4.1. Ação citotóxica, leishmanicida e hemograma
O P-MAPA não apresenta ação leishmanicida “in vitro” (Figura 1), uma vez que não houve diferença estatisticamente significante entre a viabilidade de parasita na presença ou na ausência de P-MAPA (P >0,05). O imunomodulador também não apresentou efeito tóxico em culturas de células, mesmo utilizando-se uma dosagem de 200µg/mL, visto que a queda da viabilidade celular não foi significativa (P>0,05) (Figura 2).
As dosagens das enzimas ALT e AST, quando comparadas antes e após o tratamento, não apresentaram diferenças significativas. A administração do imunomodulador também não provocou alterações significativas na contagem dos leucócitos totais e de suas subpopulações (resultados não mostrados). Os leucogramas de alguns cães tratados mostraram um aumento no número de células, apesar deste aumento não ser estatisticamente significativo, 4 cães apresentaram aumento de neutrófilos segmentados, 2 um aumento de linfócitos, 3 de monócitos e 6 de eosinófilos.
Também não houve alteração da dosagem das proteínas plasmáticas totais. Apesar de não apresentar diferença estatisticamente significante, os valores dos eritrócitos, hemoglobina e hematócrito apresentaram queda em seis animais do grupo tratado.
Figura 1 – O imunomodulador P-MAPA não apresentou alteração na viabilidade das formas de promastigotas de Leishmania chagasi após a estimulação “in vitro” em diferentes
concentrações (µg/mL). Como controle, foram utilizadas formas promastigotas mortas por congelamento.
Figura 2. A viabilidade de células mononucleares, de cães naturalmente infectados com Leishmania
chagasi, após estimulação in vitro com o imunomodulador P-MAPA não apresentou alterações
em diferentes concentrações (µg/mL). Como controle, foram utilizadas células mononucleares mortas.
4.2. Acompanhamento dos sinais clínicos
Nos cães do grupo tratado, o sintoma mais comum antes do inicio do tratamento, foi a presença da onicogrifose observada nos dez cães deste grupo, seguido de alopecia em nove cães. Em sete cães constatou-se o sub-peso, em seis a seborreia, e em cinco a ceratoconjuntivite seca. Com menor frequência, mas presente em pelo menos dois cães, foram observados a polidpsia, úlceras de pele, claudicação, pelame opaco, emese, hiporexia, nódulos cutâneos, diarréia, uveite, prurido cutâneo e apatia. Após o tratamento com o imunomodulador, a onicogrifose foi observada em seis cães e a alopecia em três. A presença de úlceras de pele ainda foi observada em dois cães e a uveite, nódulos cutâneos, claudicação e seborreia foram observadas em apenas um cão. Os demais sintomas não foram mais observados (Figura 3).
Figura 3: Sinais clínicos apresentados pelos 10 animais do grupo tratado, antes e depois do tratamento com o P- MAPA.
4.3. Avaliação da carga parasitária na pele no grupo tratado e controle
Os valores do ciclo linear (Treshold cycle -Ct), obtidos a partir de 2 µL de DNA de cada amostra, foram analisados tendo como referência a curva padrão obtida para a carga parasitária. A curva de quantificação da carga parasitária apresentou um coeficiente de correlação de (r2)= 0,98 e a reação apresentou um slope de -3,286. A carga parasitária do grupo controle foi maior do que a do grupo tratado ao final do período do estudo (Figura 4; p<0,05). A carga parasitária do grupo tratado mostrou uma redução significativa após o tratamento com o P-MAPA (p<0,05). A tabela 1 mostra os valores observados, através de análise das amostras de pele, da carga parasitária dos cães do grupo tratado antes e após o tratamento. Ϭ Ϯ ϰ ϲ ϴ ϭϬ ŶƚĞƐ ĞƉŽŝƐ
Tabela 1 - Carga parasitária das amostras de pele de cães do grupo tratado, naturalmente infectados por Leishmania spp., antes e após o tratamento com P-MAPA. Cão Antes Depois do tratamento Nº de Leishmania do tratamento Nº de Leishmania 1 2 3,6x105 2,6x103 1,6 x103 3,5 x102 3 4,1x103 2,9x104 4 8,1x105 2,9x104 5 3,4x106 2,0x104 6 6,3 x103 5,0 x 10-3 7 1,3 x 101 2,0x10-7 8 3,5x102 3,4x10-1 9 3,5x100 6,8x10-5 10 1,0x101 4,4x10-1 Média 4,5x 105 7,8x103 Desvio padrão 1,0x106 1,2 x104
Figura 4. Carga parasitária mediana pele de cães, do grupo controle e do grupo tratado, após 45 dias de tratamento com o imunomodulador P-MAPA. * Diferença estatisticamente significante entre os grupos analisados (p<0,05) pelo teste de Kruskal-Wallis.
4.4. Dosagem de IL2, IL-10 e INF-ࢺ
O ensaio para IL-10 apresentou um coeficiente de correlação (r2) =0,97 e sensibilidade de 40ng/mL. Houve redução significativa nos níveis de IL-10 no sobrenadante das culturas estimuladas com antígeno e no meio basal quando comparado ao sobrenadante dos grupos controle (Figura 5). O nível de INF-ࢺ (Figura 6) e IL-2 (Figura 7) no sobrenadante de cultura foi maior no grupo dos cães tratado quando comparado aos cães não tratados, sendo o aumento verificado nas culturas estimuladas com fitohemaglutinina e antígeno específico para Leishmania chagasi. O ensaio para INF-ࢺ apresentou uma sensibilidade de 45 ng/mL e r2=0,99 e para IL-2 um r2 = 0,99 e sensibilidade de 35ng/mL.
Figura 5. Produção de IL-10 em sobrenadante de cultura de células mononucleares de cães sintomáticos para LV não tratados (controle - cont) ou tratados (trat) com P-MAPA. Houve uma redução significativa na produção de IL-10 no sobrenadante de cultura de células mononucleares não estimuladas ou estimuladas com antígeno de Leishmania chagasi no grupo tratado. M = meio basal, Fito= fitohemaglutinina, Ag = antígeno. * Diferença estatisticamente significante.
Figura 6. Produção de INF-ࢺ em sobrenadante de cultura de células mononucleares de cães sintomáticos para LV não tratados (controle - cont) ou tratados (trat) com P-MAPA. Houve um aumento significativo na produção de INF-ࢺ no sobrenadante de cultura das células estimuladas com fitohemaglutinina ou estimuladas com antígeno de Leishmania chagasi no grupo tratado. M = meio basal, Fito= fitohemaglutinina, Ag = antígeno. * Diferença estatisticamente significante.
Figura 7. Produção de IL- 2 em sobrenadante de cultura de células mononucleares de cães sintomáticos para LV não tratados (controle - cont) ou tratados (trat) com P-MAPA. Houve um aumento significativo de produção de IL-2 no sobrenadante de cultura das células estimuladas com fitohemaglutinina ou estimuladas com antígeno de Leishmania chagasi do grupo tratado. M = meio basal, Fito= fitohemaglutinina, Ag = antígeno. * Diferença estatisticamente significante.
4.5. Imunofenotipagem dos linfócitos
A análise comparativa da porcentagem de células TCD4+ e TCD8+ antes do início do tratamento, em ambos os grupos, não apresentou diferença estatística significativa (resultados não mostrados). Após o tratamento foi observado um ligeiro aumento das células TCD4+, quando comparada ao grupo controle, porém sem significado estatístico (Figura 8). As células TCD8+ apresentaram um aumento significativo da porcentagem após o tratamento como mostra a Figura 8 (p<0,05).
Figura 8. Comparação das populações de células TCD4+ e TCD8+ entre os grupos controle (ct) e tratado (trat) após 45 dias de aplicação do imunomodulador P-MAPA. O aumento de linfócitos TCD8+ em sangue periférico de cães naturalmente infectados por Leishmania spp. do grupo tratado (trat) apresentou diferença estatisticamente significante (*).