Sistemik fungal infeksiyonların sağaltımı amacıyla antifungallerin kullanımında artış, beraberinde direnç sorununu gündeme getirmiştir. Böylece antifungal duyarlılık testlerinin kullanımı ve önemi artmıştır. Bu testlerin uygulanmalarını arttıran nedenler şu şekilde sıralanabilir (98):
i) Ampirik antifungal kullanımında yol gösterici olmaları
ii) Kandidemi gibi olgularda uzun süreli sağaltımlar için uygun ilacın seçiminde belirleyici olmaları
iii) Tekraralayan mukozal hastalıklarda alternatif sağaltımların uygulanmasına yardımcı olmaları
1983 yılında ‛‛Clinical and Laboratory Standards Institute’’ (CLSI) tarafından kurulan bir alt komite mayalar ile ilgili antifungal duyarlılık testlerinin standardizasyonu çalışmalarına başlamış olup; 1992 yılında ilk referans yöntem olan buyyon makrodilüsyon yöntemini kabul ederek M27-P belgesini yayınlamıştır. Duyarlılık testleri üzerine etkili olan inokulüm büyüklüğü ve hazırlanması, inkübasyon zamanı ve ısısı, besiyeri içeriği ve pH’sı, son noktanın belirlenmesi gibi faktörlerle ilgili çalışmalar sonrasında M27-T belgesi açıklanmıştır (99,100).
1997 yılında M27-A ve 2002 yılında M27-A2 olarak bildirilen belgelerle kulanılmakta olan antifungaller için duyarlılık ve direnç sınırları belirtilerek mayalar için testler standardize edilmiştir (101). 2002 yılında CLSI flukonazol için disk diffüzyon testinin standartlarını M44- P olarak belirlemiştir (102). Küf mantarlarının duyarlılık testleri için ise M38-P belgesi kullanılmaktadır (99,100). “European Committee for Antimicrobial Suspectibility Testing” (EUCAST)’ın önerisi ise M27-A belgesi ile belirlenen mikrodilüsyon yöntemini, düz tabanlı plaklar ve %2 oranında glukoz ilaveli RPMI 1640 besiyeri kullanarak, 24 saatte spektrofotometrik olarak üremeye göre bulanıklığın %50 oranında azaldığı kuyucuktaki değerin MİK değeri olarak kabul edilmesi şeklindedir (103).
Antifungal duyarlılık testleri; dilüsyon ve difüzyon temeline dayalı yöntemler olarak iki grupta incelenebilir. Dilüsyon temeline dayanan testler; makrodilüsyon, mikrodilüsyon, kolorimetrik mikrodilüsyon ve yarı katı agar dilüsyon yöntemleridir. Difüzyon temeline dayanan testler ise disk difüzyon ve E test yöntemleridir. Ayrıca flovsitometrik ve ergosterol kantitasyonu gibi yöntemler de kullanılmaktadır (104–106).
4.8.1. Dilüsyon Temeline Dayalı Testler
4.8.1.1. Makrodilüsyon yöntemi
CLSI tarafından belirlenen M27-A2 standartları içerisinde Candida türleri için önerilen referans yöntemdir. Bu yöntemde besiyeri olarak son konsantrasyonu 0.165mol/L olacak şekilde MOPS ile oda ısısında tamponlanan L-glutaminli, sodyum bikarbonatsız ve pH indikatörü olarak fenol kırmızısı içeren RPMI 1640 sentetik besiyeri kullanılmaktadır (100,101). EUCAST son glukoz konsantrasyonunun %2 olmasının mayaların, MİK değerlerini değiştirmeden daha iyi üremesini sağlayarak MİK son noktasının saptanmasını kolaylaştırdığını belirtmektedir (103).
Candida türlerinde AmB direncinin saptanmasında RPMI 1640 besiyerine göre
“antibiotic medium 3” besiyerinin kullanılması önerilmektedir. Makrodilüsyon yöntemi zaman alıcı ve pahalı olduğundan az örnek sayısı için uygun görülmektedir (104-106). CLSI değerlendirmenin 48 saatlik 35°C deki inkübasyondan sonra AmB için gözle; azoller için gözle ve spektrofotometrik olarak yapılmasını önermektedir. AmB için, MİK değeri olarak, üremenin tam inhibe olduğu yani hiç bulanıklığın izlenmediği kuyucuktaki konsantrasyon
kabul edilir. 5 Flusitozin ve azoller için gözle okumada kontrol kuyucuğundaki üremeye göre bulanıklığın belirgin olarak azaldığı kuyucuktaki konsantrasyon MİK değeri olarak kabul edilirken spektrofotometrik olarak üremeye göre bulanıklığın %80 oranında (1/5 dilüsyonluk) azaldığı kuyucuktaki değer kabul edilmektedir (100,101).
4.8.1.2. Mikrodilüsyon yöntemi
Mikrodilüsyon yöntemi, yaklaşım olarak makrodilüsyon yöntemine benzer ancak makrodilüsyon yönteminin uygulama zorluklarından dolayı tercih edilmektedir. Bu yöntemde; U tabanlı 96 çukurlu mikrodilüsyon plakları, RPMI 1640 besiyeri, iki kat konsantrasyonda ilaç ve maya süspansiyonları kullanılır (105). CLSI, 24. ve 48. saatlerde gözle ve azoller için spektrofotometrik olarak değerlendirme önermektedir. Buna göre AmB için; üremenin tam inhibe olduğu yani bulanıklığın izlenmediği kuyucuktaki konsantrasyon, 5 flusitozin ve azoller için ise gözle okumada üreme kontrole göre bulanıklığın belirgin olarak azaldığı kuyucuktaki konsantrasyon ve de spektrofotometrik olarak üremeye göre bulanıklığın %50 oranında azaldığı kuyucuktaki değer MİK değeri olarak kabul edilmektedir (102–105). Flukonazol için 64 µg/ml ve üzerindeki MİK değeri saptanan izolatlar dirençli (R), 16-32 µg/ml arasındaki MİK değerleri doza bağımlı duyarlı (DBD) ve 8µg/ml ve altı ise duyarlı (D) olarak kabul edilmektedir (107,108).
4.8.1.3. Kolorimetrik mikrodilüsyon yöntemi
Bu yöntem, mikrodilüsyon yöntemine oksidasyon-redüksiyon indikatörü olan alamar mavisi, XTT veya MTT eklenmesi ile uygulanmaktadır. MİK değerlerinin daha kolay okunmasını ve daha objektif son nokta elde edilmesini sağlayan bir yöntemdir (104).
4.8.1.4. Yarı katı agar dilüsyon yöntemi
Yarı katı agar dilüsyon yöntemi, tarama yöntemi olarak kullanılabilen basit ve hızlı bir testtir. Besiyeri olarak %0.5 agar ve %2 dekstroz içeren beyin-kalp infüzyon yarı katı agarı kullanılır. Kalite kontrol ve diğer referans izolatlar ile yapılan çalışmalarda makrodilüsyon testi ile uyum gösterdiği bildirilmiştir (104). Ayrıca bir başka çalışmada, aynı miktarda agar
yöntemi ile sırasıyla %71 ve %79 oranlarında uyumlu sonuçlar elde edilmiştir (109). Provine ve arkadaşları (110) bu yöntemi ucuz ve tekrarlanabilir olması nedeniyle önermektedir.
4.8.2. Difüzyon Temeline Dayalı Testler
4.8.2.1. Disk difüzyon yöntemi
CLSI tarafından M44-P belgesinde standartlarının belirlendiği disk difüzyon yönteminde 25 ve 50 µg’lık flukonazol diskleri ile çeşitli besiyerlerinin kullanımının denendiği çeşitli çalışmalar bulunmaktadır (102,111,112). CLSI besiyeri olarak 0.5 µg/mL metilen mavisi eklenmiş Mueller-Hinton agarın kullanılmasını önermektedir (102). Flukonazol diskleri için sınır değerler CLSI tarafından >19duyarlı, 15-18mm DBD, <14mm dirençli olarak belirlenmiştir (102).
4.8.2.2. E test yöntemi
E test yöntemi, antifungal ajanın emdirildiği plastik şeritlerin kullanılarak MİK değerinin saptanabildiği bir difüzyon testidir. Pahalı olmasına rağmen uygulanması kolay bir yöntemdir. Azoller için fosfat tampon ile, AmB için MOPS ile tamponlanan ve %2 dekstroz eklenmiş RPMI 1640 agarın kullanılması önerilmektedir (104).
4.8.3. Diğer Yöntemler
4.8.3.1. Flovsitometrik yöntem
Flovsitometri yönteminde DNA’ya bağlanma yeteneği olan boyalar ile ölü ve canlı hücreler hızlıca birbirinden ayrılabilmektedir (105). AmB, flukonazol, ketokonazol ve 5-FC ile yapılmış olan uygulamalarında referans yöntem ile uyumlu sonuçlar alınmıştır (113).
4.8.3.2. Ergosterol kantitasyonu
Bu yöntemde, ergosterol sentezi kantitatif ölçülerek özellikle azol grubu ilaçların etkinliği araştırılır (105). C. albicans izolatlarında flukonazol duyarlılığının araştırıldığı bir
çalışmada ergosterol kantitasyonu ve buyyon mikrodilüsyon yöntemi ile elde edilen sonuçlar uyumlu bulunmuş; DBD ve R suşların ergosterol kantitasyonu ile birbirlerinden ayrılabildiği bildirilmiştir (114).