Arama Yapma

A análise dos espectros de massas full scan das soluções dos extratos de L.

theobromae mostrou a presença do pico de m/z 209 a partir do décimo sexto dia de cultivo,

permanecendo até o trigésimo segundo dia (Fig. 82, Pág. 112). Este pico foi selecionado, em todos os espectros, como íon precursor e posteriormente fragmentado no modo ESI-MS/MS para identificação do íon produto m/z 59, confirmando a presença de ácido jasmônico nas amostras.

Foi possível também verificar o aparecimento do pico íon m/z 227 a partir do vigésimo dia de cultivo (Fig. 82, Pág. 112), o qual pode ser relacionado à hidratação da ligação dupla do ácido jasmônico. A partir do vigésimo quarto dia também foi detectado o pico de m/z 225, oriundo da possível epoxidação do ácido jasmônico.

O OH O O m/z 209 m/z 59 OH O

Resultados e Discussão 112

Figura 82: Espectros de massa full scan do 160 _{ao 32}0 _{dia de cultivo.}

16o dia

20o dia

24o dia

28o dia

Resultados e Discussão 113

4.4 Emprego de Lasiodiplodia theobromae na biotransformação de substratos orgânicos 4.4.1 Biotransformação da (R)-carvona

Para testar o potencial enzimático de L. theobromae em reações de biotransformação, foram realizados estudos utilizando como substratos orgânicos os monoterpenos (R)- e (S)-carvona, acetofenona e quatro derivados p-substituídos.

4.4.1.1 Avaliação da concentração inibitória mínima (CIM) da (R)-carvona

Às culturas de L. theobromae em meio líquido BD, com 7 dias de crescimento, foi adicionada a (R)-carvona em cinco concentrações diferentes (20 250 µL: 0,13 1,67 mmol). As culturas de L. theobromae contendo (R)-carvona mantidas sob agitação por três dias foram repicadas em placas de petri contendo BDA (Item 5.12.4.1, Pág. 195).

Por comparação com uma cultura controle (sem R-carvona), observou-se que aquelas culturas que foram submetidas a 20 e 50 µL da (R)-carvona tiveram crescimento idêntico ao controle. A cultura na qual foi adicionada 100 µL de (R)-carvona também indicava crescimento fúngico, porém menos acentuado. Aquela com 150 µL mostrou leve turvação ao redor do disco fúngico, o que pôde indicar que a cultura estava em fase inicial de crescimento, enquanto que a cultura com 250 µL não indicava sinal de desenvolvimento.

Depois de seis dias de crescimento, verificou-se que aquelas culturas com 20, 50 e 100 µL de (R)-carvona continuavam se desenvolvendo, o que não foi verificado nas culturas com 150 e 250 µL.

Das observações feitas, pode-se concluir que a adição de 20 e 50 µL de carvona não interferiria no metabolismo do fungo. Nas concentrações de 100 e 150 µL observou-se efeito fungistático e efeito fungicida com 250 µL (Fig. 83, Pág. 114).

Resultados e Discussão 114 20 µL 50 µL 100 µL 150 µL 250 µL

Figura 83: Culturas de L. theobromae na avaliação da CIM de carvona (50 250 µL); (A): 3 dias e (B): 6 dias A A A A A B B B B B B

Resultados e Discussão 115

4.4.1.2 Análise dos produtos de biotransformação da (R)-carvona

Após a obtenção dos extratos das culturas de L. theobromae utilizadas no estudo da CIM (Item 5.12.4.1, Pág. 195), as massas obtidas (Tab. 49, Pág. 196) revelaram que as culturas que tinham rendimento do produto bruto compatível com a quantidade de substrato adicionada eram aquelas nas quais foram empregados 20 e 50 µL de (R)-carvona. Os produtos das reações foram analisados por CG/EM (Item 5.12.4.2, Pág. 196).

A análise dos cromatogramas (Fig. 84-89, Pág. 117-118) e dos espectros de massas (Fig. 90-93, Pág. 119) mostrou a presença da (R)-carvona e até três derivados, denominados A, B e C (Tabela 18). O padrão de fragmentação observado nos espectros de massas é semelhante ao descrito na literatura para derivados desse monoterpeno (THOMAS; WILLHAM, 1966; DYK et al. 1998), indicando que esses compostos tratavam-se de produtos da biotransformação de (R)-carvona.

Tabela 18: Composição percentual relativa entre a (R)-carvona e seus derivados variando a concentração do substrato (20 - 50 µL). 20 µL (%) 50 µL (%) 100 µL (%) 150 µL (%) 250 µL (%) A (10,6 min) 42,3 25,1 70,1 38,5 12,7 (R)-carvona (11,3 min) 2,0 1,2 11,1 61,5 87,3 B (14,4 min) 15,6 12,2 2,6 ND ND C (15,8 min) 40,1 61,5 16,2 ND ND

ND: sinal não detectado

A análise da Tabela 18 revela que à medida que a concentração do substrato aumenta (20 250 µL) o percentual de conversão diminui, confirmando os resultados do estudo da CIM que revelou uma diminuição no metabolismo do fungo. A conversão do substrato em A quando são utilizados 250 µL da (R)-carvona mostra que seu efeito fungicida sobre L. theobromae não é imediato. Provavelmente, o tempo de exposição do fungo a alta concentração do substrato é determinante (Graf. 1, Pág. 116).

Analisando os resultados referentes às concentrações de 20-100 µL, onde os três produtos são formados, observamos que A e C são majoritários e na menor concentração existe uma relação de aproximadamente 1:1 entre eles. Quando a concentração intermediária de 50 µL é utilizada, a formação do derivado C é maior (cerca de 40%) que A e com 100 µL os resultados são invertidos, ou seja a concentração de A é maior que a de C.

Resultados e Discussão 116

Esses resultados indicam que inicialmente a (R)-carvona é convertida em A e os demais produtos são derivados desse produto de conversão. Logo, para haver a formação de B e C em maior proporção, é necessário que a (R)-carvona encontre-se numa concentração de até 50 µL.

Dessas observações conclui-se que a formação de B e C é determinada pela concentração do substrato utilizada, ou seja, a partir de 100 µL a formação de C é limitada, fato esse também visto quando se utiliza 150 e 250 µL. A partir desse estudo, pôde-se verificar que a utilização de 50 µL de (R)-carvona é a ideal e em todos os experimentos seguintes essa foi a quantidade utilizada desse substrato.

0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 P ro d u to s ( % ) C a rvo n a (u L ) A (R )-c a rv o n a B C

Resultados e Discussão 117

Figura 84: Cromatograma da (R)-carvona.

Figura 85: Cromatograma do produto bruto da reação com 20 uL de (R)-carvona.

Figura 86: Cromatograma do produto bruto da reação com 50 uL de (R)-carvona.

(R )- ca rv on a (R )- ca rv on a

Resultados e Discussão 118

Figura 87: Cromatograma do produto bruto da reação com 100 uL de (R)-carvona.

Figura 88: Cromatograma do produto bruto da reação com 150 uL de (R)-carvona.

Figura 89: Cromatograma do produto bruto da reação com 250 uL de (R)-carvona.

(R )- ca rv on a (R )- ca rv on a (R )- ca rv on a

Resultados e Discussão 119

Figura 90: Espectro de massas da (R)-carvona (IE, 70 eV).

Figura 91: Espectro de massas do derivado A (IE, 70 eV).

Figura 92: Espectro de massas do derivado B (IE, 70 eV).

Resultados e Discussão 120

4.4.1.3 Identificação dos produtos da biotransformação da (R)-carvona 4.4.1.3.1 Identificação de A

Inicialmente, a identificação dos produtos da biotransformação da (R)-carvona foi feita através de comparação com os produtos da redução com NaBH4 (Item 5.12.2, Pág. 194). A análise por CCDA do produto bruto da redução revelou que todo substrato tinha sido consumido e após purificação em coluna cromatográfica com gel de sílica o produto da reação foi analisado por CG/EM.

A análise do cromatograma do produto da redução com NaBH4 (Fig. 95, Pág. 121) mostrou a presença de três compostos e seus respectivos espectros de massas revelaram tratar-se dos diastereoisômeros cis- e trans-carveol e do neodihidrocarveol.

OH OH

cis e trans-carveol mistura de

diastereoisômeros do neodihidrocarveol Figura 94: Produtos da redução da (R)-carvona com NaBH4.

Assim a comparação do cromatograma e dos espectros de massas dos produtos da redução da (R)-carvona com NaBH4 (Figura 94) revelou que o produto A, obtido da biotransformação da (R)-carvona utilizando L. theobromae, trata-se do neodihidrocarveol (Esq. 14, Pág. 121).

A análise do espectro de massas de A (Fig. 91, Pág. 119) confirma a estrutura sugerida, e a sua proposta de fragmentação está descrita no Esquema 15 (Pág. 122).

Resultados e Discussão 121 OH L. theobromae O A (R)-carvona