Antioksidan Aktivite ve Miktar Tayinleri

Ekstraktların, serbest radikal giderim aktivitesi, ekstrakt içerisindeki antioksidan bileşiklerin hidrojenlerini verebilmelerine ve bileşiğin yapısal konformasyonuna bağlıdır. 1,1-difenil–2-pikrilhidrazil (DPPH), 517 nm de dalga boyu maksimum değere sahiptir ve bazı doğal bileşiklerin antioksidan aktivitesinin belirlenmesinde serbest radikal olarak kullanılmaktadır. DPPH serbest radikali, aşağıdaki tepkime gereği kararlı bir molekül olabilmek için antioksidan moleküllerden bir elektron ya da hidrojen radikalini kolaylıkla alabilmektedir.

DPPH˙ + A-H DPPH-H + A˙ (23) Bir serbest radikal olan DPPH’ın karakteristik mor rengi, bu tepkime gereği açılmaktadır. Burada sistemin absorbansının düşmesi ekstraktların serbest radikal süpürme yeteneğinin varlığını göstermektedir (Blois 1958).

108

Sarıkürkçü (2011) yaptığı çalışmada Cyclamen mirabile yapraklarında asetonlu, metanollü ve sulu ekstratlarındaki antioksidan aktivite 1 mg/mL’de sırasıyla % 61.52, % 53.07, % 88.25 bulmuştur. Okmen ve arkadaşları (2014) yaptığı çalışmada ise Cyclamen mirabile tuberlerindeki antioksidan aktivite metanollü ve etanollü ekstratlarında 60 mg/mL’de sırasıyla %77 ve %87 bulmuştur. Metin ve arkadaşları (2013) Cyclamen graecum üzerinde yaptığı çalışmada yaprak kısmında etanollü ekstratında bu değeri % 97.3 ± 0.55 bulmuştur. Bu çalışmada en yüksek serbest radikal giderim aktivitesi C. parviflorum türünün yer üstü kısmının 1 mg/mL konsantrasyonda hazırlanmış metanollü ekstresinde (% 91.39) tespit edilmiştir. En düşük serbest radikal giderim aktivitesi C. alpinum türünün yer altı kısmının 0.2 mg/mL konsantrasyonda hazırlanmış etanollü ekstraktında (% 13.11) gözlenmiştir. Çalışmadaki türler, BHA’ya göre nispeten daha zayıf olmasına rağmen, yine de güçlü bir radikal süpürme etkisi göstermektedir. Ayrıca bu deneyde, tür ekstraktları farklı konsantrasyonlarda hazırlanmış olup, konsantrasyon arttıkça serbest radikal giderim aktivitesinin de arttığı görülmüştür.

C. alpinum, C. parviflorum türlerinin etanol, metanol, ve aseton ekstraktlarının toplam antioksidan aktiviteleri, β-karoten-linoleik yöntemiyle belirlenmiştir. Bu yöntemde linoleik asit inkübasyonu sağlanmaktadır ve bu inkübasyon sırasında peroksitli ürünler oluşmaktadır. Bu ürünler serbest radikaller olup β–karotenle reaksiyona girerek, β–karotenin sarı rengini giderip absorbans değişimi spektroskopik olarak takip edilebilir hale getirmektedir. β–karotenin antioksidansız ortamda sarı rengi açılmakta ve absorbans değeri düşmektedir. Bu yöntemde, türlerin ekstraktı ilave edildiğinde β–karotenin karakteristik sarı rengi daha çok korunmaktadır. Bundan dolayı alınan sonuçların yüksek olması antioksidan aktivitenin de yüksek olduğunu göstermektedir. En yüksek değer C. parviflorum türünün yer üstü kısmının asetonlu ekstrelerinde (% 93.85) tespit edilmiştir. C. alpinum türünün yer üstü kısmının etanollü ekstraktının (% 62.4) antioksidan aktivitesi en düşük aktivite olarak hesaplanmıştır. Aydın ve arkadaşları (2015) Allium sibthorpianum ve Allium stylosum türlerinde yaptığı çalışmada en yüksek değer olarak % 85.87 ile A. sibthorpianum türünün soğan kısmının etanollü ekstratında, en düşük değer olarak % 45.72 ile A. sibthorpianum türünün yaprak kısmının petrol eteri ile yapılan ekstratında bulmuştur.

109

Aynı bitkilerden farklı çözücülerle elde edilen ekstraktların birbirlerinden çok farklı antioksidan aktivite göstermesinin sebebi olarak çözücülerin polariteleri gösterilebilir. Ekstraktların bu çeşitli antioksidan aktiviteleri, etkili hidrojen verme yeteneklerine ve serbest radikal giderişlerine bağlanabilir. Farklı yöntemler ve farklı polariteye sahip çözücülerle yapılan araştırmalarda % ekstrakt miktarları üzerinde polar çözücülerin apolar çözücülerden daha etkili olduğu görülmüştür (Özcan vd. 2007).

ABTS radikal giderme aktivitesi de antioksidan aktivitenin belirlenmesinde en fazla kullanılan yöntemlerden biridir (Zhang ve diğ. 2009). Bu metod uzun ömürlü bir radikal katyonu olan ABTS kromoforunun oluşumu ve bunun antioksidan tarafından giderilmesine dayanır. Bu değerin yüksek olması antioksidan aktivitenin yüksek olduğunu gösterir. Kompleks karışımlar ve saf bileşiklerin antioksidan aktivitelerinin tayininde en yaygın kullanılan organik radikallerden biri ABTS radikal katyonudur. Polifenollerin, ABTS radikalini giderme aktiviteleri bu polifonellerin antioksidan kapasitelerini belirlemede bir kriterdir (Osman ve diğ. 2006). Zengin ve arkadaşları (2015) yaptığı çalışmada Ornithogalum narbonense L. türünün gallik asit eşdeğeri (a) ve trolox eşdeğeri (b) tuber kısmında etil asetatlı ekstratında % 30.32 ± 1.62 (a) , metanollü ekstratında % 18.16 ± 1.21 (b), sulu ekstratında % 7.52 ± 0.64, kök kısmında etil asetatlı ekstratında % 19.24 ± 0.51(b) , metanollü ekstratında % 20.24 ± 1.02 (b), sulu ekstratında % 18.51 ± 0.25 (b) ve tohum kısmında etil asetatlı ekstratında % 0.88 ± 0.65, metanollü ekstratında % 7.59 ± 1.23, sulu ekstratında % 8.78 ± 1.89 bulmuştur. Bu çalışmada ABTS katyon radikali giderme aktivite testi sonucunda ekstraktlarının ABTS•+ radikali giderme aktivitelerinin konsantrasyona bağlı olarak arttığı ve metanol ekstrelerinin yüksek aktivite gösterdiği gözlendi. En yüksek radikal giderim aktivitesi C. parviflorum yer üstü kısmı metanol özütünde 40 mg/mL konsantrasyonda % 90.12 ile, en düşük aktivite ise C. parviflorum yer altı kısmı aseton özütünde 10 mg/mL konsantrasyonda % 30.56 ile tespit edilmiştir.

İndirgeme kapasitesi tayininde ekstraktlarının Fe+3_{’ü Fe}+2_{’ye indirgeyebilmesi} incelendi. İndirgeme gücü, bitkilerdeki antioksidan özelliğin önemli bir belirtecidir (Peksel ve diğ. 2006). Bir bileşiğin indirgeme kapasitesi onun elektron transfer edebilmesiyle ilişkilidir ve potansiyel antioksidan aktivitesinin önemli bir göstergesi olarak kabul edilir. Bu yöntemde, Fe+3_{/ferrisiyanür kompleksinin ferro formuna} dönüşmesi ile Prusya mavisi renk oluşur ve artan konsantrasyon ile rengin yoğunluğu da artmaktadır. Bu artışın yoğunluğu ölçülerek (absorbans) indirgeme kapasitesi

110

belirlenir. Ekstraktların indirgeme kapasitesinin konsantrasyona bağlı olarak arttığı gözlenmiştir. Ekstreler içinde metanol özütlerinin diğerlerine göre daha yüksek bir indirgeme gücüne sahip olduğu bulunmuştur. En yüksek değer C. parviflorum türünün yer üstü kısmının metanollü ekstrelerinde 1.98 absorbans değeriyle tespit edilmiş olup, en düşük değer 0.5 absorbans değeriyle C. alpinum türünün yer altı kısmının etanollü ve asetonlu ekstresinde görülmüştür. Zengin ve arkadaşları (2015) Cyclamen greacum türünde yaptığı çalışmada tuber kısmının etil asetatlı ekstratının 27.44 mg/g TEs , kök kısmının etil asetatlı esktratında 21.35 mg/g TEs, metanollü ekstratında 18.86 mg/g TEs bulmuştur. Uysal ve arkadaşları (2016) yaptığı çalışmada Mandragora autumnalis türünün çiçek kısmının asetonlu ekstratında 50.41 ± 0.16 mgTEs/g, metanollü ekstratında 90.88 ± 2.06 mgTEs/g ve yaprak kısmının asetonlu ekstratında 33.19 ± 0.86 mgTEs/g, metanollü ekstratında 53.29 ± 0.26 mgTEs/g bulmuştur. Eryiğit (2006) Mentha pulegium L. ve Salvia tomentosa Miller bitkileriyle yaptığı tez çalışmasında absorbans değerlerini M. pulegium türünün 1 mg derişiminde 1.309 ± 0.080, S. tomentosa türünün 1 mg derişiminde 2.258 ± 0.073 ve BHT’nin 2.522 ± 0.014 bulmuştur.

Toplam fenolik madde miktarı incelendiğinde gallik asite eşdeğer olarak en yüksek miktar Cyclamen parviflorum yer üstü kısmının aseton ekstraktında 9.12 mg/mL GAE bulunmuşken en düşük miktar ise Cyclamen alpinum yer altı kısmının etanol ekstraktında 7.42 mg/mL GAE olarak saptanmıştır. Tawaha ve arkadaşları (2007) Cyclamen persicum ile yaptığı deneyde sulu ekstratta 20.0 ± 2.5 mg/mL GAE ve metanollü ekstratta 17.0 ± 0.6 mg/mL GAE saptamışlardır. Sarıkürkçü (2011) Cyclamen mirabile yapraklarından prokateşol eşdeğeriyle, asetonlu ekstratından 37.36 μg PEs, metanollü ekstratından 21.06 μg PEs, sulu ekstratından 17.30 μg PEs bulmuştur. Metin ve arkadaşları (2013) Cyclamen graecum üzerinde yaptığı çalışmada yaprak kısmında etanollü ekstratında 33.73 ± 0.69 μg PEs, metanollü ekstratında 25.55 ± 0.45 μg PEs, asetonlu ekstratında 13.02 ± 0.20 μg PEs ve tuber kısmında etanollü ekstratında 21.81 ± 0.34 μg PEs, metanollü ekstratında 11.71 ± 0.79 μg PEs, asetonlu ekstratında 20.09 ± 0.47 μg PEs bulmuştur.

Antioksidanlar hidrojen atomu vericisi olarak etki gösterirler ve zincir oluşturan radikalleri daha az reaktif türlere dönüştürürler. Bu şekilde oluşan antioksidan radikali, oksijen atomu ile aromatik halka üzerindeki çiftleşmemiş elektronun yer değiştirmesiyle stabilize olur. Bu nedenle antioksidanlar moleküler yapılarında genellikle fenolik fonksiyon taşırlar. Flavonoidler; mantarlarda da görülen

111

bütün yüksek bitkilerde bulunan heterojenik ikincil metabolitlerin en geniş ve en bol olan gruplarından biridir. Flavonoidlerin antimikrobiyal, antitrombotik, antimutajenik, antikanserojenik gibi farmakolojik ve biyokimyasal aktivitelerde rol aldığı çeşitli çalışmalarla kanıtlanmıştır (Cook ve Samman 1996, Kandaswami ve Middleton 1997). Ekstraktlar toplam flavonoid miktarı açısından değerlendirildiğinde quercetin’e eşdeğer olarak en yüksek miktar Cyclamen alpinum yer üstü kısmının aseton ekstraktında (92.63 mgQE/g) en düşük miktar ise Cyclamen alpinum yer altı kısmının etanol ekstraktında (3.85 mgQE/g) olarak bulunmuştur. Flavonidler bazik özelliklere sahip bileşenlerdir ve bu tür bileşenlerin apolar çözücüler tarafından iyi çözülebildiği bilinmektedir. Bu açıdan aseton ile yapılan çözeltide C. alpinum yer üstü kısmında flavonoid bileşenlerin daha çok açığa çıktığı görülmektedir. Aynı zamanda yer üstü kısımlarda bitkinin çiçeklenme döneminde flavonoid miktarının maksimum düzeyde olduğu görülmüş olur. Uysal ve arkadaşları (2016) yaptığı çalışmada Mandragora autumnalis türünün çiçek kısmının asetonlu ekstratında 13.08 ± 0.70 mgRE/g, metanollü ekstratında 4.09 ± 0.10 mgRE/g, yaprak kısmının asetonlu ekstratında 3.60 ± 0.25 mgRE/g ve metanollü ekstratında 26.11 ± 0.09 mgRE/g bulmuştur.

Çalışma sonucunda C. alpinum ve C. parviflorum türlerinde yüksek antioksidan aktivite tespit edilmiştir ve bu türler için daha ayrıntılı kimyasal içerik çalışmalarının yapılması gerekliliğini ortaya koymaktadır.

4.2 YPSK (HPLC) Yöntemi İle Fenolik Bileşiklerin Elde Edilmesi ve