4. ARAġTIRMA BULGULARI
4.1 AraĢtırma Alanının Kent Kimliğinin ĠĢlevsel Kalite Açısından Değerlendirmesi
4.1.1 AraĢtırma Alanının UlaĢım Durumuna ĠliĢkin Tarihçe
Neste trabalho, a xilanase produzida por P. expansum foi parcialmente purificada e caracterizada. A metodologia utilizada para a purificação seguiu protocolos desenvolvidos para as xilanases de outros microrganismos como
Aspergillus fischeri Fxn1 (CHANDRA et al., 1996) e Apergillus niger (YI MBO et al.,
1996).
A xilanase de P. expansum foi parcialmente purificada a partir do sobrenadante da cultura, por fracionamento com sulfato de amônia, seguido de cromatografia de exclusão molecular coluna Sephadex G-25, ultrafiltração (Millipore, Bedford, exclusão molecular 10 kDa) e cromatografia de troca iônica coluna DEAE- Sephadex A-50. A coluna de exclusão molecular teve como objetivo dessalinizar a amostra, sendo para isto escolhida a resina Sephadex G-25. As xilanases produzidas por diferentes fungos possuem massa molecular entre 13 e 50 kDa (CHANDRA et al.,1996).
No perfil de eluição das proteínas em cromatografia de exclusão molecular coluna Sephadex G-25, foi observado um pico de atividade da xilanase (Figura 3).
As frações contendo atividade foram reunidas (21 frações-63mL) e ultrafiltradas em membrana de exclusão molecular de 10 kDa. Após a ultrafiltração, a
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amostra dessalinizada foi submetida à coluna de troca iônica DEAE-Sephadex A-50 (resina de grupo trocador dietil-aminoetil de pka= 8,5). A maioria das xilanases de fungos filamentosos possui carga negativa em pH neutro (YI MBO et al., 1996).
A Figura 4 mostra o perfil de eluição das proteínas em cromatografia de troca iônica coluna DEAE-Sephadex A-50.
Figura 3. Perfil de eluição das proteínas em cromatografia de exclusão molecular coluna Sephadex G-25. (♦) Unidades de xilanase. (<) Absorvância em 280 nm. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 10 20 30 40 50 Número da fração
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Figura 4. Perfil de eluição das proteínas em cromatografia de troca iônica coluna DEAE-Sephadex A-50. (♦) Unidades de xilanase.(<) Absorvância em 280 nm. (p) Gradiente de NaCl (0-0,5 M).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
4
16 28 40 46 55 64 70 79 88 98 108
Número da fração
Unidades de XIL e ABS 280 nm
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
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Foi eluído um pico de atividade durante o gradiente linear de NaCl com força iônica de 0,1 M. O perfil de eluição das proteínas em cromatografia de troca iônica, sugeriu a existência de uma única forma de xilanase, sendo esta, secretada no sobrenadante da cultura de P. expansum.
As frações contendo atividade da enzima foram reunidas (20 frações-60mL) e caracterizadas.
O Quadro 4 mostra um resumo das etapas de purificação parcial da xilanase de P. expansum.
Quadro 4. Resumo das etapas de purificação parcial da xilanase de P. expansum.
___________________________________________________________
Etapa da purificação Proteína Atividade Atividade Recupe- Purifi- (mg) (Ut) específica ração cação
(% ) ___________________________________________________________ Sobrenadante da cultura 190 4287 22,56 100 1 ___________________________________________________________ Fracionamento (NH4)2SO4 3,37 666 197,6 15,53 8,7 Exclusão molecular 0,360 305 847,3 7,11 37,5 ___________________________________________________________ Ultrafiltração 0,317 260 820,4 6 36,3 ___________________________________________________________ DEAE-Sephadex 0,0374 145,2 3924 3,3 174 _____ ______________________________________________________
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4.1. Eletroforese em gel SDS- poliacrilamida
As preparações protéicas das diferentes etapas de purificação foram submetidas à eletroforese em gel SDS -poliacrilamida 12 % e coradas com nitrato de prata (Figura 5)
Este tipo de gel fornece condições para monitorar as etapas de purificação das proteínas, observando o decréscimo do número de bandas protéicas à medida que a purificação aumenta (LEHNI NGER et al., 1995).
1 2 3 4
Figura 5. Eletroforese em gel SDS-poliacrilamida 12 % , corado com nitrato de prata. 1. Sobrenadante da cultura; 2. Pós-coluna de exclusão molecular; 3. Pós-ultrafiltração; 4. Pós-coluna de troca iônica.
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4.2. Determinação da temperatura ótima de atividade da xilanase parcialmente purificada
A determinação da temperatura ótima da xilanase de P. expansum está representada na Figura 6. A determinação da atividade em temperaturas, variando entre 20 0C e 70 0C, demonstrou que a temperatura ótima da enzima é 40 0C.
As xilanases de origem fúngica normalmente mostram atividade ótima em torno de 50 0C, sendo inativadas em temperatura superior a 65 0C (DEKKER e RI CHARDS, 1976; GASPAR et al., 1997).
KI TAMOTO et al. (1999) encontraram temperatura ótima de 60 0C em seu trabalho de purificação e caracterização de xilanase produzida por Aspergillus oryzae, SHERI EF (1990) encontraram temperatura ótima de 55 0C em seu trabalho de caracterização de xilanase produzida por Aspergillus flavipes.
As enzimas, em geral, apresentam atividade máxima em determinada temperatura. A temperatura pode modificar a estrutura da proteína de forma que seu sítio ativo permaneça mais exposto, aumentando a atividade enzimática (LEHNI NGER et al., 1995).
O aumento da temperatura resulta em elevação do número de moléculas com energia suficiente para sobrepor a barreira energética, por meio da diminuição da energia de ativação. Por outro lado, temperaturas altas promovem a desnaturação enzimática e, consequentemente, a perda da atividade da enzima (LEHNI NGER et al., 1995).
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Figura 6. Efeito da temperatura sobre a atividade da xilanase de P. expansum, em pH 5,0.
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Temperatura (°C)
U/micrograma de proteína
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4.3. Determinação do pH ótimo de atividade da xilanase parcialmente purificada
A determinação do pH ótimo de atividade da xilanase está representada na Figura 7. O pH ótimo de atividade da xilanase de Penicillium expansum foi 5,5. Este valor está situado dentro da faixa de estabilidade da enzima, apresentado na Figura 9.
Resultados semelhantes foram observados para outros microrganismos.
Penicillium chrysogenum (HAAS et al., 1992) e Aspergillus ficheri Fxn1 (CHANDRA et
al., 1996) também apresentaram xilanases com atividades máximas em pH ácido. KI TAMOTO et al. (1999) encontraram pH ótimo de 5,0 em seu trabalho de purificação e caracterização de xilanase produzida por Aspergillus oryzae. SHERI EF (1990) encontraram pH ótimo de 5,0 para xilanase de Aspergillus flavipes.
As xilanases de origem fúngica, geralmente, são mais ativas em pH que oscila entre 3,5 e 5,5 e são estáveis em ampla faixa de pH, usualmente de 3 a 10. Por outro lado, o pH ótimo das xilanases bacterianas oscila entre pH 5,0 e 7,5 (DEKKER e RI CHARDS, 1976; WONG et al., 1988).
As enzimas em geral apresentam atividade máxima em determinado pH. Em valores de pH maiores ou menores que este, sua atividade diminui. Cadeias laterais de alguns aminoácidos agem como ácidos ou bases fracas, realizando funções críticas no sítio ativo da enzima. Assim, mudanças de ionização destas cadeias causam mudanças na atividade enzimática (LEHNI NGER et al., 1995).
O pH pode influenciar diretamente a atividade enzimática por meio de mudanças nas cargas de aminoácidos essenciais, como aqueles situados no sítio ativo da enzima, ou nos sítios de ligação, acarretando maior ou menor afinidade da enzima para com o substrato (LEHNI NGER et al., 1995). Mudanças de pH afetarão profundamente o caráter iônico dos aminogrupos e dos grupos carboxílicos da proteína, afetando marcadamente, portanto, o sítio catalítico e a conformação de
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uma enzima. Além dos efeitos puramente iônicos, valores baixos ou altos de pH podem causar desnaturação considerável e consequentemente inativação da proteína enzimática. Ademais, uma vez que muitos substratos têm caráter iônico (por exemplo, ATP, NAD+, aminoácidos e CoASH), o sítio ativo da enzima pode requerer espécies iônicas determinadas para atingir atividade ótima. Esses efeitos são provavelmente os principais determinantes de uma típica relação atividade enzimática-pH (CONN e STUMPF, 1987).
Figura 7. Efeito do pH sobre a atividade da xilanase de P. expansum, em temperatura de 40 0C.
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pH
U/micrograma de proteína
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Várias xilanases de bactérias alcalófilas ou alcalitolerantes têm sido estudadas com o intuito de serem usadas no processo de despolpamento da celulose na indústria de papel (NAKAMURA et al., 1993). Estes autores observaram que não há atividade de celulase em filtrado da cultura produzido pela bactéria alcalófila Bacillus sp. estirpe 41M-1; portanto, este filtrado não necessita ser purificado para o tratamento da polpa.
4.4. Estabilidade térmica da xilanase
A estabilidade térmica da xilanase parcialmente purificada foi avaliada por determinação da atividade remanescente, após pré-incubação da enzima em PPB 0,05 M, pH 5,5 em temperaturas de 20 0C, 30 0C, 40 0C, 50 0C, 60 0C e 70 0C por 1 h, como mostrado na Figura 8. A atividade da enzima sem pré-incubação foi considerada como 100 % .
A xilanase de P. expansum apresentou-se estável quando pré-incubada por uma hora, em temperaturas de 20 0C, 30 0C e 40 0C. Nas temperaturas de 50 0C, 60 0C e 70 0C, a enzima manteve 48 % , 39 % e 34 % da atividade máxima, respectivamente.
O decréscimo na atividade enzimática, observado a partir de 40 0C, pode ser resultante da inativação térmica da enzima. O mesmo ocorreu com poligalacturonases (PG) produzida por Trichoderma resei QM 9414, que foi inativada quando mantida por uma hora a temperaturas acima de 45 0C (DEKKER, 1993). Segundo este autor, a estabilidade térmica à temperaturas elevadas pode ser aumentada com a adição de 1 mg/ mL de albumina de soro bovino (BSA). A altas temperaturas, BSA previne significativamente a inativação enzimática.
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Figura 8. Estabilidade térmica da xilanase de P. expansum em diferentes temperaturas após 1 h de pré-incubação. A atividade foi determinada a 40 0C e pH 5,5.
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Temperatura (
0C)
Atividade relativa (%)
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O valor de T1/ 2 (tempo em minutos, em que se observa 50 % da atividade
enzimática máxima) estimado para a xilanase incubada a 50 0C, foi de aproximadamente 490 min (CHANDRA et al., 1996).
De acordo com KESKAR (1992), a termoestabilidade da enzima é característica desejável para as enzimas industriais. Enzimas termoestáveis, em geral, são de grande interesse biotecnológico apresentando algumas vantagens para os processos industriais como maior produtividade, eficiência e menores chances de contaminação (GI LBERT et al., 1992).
Algumas xilanases são termoestáveis, permitindo seu uso em altas temperaturas, o que é ideal na prevenção de contaminação bacteriana e no aumento da eficiência de hidrólise. Além disso, enzimas estáveis são mais facilmente estocadas, manuseadas e transportadas em temperatura ambiente e recicladas eficientemente (MARGARI TI S e MERCHANT, 1984).
4.5. Estabilidade em relação ao pH
A enzima foi convenientemente diluída em tampão Tris/ acetato de potássio/ fosfato de potássio 50 mM. Os valores de pH variaram na faixa de 4,0 a 9,0, com intervalo de 0,5 unidade de pH. A enzima foi pré-incubada em presença de 1 mg/ mL de BSA durante 1 h, em gelo e tampão Tris/ acetato de potássio/ fosfato de potássio 50 mM. O pH foi ajustado com NaOH 2 M o HCl 2 M. Posteriormente à pré - incubação, foi realizada a dosagem em pH e temperatura ótimos, para determinação da atividade enzimática remanescente (Figura 9). A atividade da enzima sem pré- incubação foi considerada como 100 % .
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Figura 9. Estabilidade da xilanase de P. expansum, em diferentes pH, após 1h de pré-incubação. A atividade foi determinada em pH 5,5 e 40 0C.
0
20
40
60
80
100
120
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pH
Atividade relativa (
%)
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A xilanase parcialmente purificada mostrou-se estável quando pré-incubada em pH na faixa de 5,5-6,5. Em pH 7,0, 5,0 e 4,5 manteve 78 % , 87 % e 65 % da atividade máxima da enzima, respectivamente. Quando pré-incubada em pH 7,5, 8,0 e 8,5, manteve 68 % da atividade máxima da enzima. Em pH 9,0 permaneceu com 50 % da atividade máxima e em pH 4,0 manteve apenas 30 % .
A xilanase produzida por Thermophilus álcali-tolerantes mostrou-se estável em pH 5,5-9,5 (cepa SP) e pH 6,0-7,5 (cepa BC), após 30 minutos a 60 0C (PLAMEN et al., 1997).
4.6. Efeito de íons sobre a atividade enzimática
O efeito dos íons Mg+ 2 e Al+ 3, presentes em Mg3(PO4)2 (concentração final de
1 mM), MgSO4 (1 mM) e Al2(SO4)3 (1 mM), sobre a atividade da xilanase foi avaliado
através da adição dos mesmos ao substrato xilana, nos pH e temperatura ótimos. O Quadro 5 mostra o efeito de íons sobre a atividade da xilanase de P. expansum.
O íon Mg+ 2 aumentou a atividade da enzima em 34 % , quando em Mg3(PO4)2
(1 mM) e 31 % quando em MgSO4 (1 mM). O íon Al+ 3 presente em Al2(SO4)3 (1 mM)
aumentou a atividade da enzima em 28 % .
Para xilanases de Aspergillus ficheri Fxn1, o íon Mg+ 2 (10 mM) não alterou a atividade xilanolítica e o AlCl3 (10 mM) promoveu um decréscimo de 95 % da
atividade ótima (CHANDRA et al., 1996).
GHAREI B (1992) demonstraram que de Zn+ 2, Cu+ 2, K+ 1 e Co+ 2 aumentaram a atividade xilanolítica de Aspergillus terreus e que HgCl2, 2,4-dinitrophenol (DNP) e
diamino etileno tetra ácido acético (EDTA) inibiram fortemente a atividade xilanolítica, todos na concentração 1mM.
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Quadro 5. Efeito de íons sobre a atividade da xilanase de P. expansum parcialmente purificada.
Composto adicionado ( 1 mM) Atividade relativa ( % )
___________________________________________________________
Controle (sem adição) 100
Mg3(PO4)2 134
MgSO4 131
Al2(SO4) 3 128
___________________________________________________________
Aproximadamente um terço das enzimas conhecidas possuem metais como parte de sua estrutura, requerem a adição de metais para sua atividade ou são mais ativas na presença de metais. No primeiro caso, os metais fazem parte da estrutura molecular da enzima e não podem ser removidos sem destruir a estrutura. Tais enzimas incluem as metaloflavoproteínas, os citocromos e as ferro-proteínas não- hêmicas (ferredoxinas). Em outras situações, os metais reagem reversivelmente com proteínas para formar complexo metal-proteína, que constituem o catalisador ativo. Em muitas oportunidades, o complexo representa uma conformação específica, cataliticamente ativa da proteína, na qual o papel do metal parece ser o de estabilizar a conformação. Os metais se assemelham aos prótons (H+) quanto ao fato de serem eletrofílicos, pois são capazes de aceitar um par de elétrons para formar uma ligação química. Ao fazerem isto, os metais atuam como ácidos gerais para reagir com ligantes aniônicos e neutros. Seu tamanho relativamente grande em relação aos
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prótons constitui uma desvantagem, mas isto é compensado pela sua capacidade de reagir com mais de um ligante. Em geral os íons metálicos reagem com 2, 4 ou 6 ligantes (CONN e STUMPF, 1987).
4.7. Estudo cinético
Os parâmetros cinéticos Km e Vmax da xilanase parcialmente purificada foram determinados utilizando o método dos duplos-recíprocos (LI NEWEAVER e BURK, 1934). A xilanase comporta-se como uma enzima tipicamente Michaeliana, já que a representação gráfica dos duplos-recíprocos apresentou-se linear, como mostra a Figura 10-B. As constantes foram determinadas para o substrato xilana “oat spelt”. Os valores encontrados para Km e Vmax foram respectivamente de 3,03 mg de xilana mL-1 e 0,027 µmoles de açúcar redutor min-1 µg-1 de proteína.
Em trabalho realizado com Penicillium sp. crescido em meio extremamente ácido, pH 2,0 e xilana como única fonte de carbono, KI MURA (2000) demonstrou a produção de isoformas de xilanase. Foi observado que as isoformas de xilanase possuem diferenciados valores de Km e Vmax. Genes de xilanase de bactérias e fungos têm sido seqüenciados, e uma seqüência de nucleotídeos é conservada nos genes desses diferentes organismos. O autor atribuiu a essa seqüência o domínio catalítico ou o sítio de ligação do substrato ou as duas juntas. A presença do aminoácido histidina nesta região é altamente conservada em todas as xilanases, o que sugere que ele pode estar envolvido em funções catalíticas.
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A
B
Figura 10. A-Cinética da hidrólise de xilana pela xilanase. B-Representação gráfica de Lineweaver-Burk.
y = 108,98x + 36,713
0
10
20
30
40
50
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
1/[S]
1/V
0 0,01 0,02 0,03 0 10 20 30 40 50 60 [xilana] m g / m L U/micrograma de proteína43
O valor de Km da principal xilanase do fungo álcali tolerante Aspergillus
fischeri Fxn1 (CHANDRA et al., 1996), foi de 4,88 mg de xilana mL-1 e Vmax de 0,058 µmoles de açúcar redutor min-1 µg-1 de proteína.
Da mesma forma, os valores de Km da xilanase de Acrophialophora nainiana, determinados em xilana ‘birchwood’ solúvel e insolúvel foram de 40,9 e 16,1 mg de xilana mL-1, respectivamente (SALLES et al., 2000).
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