A massa molecular médiada lectina purificada foi determinada através da técnica de espectrometria de massa com Ionização por Eletrospray (ESI). A análise do espectro de massa mostrou a presença de dois íons majoritários de massa molecular de 12.220+ 2 e 13.258 + 2 Da (Gráfico 5).
Gráfico 6- Espectro de massa deconvoluído mostrando a massa isotópica média das cadeias da ASL.
Os peptídeos oriundos das digestões com tripsina foram aplicados ao espectrômetro de massa e dados coletados foram processados e analisados utilizando o programa MassLynx v4.1 (Waters Corp) e ProteinLynx v2.4 (Waters Corp). Os peptídeos comuns a outras proteínas foram identificados por buscas em banco de dados utilizando ferramentas de pesquisa por padrão de fragmentação dos peptídeos nos programas ProteinLynx e MASCOT (Matrix Science). Foram encontrados peptídeos da ASL comuns aos da sequência da lectina de Bowringia mildbraedii, a qual foi utilizada como modelo para
ESI 10 PMOL 20 UL/MIN
mass
11600 11800 12000 12200 12400 12600 12800 13000 13200 13400 13600 13800 14000 14200 14400 14600 14800
%
0 100
20090910_A_RETUSA_02 1 (0.034) M1 [Ev-274760,It29] (Gs,0.750,500:2199,1.00,L33,R33) TOF MS ES+ 4.68e3 12220.0010 12213.0010 12189.0010 12119.0010 13258.0010 12236.0010 12243.0010 12302.0010 13187.0010 12323.0010 12337.0010 12403.0010 13329.0010 13367.0010 13443.0010 14350.0010 13748.0010 14333.0010 14541.0010 14747.0010
auxiliar no sequenciamento da ASL. Os demais peptídeos foram sequenciados manualmente por sequenciamento De novo utilizando a ferramenta PepSequence do programa MassLynx v4.1 (Waters Corp). Alguns dos petídeos que compõe a sequência parcial da ASL estão mostrados na Tabela 6.
Tabela 7- Sequência obtida por espectrometria de massa sequecial (MS/MS) dos peptídeos oriundos de digestão tríptica da ASL
BANDA M/Z (razão massa/carga)
MASSA
OBSERVADA MASSA CALCULADA PEPTÍDEO B6 476.75 951.4844 951.5178 ALYYAPVR
B4 674.86 1347.7043 1347.7285 PVLVSYDVELSK
B5 343.66 685.3044 685.3547 PEWVR
B5 421.75 841.4844 841.5021 VATVSLPR
A partir das sementes de Bowringia mildbraedii, espécie pertencente à tribo Sophoreae, foi isolada uma lectina manose/N-acetil-glicosamina específica, denominada BMA (CHAWLA et al.,1993). Como citado anteriormente, alguns peptídeos dessa proteína foram comuns àqueles encontrados para ASL e com base nesse achado a sequência da BMA serviu de molde para o sequenciamento parcial da ASL.
Essas duas lectinas, embora pertencentes a tribos diferentes da subfamília Papilionoideae apresentam outras características em comum, além das semelhanças verificadas em suas sequências primárias. Ambas mostram especificidade a resíduos de manose/N-acetil-glicosamina e os dados de massa intacta da BMA revelam a presença de duas espécies iônicas predominantes com massas moleculares de 13.596 e 12.115 Da, correspondendo às subunidades α e 2, respectivamente (CHAWLA et al.,1993). Esses
valores estão bem próximos daqueles encontrados para ASL (12.220+ 2 e 13.258 + 2 Da). A sequência primária de BMA também mostrou uma extensiva homologia com outras sequências de lectinas de leguminosas, tais como: ConA (Canavalia ensiformis), favina (Vicia faba), ECorL (Erythrina corallodendron), SBA (Glycine max) e UEA I (Ulex europaens). O sítio de proteólise pós-traducional do precursor de BMA ocorre em uma posição similar ao identificado em lectinas obtidas de outras espécies da tribo Sophoreae, tal como Sophora japonica, e em lectinas Diocleineae, como ConA, mas ele é diferente daquele encontrado em lectinas “a duas cadeias” (tribo Vicieae, por exemplo) obtidas de outras tribos da subfamília Papilionoideae (CHAWLA et al.,1993).
A composição polipeptídica de BMA mostra que ela é formada por um precursor de aproximadamente 29 kDa e que durante o processamento pós-traducional é clivado em dois fragmentos de aproximadamente 1γ,γ kDa (subunidade α) e 11,9 kDa (subunidade ). Essa subunidade corresponde ao N-terminal da proteína madura ( 1, 2 e 3), sendo que o
mais proeminente dos três é 2. A lectina assume a estrutura de um dímero (α )2 e as duas
subunidades componentes desse dímero encontram-se unidas através de uma ponte dissulfeto intercadeia.
A homologia na sequência de BMA e na sequência parcial de ASL reforçam a possibilidade de uma origem evolucionária em comum e sugere a manutenção de alguma função fisiológica ainda a ser determinada em estudos futuros. Além disso, o modelo de processamento pós-traducional de BMA poderia ser considerado para ASL, uma vez que o perfil eletroforético das duas lectinas é bem semelhante.
4.4 Avaliação do efeito da ASL sobre o crescimento bacteriano e formação de biofilmes
A ASL interferiu no crescimento planctônico de duas diferentes cepas bacterianas gram-positivas (Streptococcus mitis e Streptococcus salivarius) e na formação de biofilme por Staphylococcus aureus e Streptococcus salivarius.
ASL induziu o crescimento planctônico de Streptococcus mitis nas três maiores concentrações inicialmente testadas (1.000, 500 e 250 µg/mL) (Gráfico 6), enquanto que para Streptococcus salivarius, a lectina mostrou-se como um estímulo significante para o crescimento em todas as concentrações testadas (Gráfico 7).
Gráfico 7- Avaliação do potencial da lectina de sementes de Andira surinamensis (ASL) sobre o crescimento planctônico de Streptococcus mitis ATCC 903.
S. mitis ATCC 903 0 1000 500 250 125 62,5 31,25 15,6 0.0 0.5 1.0 1.5 *** *** *** [ ] ASL (g/mL) O. D . 620 n m
*** p < 0, 0001 estatisticamente significante em relação ao controle.
Gráfico 8- Avaliação do potencial da lectina de sementes de Andira surinamensis (ASL) sobre o crescimento planctônico de Streptococcus salivarius ATCC Salivarius.
S. salivarius ATCC Salivarius
0 1000 500 250 125 62,5 31,25 15,6 0.0 0.5 1.0 1.5 *** *** *** *** *** *** *** [ ] ASLg/mL O. D . 62 0 n m
*** p < 0, 0001 estatisticamente significante em relação ao controle.
No processo de formação de biofilmes, ASL mostrou induzir a biomassa da espécie Staphylococcus aureus nas duas maiores concentrações inicialmente testadas (1.000 e
500 µg/mL) (Gráfico 8). De maneira oposta, essa lectina diminuiu a formação de biofilmes da espécie gram-positiva Streptococcus salivarius em todas as concentrações testadas (Gráfico 9).
Gráfico 9- Avaliação do potencial antibiofilme da lectina de sementes de Andira surinamensis (ASL) sobre o desenvolvimento do biofilme de Stafilococcus aureus ATCC 25923.
S. aureus ATCC 25923 0 1000 500 250 125 62,5 31,25 15,6 0 1 2 3 *** *** [ ] ASLg/mL O. D. 5 90 n m
*** p < 0, 0001 estatisticamente significante em relação ao controle.
Gráfico 10- Avaliação do potencial antibiofilme da lectina de sementes de Andira surinamensis (ASL) sobre o desenvolvimento do biofilme de Streptococcus salivarius ATCC Salivarius.
*** p < 0, 0001 estatisticamente significante em relação ao controle.
S. salivarius ATCC Salivarius
0 1000 500 250 125 62,5 31,25 15,6 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 *** *** *** *** *** *** *** [ ] ASLg/mL O. D . 590 n m
Por outro lado, a ASL não interferiu no crescimento planctônico e na formação de biofilmes das demais cepas testadas (Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Streptococcus sobrinus ATCC 6715, Streptococcus sanguis ATCC 10556, Streptococcus sp. ATCC 15300, Streptococcus oralis ATCC 10557, Streptococcus mutans UA 159, Streptococcus pyogenes ATCC 19615) (dados não mostrados).
As bactérias, assim como quase todos os outros microorganismos, expressam carboidratos que ficam expostos na sua superfície. Esses carboidratos, tais como peptideoglicanos, ácidos teóicos e lipopolissacarídeos são sítios reativos potenciais para lectinas. Essas moléculas promovem a agregação direta de microorganismos em suspensão, devido à sua habilidade de formar complexos com os glicoconjugados da superfície bacteriana (SANTI-GADELHA et al., 2006). Lee e colaboradores (1998) examinaram interações entre lectinas de várias especificidades e várias espécies de Streptococcus orais. Eles observaram que certas lectinas apenas interagem com algumas espécies, indicando que lectinas podem ser usadas para agregação de determinados organismos alvos.
A ASL estimulou o crescimento planctônico de Streptococcus mitis e Streptococcus salivarius e esse comportamento pode ser decorrente da baixa/fraca especificidade de ligação dos carboidratos da superfície bacteriana à lectina em questão. Essa lectina é glicose/manose específica e os carboidratos que estão na superfície dessas bactérias provavelmente não estão expostos ou não estão disponíveis para interação com a lectina por conta de algum impedimento estérico, impossibilitando a interação lectina/carboidrato e a conseqüente inibição do crescimento planctônico.
Segundo Aas e colaboradores (2005), Streptococcus mitis é a bactéria comensal que se encontra em maior quantidade na cavidade oral de pessoas saudáveis. A microflora residente beneficia o hospedeiro por agir como parte das defesas dele e prevenir a colonização por microorganismos exógenos (e frequentemente patogênicos). Esse processo é conhecido por “colonização de resistência”. O conceito de mudança ecológica microbiana como um mecanismo para prevenir o dano dental é importante. Sendo assim, o aumento do crescimento de S. mitis poderia assegurar a manutenção saudável da superfície do dente e da cavidade oral, evitando a colonização desse ambiente por outra bactéria patogênica, como por exemplo, Streptococcus mutans.
O estímulo na formação do biofilme de Staphylococcus aureus ocorreu provavelmente pela necessidade de estabelecimento de uma espécie colonizadora inicial para a formação do biofilme. Uma vez que os carboidratos presentes na superfície bacteriana possivelmente não se ligam à ASL, a bactéria estabeleceria uma ligação com os componentes
salivares da película adquirida pelo esmalte, consolidando a adesão à superfície do dente para uma posterior formação do biofilme.
Segundo Wong e colaboradores (2010), as lectinas vegetais inibem o crescimento de microorganismos (bactérias, fungos) pela ligação aos carboidratos presentes na parede celular desses microorganismos, uma vez que elas não são capazes de se ligar às moléculas que estão nas membranas celulares ou penetrar no citoplasma devido à barreira formada pela parede celular. Sendo assim, a formação do biofilme de Streptococcus salivarius esteve comprometida pela presença da ASL, semelhante ao que foi visto por Teixeira e colaboradores (2006) e Cavalcante e colaboradores (2011) para outras lectinas de leguminosas glicose/manose específicas quando testadas contra diferentes espécies gram-positivas.
Um outro fato interessante foi observado para Streptococcus salivarius: ASL aumentou o crescimento planctônico dessa espécie e comprometeu a formação do biofilme. Segundo Liljemark; Schauer (1981) isso pode acontecer porque a formação de grandes agregados causa uma diminuição no número de bactérias aderentes e indica que acima de uma certa concentração de lectina, a atividade agregante da proteína não se opõe ao seu efeito bloqueador e ajuda a diminuir o número de Streptococcus aderentes.