendo o P2C; em (D) uma fotomicrografia em microscopia de transmissão das mesmas células mostradas em (A). Em (E) é possível visualizar as imagens em (A, B e C) sobrepostas. Experimento representativo de trê_{s. Aumento original de 1000x e zoom eletrônico adicional.}

Como pode ser observado nas figuras 11-14, houve a internalização das partículas pelas DCs. Vale mencionar que a captura das partículas pelas DCs foi realizada independente do peptídeo/P2C a elas associados. Ainda, quando havia dois conjuntos distintos de partículas na cultura (Figuras 12 e 13), ambos eram capturados pelas DCs. Em suma, do ponto de vista da internalização das partículas, não pareceu ter havido nenhuma seleção pelas DCs de partículas contendo um ou outro peptídeo ou P2C.

É também possível observar que os peptídeos foram encontrados não somente nas partículas, como também em estruturas celulares próximas às mesmas, assim como em estruturas vesiculares na periferia da célula. É possível ainda, visualizar

pontos na membrana plasmática co-localizados com moléculas do MHC de classe I, o que sugere a apresentação desses peptídeos. A apresentação do peptídeo em associação ao MHC-I na superfície das DCs será mostrada em detalhes no próximo tópico.