Yağ Asidi Metil Esterleri (FAME) Analizi

Bütün hücre yağ asidinin Gaz Kromotografi (GC) analizi ile bakteri sınıflandırılmasında kullanılabilirliğini ilk defa Abel ve arkadaşları 1963’te kanıtlamışlardır. Araştırmacılar, bakteri sınıflandırılmasında lipid analizinin hızlı ve basit bir yöntem olduğu sonucuna varmışlardır. 1991’de Welch, hücre yağ asidlerinin tür düzeyinde ayrımının, GC FAME profilinin mikrobiyal identifikasyonda önemli bir gücü olduğu sonucuna dayanarak yağ asidi analizinin uygulama alanlarını içeren bir derleme yayınlamıştır [92, 93]. 1991’de Microbial ID inc. Şirketi (MIDI, Newark, Delaware, ABD) geliştirilerek hizmete sunulan bilgisayar kontrollü bir gaz kromatografi sistemi yardımı ile kültüre alınabilen her türlü mikroorganizmanın tanısında kullanılabilen Mikrobiyal Tanı Sistemi (MIS) piyasaya sunmuştur [92]. Sherlock Microbial Identification System günümüzde bakteriyal FAME profilinde referans sistem olarak kabul görmektedir. Bakteriyal FAME analizinin populer olmasıyla sonraki yıllarda çok sayıda ve çeşitli bakteri grubu incelenmiş ve yağ asidi profillerinin numerik analizi yapılmıştır. Araştırmacılar cins seviyesinde tanımlama üzerine yoğunlaşmışsa da FAME verileri göstermiştir ki tür seviyesinde de bilgi verebilmektedir. FAME profili taksonomi dışında bakteriyel komünite tayini, mikrobiyal kaynak takibi ve bakteriyal spor tayini amacıyla kullanılmaktadır [92, 93].

1.1.10.3.1. Yağ Asitlerinin Yapısı

Yağ asidi profili, karbon uzunluğu 9 ile 20 atom arasında değişen bileşikler üzerine yoğunlaşmış olup hücre memranında ki yağ asitlerinin büyük çoğunluğunu oluşturan glikolipidleri fosfolipidleri ve lipopolisakkaritleri (LPS) içermektedir. Mikrobiyal hücrelerde yağ asitlerinin birincil kaynağı hücre membranıdır. LPS katmanları gram negatiflerde ilave bir kaynak oluşturmaktadır. Bakterilerde yağ asidinin sentezi yüksek ölçüde korunmuş enzimlerden oluşan tip iki yağ asidi sentetaz sistemi tarafından gerçekleştirilir. Ana bileşenler, yağ asitlerini esterleyen molekül koenzim A ve açil taşıyıcı proteindir. Birçok bakteri 10 ile 19 karbonlu yağ asidi sentezler ve bunlardan birçoğu da 16 ile 18 karbon uzunluğundadır. Genellikle hücre yağ asidi

profili 5 ile 15 çeşit yağ asidi içerir. Bazı gram pozitif bakterilerde dallı-zincirli yağ asitleri hakimken, gram negatif bakterileri kısa hidroksi asit zincirlerinden oluşan lipopolisakkaritler karakterize etmektedir [92, 94]. Plazmit ve mutasgenesis çalışmalarına dayanarak yağ asidi kompozisyonunun genetik olarak yüksek düzeyde korunduğunu söyleyebiliriz. Bakterilerde 300’den fazla yağ asidi ve buna bağlı bileşikler bulunmuştur. Teorik olarak 2300 farklı kombinasyonun yarattığı çeşitlilik FAME analizini kullanışsız kılarken bakteri gruplarında rastgele olmayan dağılım, yüksek miktarda oluşu bakteriyel taksonlar da tanımlamayı güçlü kılmaktadır [92]. Welch (1991) yaptığı çalşımada FAME analizinin cins ayrımına olanak sağladığını ve karakteristik FAME profillerinin tür düzeyinde bulunabileceğini belirtmiştir. Cins düzeyindeki FAME profillerinin kalitatif farklılık (peak varlığı), tür düzeyindeki FAME profillerinin ise kantitatif farklılık (peak oranı) göstermesi bu durumun altını çizmektedir [95]. Başlangıçta yağ asitleri doğal kaynaklarına göre adlandırılsa da (örneğin sarkinik asidin kaynağı Sarcina türleridir) şimdilerde adlandırmada terminoloji kullanılmaktadır. Yağ asidi isimlendirilirken yapısındaki karbon atomu sayısı, fonksiyonel gruplar ve çift bağların yeri temel alınır. Sistematik adlandırma basitçe şöyledir; karbon sayısının soluna “C” sağına da çift bağ sayısı yazılır. “ω” sembolü karbon zincirinde çift bağın bulunduğu yeri gösterirken “c” ve “t” harfleri cis veya trans konfigürasyonunu temsil etmektedir. Zincirin karboksil ucu (COOH) α sonu olarak adlandırılır. Zincirin dallandığı yer, sikopropan yapısı ve hidroksi yağ asitleri numaralandırılırken zincirin karboksil ucundan başlanmaktadır. Alternatif olarak α ucundan da başlanabilir. İso ve ante iso dallı yağ asitleri 2 ve 3 karbon atomlarında (ω ucuna göre) metil dallanması olan yağ asitleridir. Bu yağ aistleri adlandırılırken isimlerinin önlerine iso veya anteiso önekleri alırlar [92, 95].

1.1.10.3.2. Kültür ve Büyüme Koşulları

Farklı makalelerde farklı koşulların FAME profilini etkilediği belirtilmiştir. Kültür ve büyüme koşullarının önemi Abel ve arkadaşları tarafından vurgulanmıştır. Kaneda, yağ asitlerinin fizyolojik ve çevresel koşullara bağlı olarak nispi oranlarda değişiklik gösterebildiğini belirtmiştir. Ayrıca büyüme fazının safhasına göre de değişebileceğini göstermiştir. Değişik sıcaklıkların ve besiyerlerinin bakteriyel yağ

asidi kompozisyonu üzerine etkisini bir kaç araştırmacı çalışmıştır [92, 96]. Farklı sıcaklıklar yağ asidi oranını değiştirmektedir. Genel olarak yağ asidi profili, triptik soy agar (TSA) besiyerine, inkübasyon zamanına, inkübasyon atmosferine, sıcaklığa ve kromatografik ekipmana göre kantitatif değşiklik (peak alanı) gösterebilir. Dahası ve önemlisi bu faktörler yağ asidi profilinde kalitatif etkiler (peak varlığı) de yaratabilir. Farklı suşların yağ asidi profilleri incelenirken göz önüne alınmalıdır ki besiyeri ve büyüme koşulları aynı olmalıdır. Bu makalelerden yola çıkarak FAME temelli tanımla için kültür ve büyüme koşullarına bir standart getirilmelidir. Bu çalışmada Sherlock MIS protokolünü takip edilmiştir [92, 93]. Bu metot bakteriyal lipidlerin hidrolizasyonu ve ekstraksiyonuna dayanır (Şekil 1.9.) [97]. Karboksilik grupların metilasyonu yağ asitlerinin metil esterlerini üretir ve bunlar GC ile analiz edilir. Analiz edilecek madde uygun bir kolonda bulunan sabit faz arasından hareket eden bir inert gaz yardımıyla geçirilir. Analiz edilecek madde kolonun girişinde bulunan enjektör kısmın yardımıyla buhar halinde kolona verilir. Kolonda her bileşen sabit fazdan mobil faza ve mobil fazdan sabit faza farklı hızlarda göç ederek devamlı taşınırlar ve böylece birbirlerinden ayrılarak farklı zamanlarda kolondan çıkarlar. Kolonun sonuna konan uygun bir dedektörle tespit edilerek miktarlarıyla orantılı olarak tespit edilirler. GC’de kullanılan sabit faz katı ise gaz kromatografisi, sabit faz sıvı ise gaz-sıvı kromatografisi söz konusudur. GC’de kolon yüksek sıcaklıkta tutularak ayrılacak maddeler gaz halinde geçirildiğinden kaynama noktası 500ºC’ye kadar olan bileşikler ayrılabilir. Çünkü bugün için ancak bu sıcaklığa dayanabilecek sabit fazlar geliştirilmiştir [98].

Gaz kromatografik işlem basamaklarını şöyle sıralayabiliriz:

 Ekstraksiyon: Sıvı veya katı örnek analiz edilecek bileşikleri çözebilen bir çözücü ile ekstrakte edilir. Bu işlem bir blenderda veya bir ayırma hunisinde gerçekleştirilir.

 Temizleme: Eksraksiyon sonucu ele geçen ekstraktta ilgilenilen bileşiklerin dışında pek çok bileşik bulunmaktadır. Analizde girişimlerden korunmak için bu kirletici bileşiklerin uzaklaştırılması gerekmektedir. Bu işlem için pratikte kolon, ince tabaka kromatografileri ve ayırma hunisinde sıvı-sıvı partisyon kromatografisinden yararlanılmaktadır.

 Konsantrasyon: Temizlenmiş ekstrakttaki çözücünün buharlaştırılarak örneğin konsantre edilmesi gerekir. Bunun için vakumlu döner buharlaştırıcıdan yararlanılır.

 Türevlendirme: Temizlenmiş ve konsantre edilmiş örnek içerisindeki bazı bileşenlerin analizi için bileşik çeşitli kimyasal reaksiyonlar ile başka bir forma dönüştürülür ve böylece gaz kromatografisi dedektörü tarafından duyarlı hale gelmiş olur. Bu işlem her gaz kromatografik analizde zorunlu değildir [99].

Şekil 1.9. Sherlock Mikrobiyal Tanımlama Sistemi ve FAME Analizi [97]

Gaz kromatografisinin avantajlarını kısa sürede örneklerin ayrılması, oldukça kompleks karışımları ayırabilme ve çok küçük miktarları tespit edebilme yeteneğine sahip olması, gaz kromatografisi doğru ve tekrarlanabilir analiz sonuçları vermesi olarak sıralayabiliriz. Gaz kromatografisinin dezavantajları ise numunelerin belli bir uçuculuğa sahip olma zorunluluğudur. Kompleks karışımlar için gaz kromatografisinde analizden önce ekstraksiyon ve türevlendirme gibi ön işlemler gerekebilir. Kolon sıcaklığında stabil olmayan maddeler için uygun değildir. Yüksek polariteli maddeler için gaz kromatografisi uygun ayırma tekniği değildir. Yüksek molekül ağırlıklı maddelerle çalışılmamaktadır [100]. MIDI şirketi, Sherlock MIS kütüphanelerinin mikroorganizmaların en genel koşulları seçilerek yapılandırıldığı

üzerine dursada, bakteriyel suşlar spesifik koşullar ve kültür gerektirir. Bu da bakteriyel tanımlamanın kapsamını sınırlandırmaktadır.