Araştırmanın Yapıldığı Okullardaki Öğrencilerin Doping Bilgi Düzeyi ve

Neste trabalho foram avaliados os níveis das proteínas: A1, Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Flip-1 e Mcl-1 e do gene pró-apoptótico Bad.

Os experimentos de western-blot foram importantes para verificar se os níveis de proteínas eram proporcionais ao nível de expressão gênica.

Os dados obtidos confirmaram que há uma relação direta entre os níveis de expressão proteína e os de RNAm das moléculas relacionadas à apoptose investigadas.

Os resultados obtidos por meio de western-blot estão apresentados nas figuras 29 a 33, seguidas pelos gráficos referentes à quantificação das bandas das membranas por de 29 a 35. Os números que estão sobre a figura e abaixo dos gráficos representam o número das amostras dos pacientes.

Figura 29 – Expressão protéica de A1 em amostras de quatro pacientes com LMC pré e pós-tratamento com mesilato de imatinibe. As barras verdes e rosas correspondem aos valores pré-e pós-tratamento com MI, respectivamente.

17

15 20

26 kDa

22 kDa

9 14 15 17 9P 14P 15P 17P

Figura 30 - Expressão protéica de Bcl-xL em amostras de quatro pacientes com LMC pré e pós-tratamento com mesilato de imatinibe. As barras verdes e rosas correspondem aos valores pré-e pós-tratamento com MI, respectivamente.

Figura 31 - Expressão protéica de Bcl-w em amostras de quatro pacientes com LMC pré e pós-tratamento com mesilato de imatinibe. As barras verdes e rosas correspondem aos valores pré-e pós-tratamento com MI, respectivamente.

9 14 17 20 9P 14P 17P 20P 26 kDa

55 kDa 26 kDa

8 14 18 20 8P 14P 18P 20P

Figura 32 - Expressão protéica de Bcl-2 em amostras de quatro pacientes com LMC pré e pós-tratamento com mesilato de imatinibe. As barras verdes e rosas correspondem aos valores pré-e pós-tratamento com MI, respectivamente.

Figura 33 - Expressão protéica de c-Flip em amostras de quatro pacientes com LMC pré e pós-tratamento com mesilato de imatinibe. As barras verdes e rosas correspondem aos valores pré-e pós-tratamento com MI, respectivamente.

8 14 15 17 8P 14P 15P 17P

23 kDa

Figura 34 - Expressão protéica de Mcl-1 em amostras de quatro pacientes com LMC pré e pós-tratamento com mesilato de imatinibe. As barras verdes e rosas correspondem aos valores pré-e pós-tratamento com MI, respectivamente.

Figura 35 - Expressão protéica de Bad em amostras de quatro pacientes com LMC pré e pós-tratamento com mesilato de imatinibe. As barras verdes e rosas correspondem aos valores pré-e pós-tratamento com MI, respectivamente.

40kDa

Conforme mencionado em Casuística e Métodos, os controles endógenos utilizados na normalização dos valores da densidade das bandas das proteínas-alvo foram a actina e a tubulina, cujos exemplos de resultados do western-blot estão mostrados nas figuras 36 e 37.

14 15 17 20 14P 15P17P 20P

9 15 17 20 9P 15P 17P 20P 43 kDa

48 kDa

Figura 36 - Expressão protéica de Actina em amostras de quatro pacientes com LMC pré e pós-tratamento com mesilato de imatinibe.

Figura 37 – Expressão protéica de Tubulina em amostras de quatro pacientes com LMC pré e pós-tratamento com mesilato de imatinibe.

V. DISCUSSÃO

A LMC é uma doença mieloproliferativa, cuja fisiopatologia está associada à presença de uma translocação cromossômica recíproca entre os cromossomos t(9;22) nos pacientes. Essa translocação promove o aparecimento do neogene bcr- abl, o qual codifica uma proteína com atividade de tirosina-quinase (TK) de mesmo nome, Bcr-Abl (revisado em BERGANTINI, et al., 2005; HEHLMANN, et al., 2005;

MELO; BARNES, 2007).

As enzimas tirosina-quinases são importantes ativadoras de diferentes cascatas bioquímicas de sinalização intracelular e participam de processos biológicos vitais da célula como divisão, diferenciação, metabolismo e morte (COOLS, et al., 2005). Tendo em vista sua relevância nos processos celulares supracitados, revisões recentes da literatura associam alterações das tirosina- quinases com a fisiopatologia de neoplasias e indicam as TK como potenciais alvos terapêuticos dessas doenças (MANASH; MUKHOPADHYAY, 2004; WADLEIGH, et al., 2005; HEHLMANN, et al., 2007; SCHIFFER, 2007; CABEBE, et al., 2007;

MALUMBRES, et al., 2007).

A Bcr-Abl é uma tirosina-quinase ativada constitutivamente que desencadeia uma cascata de reações bioquímicas intracelulares, culminando na transformação maligna da célula precursora hematopoética. Segundo KEESHAN e colaboradores (2002), a proteína Bcr-Abl contribui para o desenvolvimento e progressão da LMC. A célula leucêmica Bcr-Abl positiva apresenta alterações na adesão ao estroma medular, na proliferação celular e resistência à indução da apoptose por quimioterápicos tradicionais (DEININGER, et al., 2000; BORNER, 2003; MELO, et

al., 2004). Medicamentos desenvolvidos especificamente para o tratamento dessa

doença e que visam à inibição da atividade enzimática de Bcr-Abl são o mesilato de imatinibe (Glivec®), o dasatinibe (BMS-354825) e o nilotinibe (AMN107).

O tratamento atual para LMC preconiza a utilização do mesilato de imatinibe como primeira linha de terapia, já que o mesmo promove altas taxas de remissão citogenética nos pacientes. Entretanto, alguns pacientes apresentaram refratariedade a esse medicamento, o que conduziu a utilização dos inibidores de TK de segunda geração (dasatinibe e nilotinibe) e apontou para a necessidade pesquisas e desenvolvimento de fármacos mais eficientes no combate a doença.

As evidências de que o Bcr-Abl seria o evento inicial da transformação celular fez com que pesquisadores centralizassem seus projetos de pesquisa na descrição de vias de sinalização que dessem origem a mieloproliferação e acúmulo das células leucêmicas. Diversos sinais de transdução e diferentes fatores de transcrição têm sido associados ao fenótipo de resistência à apoptose das células leucêmicas. Esses sinais modulam a expressão e/ou ativação dos genes reguladores da apoptose, dentre os quais se destacam alguns membros da família Bcl-2, tais como Bcl-xL, Bcl-2, Bax e Bad (revisado em CASTRO et al., 2005).

Estudos de nosso grupo de pesquisa sugerem que a atividade de TK é responsável parcialmente pela transformação maligna da célula e pelo fenótipo de resistência a apoptose induzido pela proteína Bcr-Abl em células hematopoéticas (BUENO-DA-SILVA et al., 2003).

A oncoproteína Bcr-Abl protege as células da apoptose por meio da alteração de várias vias de indução de morte, incluindo a via do p53 (YAKOVLEV et al., 2004), via mitocondrial (intrínseca) e a via de receptores de morte (extrínseca) (RAVANDI et al., 2001; BRUMATTI, et al., 2003).

O presente trabalho investigou o efeito dos inibidores de TK na maquinaria apoptótica com o intuito de elucidar melhor seu mecanismo de ação e de checar qual a relação da atividade enzimática de Bcr-Abl e a resistência a apoptose.

Para tanto, a estratégia empregada foi avaliar a expressão de proteínas e genes das vias extrínseca e intrínseca da apoptose celular em células mononucleares de pacientes com LMC antes e após 12 meses de tratamento com inibidores da tirosina-quinase (mesilato de imatinibe e dasatinibe).

Assim sendo, as moléculas anti-apoptóticas (A1, Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, c-Flip, Ciap-1, Ciap-2 e Mcl-1) e pró-apoptóticas (Bad, Bak, Bax, Bcl-xs, Bid, Bik, Bimel, Bok, Bmf, Fas, Fasl, Noxa e Puma) foram avaliadas nos pacientes com LMC e controles. Conforme as análises realizadas, os pacientes foram divididos em quatro grupos: 1) pacientes pré-tratamento; 2) pacientes 12 meses pós-tratamento; 3) pacientes em remissão citogenética completa e 4) refratários ao tratamento.

V.1. Discussão dos resultados da expressão dos genes anti-apoptóticos nos