Antioksidan Aktivite Tayin Yöntemleri

Antioksidan aktivitenin belirlenmesi temel olarak hidrojen atomu transferi veya elektron transferine dayanarak yapılır. Birçok aktivite tayin yöntemleri bulunmaktadır. Bunlardan bazıları şunlardır:

ABTS katyon radikali giderim aktivitesi metodu (Re ve ark. 1999).

CUPRAC (Bakır (II) iyonu indirgeme antioksidan kapasitesi) metodu (Apak ve ark. 2004).

DCFH-DA (Diklorofloresin-diasetat) metodu (Valkonen ve Kuusi 1997). DPPH serbest radikali giderim aktivitesi metodu (Blois 1958).

FRAP (Demir (III) iyonu indirgeme antioksidan gücü) metodu (Benzie ve Strain 1996).

Folin Ciocalteu metodu (Singleton ve ark. 1999).

Fikoeritrin (PE) esaslı yöntemler (Ghiselli ve ark. 1995). Krosin metodu (Tubaro ve ark.1998).

29

Metal bağlama metodu (Dinis ve ark. 1994).

ORAC (Oksijen radikal absorbans kapasitesi) metodu (Prior ve Cao 1999). β-Karoten renk açılım metodu (Miller 1971).

Siklik voltametri metodu (Kohen ve ark. 1999).

Süperoksit anyon radikali giderim aktivitesi metodu (Liu ve ark. 1997).

TOSC (Toplam oksiradikal süpürme kapasitesi) metodu (Winston ve ark.1998). TRAP (Toplam radikal tutma parametresi) metodu (Wayner ve ark. 1985).

Kullanılan antioksidan metodlar şunlardır:

2.4.2.1. ABTS Katyon Radikali Giderim Aktivitesi Metodu

ABTS (2,2′-azinobis(3-etilbenzotiazolin-6-sülfonat)) oksidatif bir ajan (K2S2O8,

MnO2 ve H2O2 gibi) ile koyu yeşil veya mavi renkli monokatyon radikal şeklini (ABTS+)

alan bir kromojendir. Antioksidan özellik gösteren bir kimyasal ile reaksiyona girdiğinde ABTS+ radikal katyonu indirgenerek renksiz haline dönüşür. Burda katyonun dekolorizasyon derecesi yani renginin açılması indirgenme seviyesi ile ilgilidir. Bu özelliği sayesinde spektrofotometrik ölçümlerle antioksidan aktivite belirlenebilmekte ve antioksidan olduğu bilinen standartlar ile kıyas edilerek aktivite tayini yapılabilmektedir. Spektrofotometrik ölçümlerde ABTS+ _{nin reaksiyon sonucundaki absorbans değerinin}

düşmesi antioksidanın aktif olduğunu bildirmektedir (Sashidhara ve ark. 2011).

2.4.2.2. DPPH Serbest Radikal Giderim Aktivitesi Metodu

Bu metot, antioksidan bileşiklerin kararlı bir organik azot radikali olan DPPH’ın (1,1-difenil-2- pikrilhidrazil) serbest radikal giderim aktivitesini ölçme esasına dayanmaktadır (Şekil 2.24.). Rengi kırmızı olan DPPH radikalinin 515 nm’de en yüksek absorbsiyon değeri ölçülür. DPPH çözeltisine antioksidan eklenmesi ile absorbans değeri düşer ve antioksidanların varlığıyla radikalin rengi sarıya dönüşür. Genel olarak antioksidan özelliği araştırılan bitki ekstresinin DPPH ile etkileşmesinin 517 nm’de değerine ve standart madde ile kıyaslanması esasına bağlanmaktadır (Blois, 1958). Bu yöntemin dezavantajlarından biri 517 nm'de absorbsiyon yapan karotenoitler gibi bazı bileşiklerin analizinin zor olmasıdır. Antioksidan bileşiklerden bazıları, sterik engel

30

nedeniyle DPPH ile reaksiyona yavaş girerler veya giremezler. Bu sebep ile antioksidan kapasiteyi tam anlayabilmek için bu testin yanında başka testler de yapılmalıdır.

Şekil 2.24. DPPH radikalinin antioksidan ile reaksiyonu 2.4.2.3. β-Karoten Renk Açılım Metodu

β-Karoten renk açılım metodu iki metodla yapılabilmektedir: Agar difüzyon ve spektroskopik metot. Her iki metot da linoleik asit oksidasyonu neticesinde konjuge dien hidroperoksitlerin inhibisyonunun ölçülmesi esasına bağlanmaktadır. Oksijen ile doyurulmuş suya linoleik asit ve -karoten koyulur. Linoleik asitten oluşan radikaller (OH, OR, OOR, vs.), 490 nm'de maksimum absorbans veren β-karoteni parçalayarak renginin açılmasına neden olurlar. Antioksidanlar, oluşan radikalleri söndürerek β- karotenin renginin açılmasını önlemektedir (Huang ve ark. 2005).

2.4.2.4. CUPRAC Metodu (Bakır (II) İyonu İndirgeme Antioksidan Kapasitesi)

CUPRAC metodunda, Neokuproin (2,9–dimetil–1,10–fenantrolin) ve Cu (II) aynı ortama koyulur. Antioksidanın Cu (II)'yi indirgemesi sonucu oluşan Cu (I)'in neokuproin ile yaptığı kompleks 450 nm dalga boyunda maksimum absorbans verir (Apak ve ark. 2004).

2.5. Alzheimer Hastalığı

Alman psikiyatri doktoru Alois Alzheimer tarafından ilk kez 1907 yılında tanımlanan Alzheimer hastalığı; demansın en yaygın görülen türüdür, yaşlı insanlardaki hafıza eksikliği ve zihinsel bozulma ile anılan nörodejeneratif bir hastalıktır. Demans, günlük yaşamsal fonksiyonları etkileyen beyin hastalığı olarak bilinip, hafıza eksikliği, yaşamsal fonksiyonları gerçekleştirmede zorluk; idrak etmede, sosyal uyum yeteneğinde azalma, duygusal tepkilerin düzenlenmesinde bozulma gibi belirtilerle ifade edilmektedir.

31

Kesin bir tedavisi bulunmayan demansın en yaygın türü ise Alzheimer hastalığıdır (Parihar 2004). Hastalık toplumda öncelikle yaşlı insanlarda görülmektedir. Alzheimer hastalığı, insan beyninin hafıza ve öğrenmeden sorumlu bölgelerindeki kolinerjik sinir hücrelerinin kaybıyla ilgili olarak nörofibrillerin düğümlenmesi ve amiloitlerin meydana gelmesi olarak ifade edilmektedir. Sinir hücrelerinin kaybıyla doku hasarları oluşur ve bu da hafıza da kalıtsal sorunlara sebep olur. Bu bölgelerde patolojik protein birikimi görülür. Burdaki protein β-amiloit plaklardan oluşmaktadır (Selekler 2010).

İnsan beyninde iki çeşit kolinesteraz enzimi bulunmaktadır. Bunlar: 7. kromozomdaki bir gen ile kodlanan asetilkolinesteraz (AChE) ve 3. kromozom geni ile kodlanan butirilkolinesteraz (BChE) enzimidir (Savalev ve ark. 2004).

2.5.1. Asetilkolinesteraz (AChE) ve Butirilkolinesteraz (BChE) İnhibitörleri AChE insan beyninde özellikle erişkin bireylerde yaygın olarak görülürken, BChE sınırlı olarak görülmektededir. AChE enzimi vücut dokularının uyarılabilen kısmında bulunurken, BChE enzimi ise sinir sisteminin merkezi ve periferal kısımlarında, plazmada ve karaciğerde bulunmaktadır (Hartman 2010).

Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi (US Food and Drug Administrationi, FDA) aracılığı ile kolinesteraz inhibitörlerinin Alzheimer hastalığının uygulan ilk ilaç tedavisi olduğu ispat edilmiştir. Hastalık üzerindeki tedavi etkisi 6 ile 36 hafta süresince uygulanan tedavi sonucunda bilişsel fonksiyonlarda artma olduğu görülmüştür. Kolinesteraz enzimleri, hastalığa olumlu yönde etki etmesi ve engelleyici olarak etkisinin görülmesinden dolayı, Alzheimer hastalığının tedavisi için yeni bir ümit olmuştur (Raskin ve ark. 2004).

2.5.2. Kolinesteraz İnhibitörlerinin Alzheimer Hastalığındaki Mekanizması Kolinesteraz inhibitörleri, AChE enziminin katalizlediği asetilkolin sinir hücreleri taşıyıcılarının yıkımını durdururlar. AChE’nin temel aktivitesi hücrelerdeki kolinerjik sinapslarda asetilkolinin (ACh) hidrolize uğramasıyla sinir impulsunu sonlandırmaktır (Mukherjee ve ark. 2007). Alzheimer hastalarında asetilkolin miktarında azalma görülür ve bu sebeple beynin algılama ölçütünde risk oluşturmaktadır. Asetilkolin enzimi β- amiloit olarak adlandırılan plakaların oluşumuna pozitif etki eder ve AChE’nin işlevini artırarak bozunmasını engeller (Hu ve ark. 2003). Asetilkolinesteraz inhibisyonunun,

32

amilot başlatıcı proteini üreterek sinir hücrelerini muhafaza eden evrenin başlamasını sağladığı ifade edilmiştir (Standridge 2004).

Oksidatif stres biyomoleküllerin oksitlenmesine sebep olarak hücrelerin zarar görmesine neden olur. β-amiloitlerin dokulardaki birikimi oksidatif stres ile de birleştiğinde nöronlarda yapısal bozukluğa neden olur ve bu süreç işlevsel aksaklıklara, zihinsel sıkıntılara ve ölüme de neden olabilmektedir. Beyin hücrelerindeki bu süreç Alzheimer riskini yükseltmektedir (Hartman 2010).

Yapılan araştırmalarda Alzheimer hastalığının tedavi yöntemlerinde maksimum faydanın elde edildiği ilaç grubunun asetilkolinesteraz inhibitörleri olduğu görülmüştür. Fakat bu AChE inhibitörlerinin ilerleyen Alzheimer hastalığında kullanılmaması ve yan etkileri nedenleriyle yeni ilaçların arayışını elzem kılmıştır (Orhan ve ark. 2002). Diğer tedavi yöntemleri arasında ise en önde gelen ‘N-metil-D-aspartat’ (NMDA) reseptör antagonistleridir. Kolinesteraz inhibitörleri, hafıza ve düşünce ile alakalı nörotransmitter olan asetilkolinin parçalnmasını engellemeye yardımcı olmaktadırlar. NMDA reseptör antagonistleri de öğrenme ve hafıza işlevleri yönü ile önemli bir transmitter olan glutamatı düzenleyici etki göstermektedir (Hartman 2010).