Agaroz jel elektroforezi ve PZR ürünlerinin görüntülenmes

32

Dışkının Makroskopik ve Mikroskopik İncelenmesi

Dışkı örneklerinin makroskobik görünümü (sulu, mukuslu veya kanlı olup olmadığı) incelenerek sulu, mukuslu veya kanlı olan örnekler çalışmaya dahil edildi. Hastaların yaşı, cinsiyeti ve daha fazla bilgi alabilmek için laboratuvar defter bilgileri ve hasta dosya numaraları kaydedildi.

Dışkı örnekleri, lam üzerinde bir damla serum fizyolojik içinde plastik bir çubuk yardımıyla homojen hale getirilerek ve üzerine temiz bir lamel kapatılarak mikroskobik incelemeye alındı. Hazırlanan preparat mikroskobun 40x’lık objektifinde, lökosit ve eritrosit varlığı, maya hücreleri ve normal flora bakterilerinin durumu bakımından incelendi ve sonuçlar kayıt edidi (35).

Dışkı Kültürü ve Escherichia coli’lerin Tanımlanması

Mikrobiyoloji laboratuvarına dışkı kültürü istemiyle gönderilen sulu, kanlı veya mukuslu olan dışkı örnekleri kanlı, EMB agar, SS agar, SMAC besiyerlerine tek koloni yöntemi ile ekilerek 37 ºC’de 24 saat tutuldu. Aynı dışkı örneklerinden Selenit F broth’a da ekim yapıldı ve 37 ºC’de 6-8 saat inkübasyondan sonra SS agara tek koloni ekim yöntemiyle yeniden kültürleri yapıldı. Enkübasyon sonrası tesbit edilen laktoz pozitif ve laktoz negatif kolonilerin TSI, LIA, sitrat, üre, triptofanlı besiyeri ve Fenilalanin agar besiyerlerine ekimleri yapılıp 37 ⁰C’de 24 saat inkübe edildi. Salmonella ve Shigella olduğu tespit edilen olgular çalışma kapsamı dışında bırakıldı. EMB agarda predominant E. coli üremesi olan örnekler çalışma kapsamında tutuldu. E. coli hakimiyeti olan, EMB agar besiyerinde laktoz pozitif veya laktoz negatif özellik gösteren, E. coli’ye benzeyen 3-5 farklı koloni seçilerek biyokimyasal testlere tabi tutuldu. Morfolojik olarak benzeyen kolonilerden tek örnek alındı.

E. coli tanımlaması TSI, LIA, sitrat, üre, triptofanlı besiyeri ve Fenilalanin Agar

besiyerlerindeki biyokimyasal özelliklere göre yapıldı. Tanımlanmakta güçlük çekilen kolonilerde VITEK 2 cihazı (BioMérieux, Fransa)’nda VITEK 2 GN tanımlama kartı (BioMérieux, Fransa ) ile bakteri tanımlaması yapıldı. E. coli olduğu tanımlanan koloniler - 80 °C’ de çalışma zamanına kadar saklandı (36).

Çalışmaya Alınacak Bakterilerin Belirlenmesi ve Saklanması

Bu reaksiyonlara göre E. coli olduğu belirlenen kolonilerden halka öze ile alınan örnekler 2’ şer adet Cryobank (Mast Diagnostics, Germany) saklama besiyerlerine alındı. -80

33

⁰C’ de çalışma zamanına kadar saklandı. Çalışma zamanında derin dondurucudan çıkarılarak çözünmesi beklenen bakteriler nutrient agara pasajlandı ve 37 ⁰C’ de 24 saat inkübe edildi.

Antiserumlarla Serogruplandırma

Serogruplandırma polivalan antiserumların prospektüslerine göre yapıldı. Dondurulmuş bakterilerin nutrient agar besiyerine ekimleri yapıldı. 18-24 saat 37 ⁰C’de etüvde (nüve EN 500) inkübe edildi. Üreyen kolonilerden 3-5 öze başı kadar alınarak 3 ml serum fizyolojik içinde 121 ⁰C’de 15 dk süre ile tutuldu. 900 g’de 20 dk santrifüj (Heraus Sepatech, Almanya) edildi. Üstte kalan kısım ayrıldı. Çöken kısım 0.5 ml serum fizyolojik içinde süspanse edildi ve antijen olarak kullanıldı. Temiz bir cam lam üzerine polivalan antiserumlardan Polivalan 1, Polivalan 2, Polivalan 3, Polivalan 6, Polivalan 7, Polivalan 8’in birinden 30 µl ve lamın diğer tarafına da serum fizyolojikten 30 µl pipetle damlatıldı. Hazırlanan bakteri süspansiyonundan lam üzerindeki antiserum ve serum fizyolojik üzerine 10 µl damlatılıdı. Lam üzerindeki karışım öne ve arkaya doğru 1 dk süreyle sallandı. Aglütinasyon olup olmadığı gözlemlendi. Çökelme lam floresan ışığına tutularak çıplak gözle değerlendirildi. Geç veya zayıf çökeltiler negatif olarak değerlendirildi. Testin doğrulanması için antijen süspansiyonu ile serum fizyolojiğin aglütine olmadığı gözlemlendi. Örnekler her bir polivalan antiserumla aynı şekilde test edildi. Polivalan 1, 2 veya 3 ile pozitiflik veren örnekler EPEC, Polivalan 6 ile pozitif sonuç veren örnekler ETEC, Polivalan 7 veya 8 ile pozitif sonuç verenler EİEC olarak değerlendirildi. Polivalan antiserumlarla pozitif sonuç veren örnekler ticari olarak elde edilen monovalan antiserumlarla (Statens Serum Instıtut, Danimarka) tüp aglütinasyon metodu ile test edildi (9).

Tüp Aglütinasyon Metodu

Monovalan antiserumlarla yapılan tüp aglütinasyonu antiserumların prospektüsüne göre yapıldı. Nutrient agar besiyerinde üretilmiş E. coli’ler pozitif verdiği polivalan antiseruma ait monovalan antiserumlarla test edildi. Nutrient agardan alınan bir koloni buyyona inoküle edildi. Bir gece 37 ⁰C’de inkübe edildi. Buyyon kültür >90 ⁰C üzerinde 1 saat süreyle kaynatıldı. Taze kaynatılmış kültür masanın üzerinde bakteriyel debrisin çökmesi için bekletildi ve antijen süspansiyonu olarak kullanıldı. Temiz bir serolojik cam tüpe 180 µl (3 damla) monovalan antiserum pipetle konuldu ve üzerine 180 µl buyyon kültürden eklendi.

34

Ayrı bir serolojik cam tüpe de 180 µl serum fizyolojik kondu ve üzerine aynı miktarda buyyon kültürden eklendi. Bu tüp negatif kontrol olarak kullanıldı.

Cam tüpler ortam neminde 52 ⁰C su banyosunda bir gece bekletildi. Reaksiyon siyah zemin üzerinde yapay ışık karşısında okundu. Cam tüpler reaksiyon değerlendirilmeden önce iyice sallandı. Cam tüplerde pozitif reaksiyon granüler görünüm olarak gözlemlendi. Negatif reaksiyon ise homojen sütlü bir bulanıklık olarak görüldü (9).

Deoksiribo Nükleik Asit İzolasyonu

Dondurulmuş bakteriler -80 ⁰C’den çıkarılarak nutrient agara ekimleri yapıldı. 18-24 saat 37 ⁰C’de inkübe edildi. Üreyen kolonilerden DNA izolasyonu High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche, ABD) ile kit prospektüsüne göre yapıldı.

İzolasyon işlemine başlanmadan önce %0.9’luk serum fizyolojik içinde 109 yoğunlukta bakteri süspansiyonu hazırlandı. Elution Buffer 70 ⁰C’de ısı bloğu(TECHNE DRI- BLOCK DB. 2A, İngiltere)’nda ısıtıldı. 1.5 ml’lik mikrosantrifüj tüpüne 109yoğunluktaki bakteri hücrelerinden 200 µl eklendi. 5 dk 3000 g’de santrifüj ( Galaxy 16 DH) edildi. Üstte kalan sıvı atıldı. Pellet 200 µl PBS ile süspanse edildi. Hazırlanan solüsyon içine daha önceden sulandırılmış olan lizozim (Roche, ABD)’den 5 µl ilave edildi. 15 dk 37 ⁰C’de inkübe edildi. Her örnek materyali için 200 µl binding buffer ve 40 µl proteinaz K solüsyonundan eklendi. Hızlı bir şekilde vorteksle karıştırıp 10 dk 70 ⁰C’de inkübe edildi. 100 µl isopropanol eklendi ve vorteksle karıştırıldı. Bir toplama tüpü içine yüksek filtreli bir tüp yerleştirildi. Elde edilen sıvı örneğinin tamamı filtreli tüpün içine aktarıldı. 8000 g’de 1 dk santrifüj edildi. Toplama tüpünden filtreli tüp çıkarıldı. Toplama tüpündeki sıvı toplama tüpü ile birlikte atıldı. Filtreli tüp yeni bir toplama tüpüne yerleştirildi. 500 µl inhibitör removal buffer filtreli tüpün rezervuarına konuldu. 1 dk 8000 g’de santrifüj edildi. Filtreli tüp toplama tüpünden çıkarıldı. İçindeki sıvı ile beraber toplama tüpü atıldı. Filtreli tüp yeni bir toplama tüpüne yerleştirildi. 500 µl washing buffer konuldu. 1 dk 8000 g’de santrifüj edildi. Toplama tüpü içinde kalan sıvı atıldı. Filtreli tüp yeni bir toplama tüpüne yerleştirildi. 500 µl washing buffer konuldu. 1 dk 8000 g’de santrifüj edildi. Santrifüj sırasında toplama tüpüne akan sıvı uzaklaştırıldı. Daha saf bir örnek elde etmek için 13000 g’de 10 sn santrifüj edildi. Toplama tüpü uzaklaştırıldı. DNA’yı elde etmek için filtreli tüp 1.5 ml’lik steril temiz bir mikrosantrifüj tüpünün içine yerleştirildi. Filtreli tüpün içine önceden ısıtılmış elution buffer’dan 200 µl konuldu. Tüp içeriği 1 dk 8000 g’de santrifüj edildi. Filtreli tüp atıldı. Mikrosantrifüj tüpü içnde bulunan DNA örneği kullanılıncaya kadar – 20 ⁰C’de saklandı.

35

Polimeraz Zincir Reaksiyonu İle Hedef Deoksiribo Nükleik Asitlerin Çoğaltılması Enteropatojenik E. coli, ETEC ve EİEC’e ait virulans genlerinin tanımlanması için elde edilen DNA örnekleri PZR ile incelendi. Serogruplandırma ile pozitif sonuç veren 29 örnek ve haritalama metodu ile seçilen negatif örneklerden de eşit sayıda alınarak PZR ile virulans genlerine bakıldı. EPEC’in tanımlanması için eaeA, bfpA ve stx primerleri, ETEC’in tanımlanması için estA ve eltB primerleri ve EİEC’ in tanımlanması için ial primeri kullanıldı.IDT (Integrated DNA Technologies, ABD) şirketinden temin edilen primerlerin oligonükleotid dizileri ve parantez içinde belirtilen PZR sonucu beklenen baz çifti (bp) uzunlukları şöyleydi:

1. eaeA primeri: 5’-CAC ACG AAT AAA CTG ACT AAA ATG-3’ (376bp) 5’-AAA AAC GCT GAC CCG CAC CTA AAT-3’

2. bfpA primeri: 5’-TTC TTG GTG CTT GCG TGT CTT TT-3’ (367 bp) 5’-TTT TGT TTG TTG TAT CTT TGT AA-3’

3. stx primeri: 5’-GAA CGA AAT AAT TTA TAT GT – 3’ (900 bp) 5’-TTT GAT TGT TAC AGT CAT -3’

4. ial primeri: 5’-CTG GTA GGT ATG CTG AGG-3’ (320 bp) 5’-CCA GGC CAA CAA TTA TTT CC-3’

5. eltB primeri: 5’- TCT CTA TGT GCA TAC GGA GC-3’ (322 bp) 5’- CCA TAC TGA TTG CCG CAA T-3’

6. estA primeri: 5’- GCT AAA CAA GTA GAG GTC TTC AAA A-3’ (147 bp) 5’- CCC GGT ACA GAG CAG GAT TAC AAC A-3’

Çalışılacak her bir örnek için PZR tamponu 20 µl’lik hacimde hazırlandı. Bu süspansiyon; 1xreaksiyon buffer (10xDream Taq Buffer Fermentas), 1.5 mmolar MgCl2

(Fermentas), 0.5 U Taq DNA polimeraz ( Fermentas), 160 µmolar dNTP ( Fermentas) ve her bir primerden 1.25 µmolar ile hazırlandı. Her örnek için ‘tin wall’ tüpüne 18 µl PCR tamponu dağıtıldı ve üzerine 20 nanogram DNA örneği ilave edildi. Amplifikasyon termocycler cihazı

36

(TECHNE TC 3000, ABD) ile aşağıdaki şekilde yapıldı: Başlangıç denatürasyonu 96 ºC’de 4 dk, 94 ºC’de 20 sn 55 ºC’de 20 sn ve 70 ºC’de 10 sn olmak üzere 30 döngü ve son uzatma 72 ºC’de 7 dk uygulandı. Ürünlerin döngülerin bitiminde korunması için programa +4°C’de saklama ilave edildi. Bu şekilde DNA çoğaltma aşaması tamamlanan örnekler agaroz jel elektroforez yapılana kadar +4°C’de tutuldu (37-40).

Agaroz Jel Elektroforez ve Polimeraz Zincir Reaksiyonu Ürünlerinin Görüntülenmesi

Önce 1X TBE tamponu ile %2 ’lik agaroz jel hazırlanıp, elektroforez tankına döküldü. Bu işlem için Wide mini- sub cell GT cell horizontal elektroforez cihazı (Biorad, Almanya) kullanıldı. Jelin her bir kuyucuğuna 10 µl örnek ile 2 µl yükleme boyası (Fermantas, ABD) karıştırılarak yüklendi. 1. kuyucuğa daha önce hazırlanmış 100 bp’lik DNA ladder (Fermentas, ABD) ve yükleme boyası karışımından 5 µl yüklendi. 1xTBE tamponu içinde yaklaşık 45 dk süre ile 90 voltta yatay elektroforez uygulandı. Etidyum bromid ile boyanan ürünler UV transilluminatörde gözlendi. Oluşan bantlar ‘Gel-doc’ sistemi yardımıyla bilgisayarda görüntülendi. PZR bir band veya uygun büyüklükteki bantların görülmesi, ekstra bantların görülmemesi ile pozitif kabul edildi.

Aşağıdaki E. coli kökenleri PZR çalışmasında pozitif kontrol olarak kullanıldı. eltB ve estA geni için; 35401-H10407 E. coli (ATCC, ABD), ial geni için; 43893-E. coli CDC EDL 1284 (929- 78) (ATCC, ABD), ve eaeA ve bfpA geninin tanımlanması için 43887-E.

coli CDC BAO (ATCC, ABD) pozitif kontrol olarak kullanıldı. eltB ve/veya estA geni

pozitif örnekler ETEC, ial geni pozitif örnekler EİEC olarak kabul edildi. Stx geninin tanımlanmasında ise bölümümüzde bulunan standart kökenlerden olan EDL933 kökeni kullanıldı. eaeA ve bfpA geni pozitif örnekler tipik EPEC, eaeA pozitif olup bfpA ve stx geni negatif olan örnekler atipik EPEC olarak kabul edildi. Bütün ölçümlerde 11775-E. coli-NCTC 9001 (ATCC, ABD) kökeni negatif kontrol olarak kullanıldı (37). PZR için kullanılan E.coli referans kökenleri ve hedef genler Tablo 3’de gösterilmiştir.

İstatistiksel Analiz

İstatistiksel analiz için Seri No’ su AXFOO3C775430FAN2 olan STATISTICA 7.0 programı kullanıldı. Verilerin istatistiği Ki-kare önemlilik testi ve Kolmogrov-Smirnov iki örnek testiile yapıldı. p<0,05 değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

37

Tablo 3. Polimeraz zincir reaksiyonu için kullanılan Escherichia.coli referans kökenleri ve hedef genler

Kategori Referans köken Hedef gen(ler)

ETEC ATCC 35401 eltB, estA

EHEC EDL933 Stx

EPEC ATCC 43887 eaeA, bfpA

EİEC ATCC 43893 İal

E.coli (negatif kontrol) ATCC 11775 Virülans geni yok

EPEC: Enteropatojenik Escherchia coli, ETEC: Enterotoksijenik Escherchia coli, eltB: Labil Toksin geni EİEC: Enteroinvazif Escherchia coli, EHEC: Enterohemorajik Escherichia coli, estA: stabil Toksin geni Stx:

Shiga toksin geni, eaeA:effacing and attaching geni, bfpA:bundle forming pilus geni, ial: invasion-associated locus geni.

38

BULGULAR

Toplam 9 aylık çalışma süresi içinde 1318 dışkı kültürü örneğinden seçilen 202 dışkı örneği çalışma kapsamına alındı. Bu örneklerden 254 E. coli kökeni elde edildi.

Escherichia coli’ lerin hakim olduğu 202 dışkı örneğinden izole edilen 29 (%14.35)

köken lam aglutinasyon yöntemi ile serogruplandırılabildi. Bunların 13 (%6.43)’ü EPEC, 5 (%2.47)’i ETEC, 11 (%5.44)’i de EİEC olarak tanımlandı. Çalışmaya alınan dışkı örneklerinde ishal yapan E.coli serogruplarının dağılımı Tablo 4’de gösterildi.

Tablo 4. Patojen kabul edilen ve patojen olmayan Escherichia coli’ lerin dağılımı

E. coli’ ler Sayı (n) Oran (%)

EPEC 13 6.43

ETEC 5 2.47

EİEC 11 5.44

Patojen olmayan E.coli’ ler 173 85.64

TOPLAM 202 100

EPEC: Enteropatojenik Escherchia coli; ETEC: Enterotoksijenik Escherchia coli, EİEC: Enteroinvazif Escherchia coli; E.coli: Escherichia coli.

Serogruplandırılan bakterilerin %44.82’si EPEC, %17.24’ü ETEC ve %37.93’ü de EİEC olarak belirlendi. Tek değişkenli ki- kare testi ile sonuçlar değerlendirildiğinde lam aglutinasyonu ile serogruplandırılan bakterilerin kendi aralarında dağılımında anlamlı bir fark saptandı (p<0.001). Bu fark ETEC’den kaynaklanmaktadır. ETEC’in EPEC ve EIEC’ ye

39

göre istatistiksel olarak daha az sıklıkta görüldüğü saptandı. Serogruplandırılabilen izolatların türlere göre dağılımı Tablo 5’de gösterildi.

Tablo 5. İzole edilen patojen bakterilerin dağılımı

Patojen Gruplar Sayı (n) Oran (%)

EPEC 13 44.82

ETEC 5 17.24

EİEC 11 37.93

TOPLAM 29 100

EPEC: Enteropatojenik Escherchia coli, ETEC: Enterotoksijenik Escherchia coli, EİEC: Enteroinvazif Escherchia coli.

Monovalan antiserumlar kullanılarak tüp aglutinasyon yöntemi ile O1 serogrubundan 5 köken belirlendi. Bu kökenlerin EPEC serogrubu içinde yer aldığı görüldü.

Patojen E. coli olarak serogruplandırılan 29 bakterinin 8’i (%27.5) çocuk, 21’i (%

72.5) erişkin hastalardan izole edildi. İzole edilen patojen E. coli serogruplarının çocuk ve erişkin hastalara göre dağılımı Tablo 6’da gösterildi.

Tablo 6. Patojen Escherichia coli’ lerin çocuk ve erişkin hastalara göre dağılımı

Patojen Gruplar Çocuk

n (%) Erişkin n (%) EPEC 5 (%38.5) 8 (%61.5) ETEC 2 (%40) 3 (%60) EİEC 1 (%9.1) 10 (%90.9) TOPLAM 8 (%27.6) 21 (%72.4)

EPEC: Enteropatojenik Escherchia coli, ETEC: Enterotoksijenik Escherchia coli, EİEC: Enteroinvazif Escherchia coli.

Kolmogorov- Smirnov iki örnek testi ile istastiksel olarak analiz edildiğinde serogruplandırılabilen patojen E. coli’lerin çocuk ve erişkinlerde görülme sıklığında anlamlı bir fark görülmedi. (p: 0.473). Bu test yapılırken satır yüzdeleri alınmıştır. İzole edilen patojen

40

Tablo 7. Serogruplandırılan bakterilerin cinsiyete göre dağılımı PATOJEN SEROGRUPLAR KADIN n (%) ERKEK n (%) TOPLAM n (%) EPEC 5 (%38.5) 8 (% 61.5) 13 (45) ETEC 3 (%40) 2 (%60) 5 (17) EİEC 5 (%45.5) 6 (%54.5) 11 (38) TOPLAM 13 (%45) 16 (%55) 29 (100)

EPEC: Enteropatojenik Escherchia coli, ETEC: Enterotoksijenik Escherchia coli, EİEC: Enteroinvazif Escherchia coli.

İzole edilen patojen E. coli serogruplarının kadın ve erkek cinsiyette görülme oranları Kolmogorov- Smirnov iki örnek testi ile analiz edildiğinde anlamlı bir fark görülmedi.(p:1). İzole edilen patojen E. coli serogruplarının yaşlara göre dağılımı incelendiğinde 8’i 0-16yaş, 12’si 16-60 yaş ve 9’u 60 yaş üzerindeki hastalardan izole edildi. 16 yaş altı ve 60 yaş üstü hastaların toplam sayısı tüm hastaların üçte ikisini oluşturuyordu. Patojen E. coli serogruplarının yaşlara göre dağılımı Tablo 8’de gösterildi.

Tablo 8. Patojen Escherichia coli’ lerin yaşlara göre dağılımı Patojen E. coli Serogrupları 0-16 YAŞ

N 16-60 YAŞ n 60 YAŞ ÜZERİ n EPEC 5 4 4 ETEC 2 2 1 EİEC 1 6 4 Toplam 8 12 9

EPEC: Enteropatojenik Escherchia coli; ETEC: Enterotoksijenik Escherchia coli, EİEC: Enteroinvazif Escherchia coli;

Serogruplandırılan bakterilerin aylara göre dağılımı grafik şeklinde Şekil 1 ‘de, liste halinde Tablo 9’da gösterilmiştir. Tüm ayları içeren örnekler alınamadığından mevsimlere göre EPEC, ETEC, EİEC serogruplarının dağılımları arasında önemli bir farklılık olup olmadığı istatistiksel olarak değerlendirilememiştir.

EPEC