Aşı Tarafından İndüklenen Sitokin Üretiminin Belirlenmesi

Tüm fare gruplarının dalaklarından izole edilen lenfositler Thoma lamında sayıldıktan sonra 1x106 hücre/ml olacak şekilde 24 kuyulu plate’re RPMI-1640 %5 FBS içeren ortama ekildi. Kültür ortamında her fare için antijenle uyarılmış ve uyarılmamış olmak üzere iki grup oluşturuldu. Uyarılmış olan gruplara 50 μg antijen verilirken diğer gruplara sade PBS verildi. Daha sonra %5 CO2 içeren etüvde 37°C’de 72 saat süreyle

inkübe edildikten sonra süpernatant alınıp sitokin ölçümü için -20°C’ye kaldırıldı [151].

3.5.11.1 İnterlökin 2 (IL-2) Üretiminin ELISA Yöntemi İle Belirlenmesi

Kaplama Antikorunun (Capture Antibody) Hazırlanması: 180 μg/mL sıçan anti-mouse

IL-2 1.0 mL PBS ile sulandırılır. Çalışma konsantrasyonu ise 180 μg/mL’lik stoktan 1 μg/mL olacak şekilde taşıyıcı protein kullanmadan PBS içinde hazırlanır.

Belirleyici Antikorun (Detection Antibody) Hazırlanması: 72 μg/mL biyotin bağlı goat

anti-mouse IL-2 1.0 mL Reagent Diluent ile sulandırılır. Çalışma konsantrasyonu ise 72 μg/mL’lik stoktan 400 ng/mL olacak şekilde taşıyıcı protein kullanmadan Reagent Diluent içinde hazırlanır.

Standardın Hazırlanması: 100 ng/mL rekombinant fare IL-2 olacak şekilde ticari alınan

tüp 0,5 ml Reagent Diluent ile sulandırılır. 15 dakika yavaşça çalkalandıktan sonra 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400, ve 800 pg/mL olacak şekilde Reagent Diluent ile seri sulandırmalar yapılarak standart hazırlanır.

IL-2 İçin ELISA Plate’in Hazırlanması

Kaplama antikoru ile hazırlanan çalışma solusyonundan 96’lık ELISA plate’ine 100 μl eklenerek bir gece oda sıcaklığında inkübasyona bırakılır. Kaplama antikoru ELISA plate’in yüzeyini kapladıktan sonra 3 kez yıkama tamponu ile yıkama yapılır. Daha sonra her kuyucuğa 300 μl bloklama tamponu eklenerek en az bir saat oda sıcaklığında inkübasyona bırakılır. İnkübasyon sonrası 3 kez yıkama tamponu ile yıkanır böylece plate örnek eklemeye hazırdır.

80

Daha önce fare dalak örneklerinden izole edilen lenfosit kültüründen alınan süpernatant örnekleri ile hazırlanan standartlardan 100 μl alınarak IL-2 için hazırlanmış plate’lere eklenerek 2 saat oda sıcaklığında inkübasyona bırakılır. Bu işlemden sonra 3 kez yıkama tamponu ile yıkama yapılır. Daha sonra her kuyuya 100 μl Biotin bağlı belirleyici antikor eklenir. Bu işlemden sonra da 3 kez yıkama tamponu ile yıkama yapılır. Daha sonra Streptavidin-HRP solusyonundan 100 μl eklenerek Biotin- Streptavidin bağlanması için 20 dakika ışıksız ortamda oda sıcaklığında beklenir. Bu işlemden sonra da 3 kez yıkama tamponu ile yıkama yapılır. Daha sonra 100 μl substrat solusyonu eklenerek dakika ışıksız ortamda oda sıcaklığında beklenir. Bu aşamadan sonra enzim substrat reaksiyonunu durdurmak için 50 μl durdurma solusyonu eklenir ve yavaşça karıştırılır. Son olarak optik yoğunluğu ölçmek üzere 96 kuyucuklu plağın kapağı açılarak 450 nm dalga boyuna ayarlanmış ELIZA cihazına yerleştirildi ve cihazın optik ölçüm sonuçları bilgisayar ortamından alındı.

3.5.11.2 İnterferon-γ (IFN-γ) Üretiminin ELISA Yöntemi İle Belirlenmesi

Kaplama Antikorunun (Capture Antibody) Hazırlanması: 720 μg/mL sıçan anti-mouse

IFN-γ 1.0 mL PBS ile sulandırılır. Çalışma konsantrasyonu ise 720 μg/mL’lik stoktan 4 μg/mL olacak şekilde taşıyıcı protein kullanmadan PBS içinde hazırlanır.

Belirleyici Antikorun (Detection Antibody) Hazırlanması: 18 μg/mL biyotin bağlı goat

anti-mouse IFN-γ 1.0 mL Reagent Diluent ile sulandırılır. Çalışma konsantrasyonu ise 18 μg/mL’lik stoktan 100 ng/mL olacak şekilde taşıyıcı protein kullanmadan Reagent Diluent içinde hazırlanır.

Standardın Hazırlanması: 205 ng/mL rekombinant fare IFN-γ olacak şekilde ticari

alınan tüp 0,5 ml Reagent Diluent ile sulandırılır. 15 dakika yavaşça çalkalandıktan sonra 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400, ve 800 pg/mL olacak şekilde Reagent Diluent ile seri sulandırmalar yapılarak standart hazırlanır.

IFN-γ İçin ELISA Plate’in Hazırlanması

Kaplama antikoru ile hazırlanan çalışma solusyonundan 96’lık ELISA plate’ine 100 μl eklenerek bir gece oda sıcaklığında inkübasyona bırakılır. Kaplama antikoru ELISA

81

plate’in yüzeyini kapladıktan sonra 3 kez yıkama tamponu ile yıkama yapılır. Daha sonra her kuyucuğa 300 μl bloklama tamponu eklenerek en az bir saat oda sıcaklığında inkübasyona bırakılır. İnkübasyon sonrası 3 kez yıkama tamponu ile yıkanır böylece plate örnek eklemeye hazırdır.

IFN-γ için Örnek ve Standartların Eklenerek Ölçümün Yapılması

Daha önce fare dalak örneklerinden izole edilen lenfosit kültüründen alınan süpernatant örnekleri ile hazırlanan standartlardan 100 μl alınarak IFN-γ için hazırlanmış plate’lere eklenerek 2 saat oda sıcaklığında inkübasyona bırakılır. Bu işlemden sonra 3 kez yıkama tamponu ile yıkama yapılır. Daha sonra her kuyuya 100 μl Biotin bağlı belirleyici antikor eklenir. Bu işlemden sonra da 3 kez yıkama tamponu ile yıkama yapılır. Daha sonra Streptavidin-HRP solusyonundan 100 μl eklenerek Biotin- Streptavidin bağlanması için 20 dakika ışıksız ortamda oda sıcaklığında beklenir. Bu işlemden sonra da 3 kez yıkama tamponu ile yıkama yapılır. Daha sonra 100 μl substrat solusyonu eklenerek dakika ışıksız ortamda oda sıcaklığında beklenir. Bu aşamadan sonra enzim substrat reaksiyonunu durdurmak için 50 μl durdurma solusyonu eklenir ve yavaşça karıştırılır. Son olarak optik yoğunluğu ölçmek üzere 96 kuyucuklu plağın kapağı açılarak 450 nm dalga boyuna ayarlanmış ELIZA cihazına yerleştirildi ve cihazın optik ölçüm sonuçları bilgisayar ortamından alındı.

3.5.11.3 İnterlökin 4 (IL-4) Üretiminin ELISA Yöntemi İle Belirlenmesi

Kaplama Antikorunun (Capture Antibody) Hazırlanması: 720 μg/mL sıçan anti-mouse

IL-4 1.0 mL PBS ile sulandırılır. Çalışma konsantrasyonu ise 720 μg/mL’lik stoktan 4 μg/mL olacak şekilde taşıyıcı protein kullanmadan PBS içinde hazırlanır.

Belirleyici Antikorun (Detection Antibody) Hazırlanması: 108 μg/mL biyotin bağlı goat

anti-mouse IL-4 1.0 mL Reagent Diluent ile sulandırılır. Çalışma konsantrasyonu ise 108 μg/mL’lik stoktan 600 ng/mL olacak şekilde taşıyıcı protein kullanmadan Reagent Diluent içinde hazırlanır.

Standardın Hazırlanması: 180 ng/mL rekombinant fare IL-4 olacak şekilde ticari alınan

82

3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400, ve 800 pg/mL olacak şekilde Reagent Diluent ile seri sulandırmalar yapılarak standart hazırlanır.

IL-4 İçin ELISA Plate’in Hazırlanması

Kaplama antikoru ile hazırlanan çalışma solusyonundan 96’lık ELISA plate’ine 100 μl eklenerek bir gece oda sıcaklığında inkübasyona bırakılır. Kaplama antikoru ELISA plate’in yüzeyini kapladıktan sonra 3 kez yıkama tamponu ile yıkama yapılır. Daha sonra her kuyucuğa 300 μl bloklama tamponu eklenerek en az bir saat oda sıcaklığında inkübasyona bırakılır. İnkübasyon sonrası 3 kez yıkama tamponu ile yıkanır böylece plate örnek eklemeye hazırdır.

IL-4 için Örnek ve Standartların Eklenerek Ölçümün Yapılması

Daha önce fare dalak örneklerinden izole edilen lenfosit kültüründen alınan süpernatant örnekleri ile hazırlanan standartlardan 100 μl alınarak IL-4 için hazırlanmış plate’lere eklenerek 2 saat oda sıcaklığında inkübasyona bırakılır. Bu işlemden sonra 3 kez yıkama tamponu ile yıkama yapılır. Daha sonra her kuyuya 100 μl Biotin bağlı belirleyici antikor eklenir. Bu işlemden sonra da 3 kez yıkama tamponu ile yıkama yapılır. Daha sonra Streptavidin-HRP solusyonundan 100 μl eklenerek Biotin- Streptavidin bağlanması için 20 dakika ışıksız ortamda oda sıcaklığında beklenir. Bu işlemden sonra da 3 kez yıkama tamponu ile yıkama yapılır. Daha sonra 100 μl substrat solusyonu eklenerek dakika ışıksız ortamda oda sıcaklığında beklenir. Bu aşamadan sonra enzim substrat reaksiyonunu durdurmak için 50 μl durdurma solusyonu eklenir ve yavaşça karıştırılır. Son olarak optik yoğunluğu ölçmek üzere 96 kuyucuklu plağın kapağı açılarak 450 nm dalga boyuna ayarlanmış ELIZA cihazına yerleştirildi ve cihazın optik ölçüm sonuçları bilgisayar ortamından alındı.

3.5.11.4 İnterlökin 4 (IL-4) Üretiminin ELISA Yöntemi İle Belirlenmesi

Kaplama Antikorunun (Capture Antibody) Hazırlanması: 720 μg/mL sıçan anti-mouse

IL-10 1.0 mL PBS ile sulandırılır. Çalışma konsantrasyonu ise 720 μg/mL’lik stoktan 4 μg/mL olacak şekilde taşıyıcı protein kullanmadan PBS içinde hazırlanır.

83

Belirleyici Antikorun (Detection Antibody) Hazırlanması: 72 μg/mL biyotin bağlı goat

anti-mouse IL-4 1.0 mL Reagent Diluent ile sulandırılır. Çalışma konsantrasyonu ise 72 μg/mL’lik stoktan 400 ng/mL olacak şekilde taşıyıcı protein kullanmadan Reagent Diluent içinde hazırlanır.

Standardın Hazırlanması: 50 ng/mL rekombinant fare IL-4 olacak şekilde ticari alınan

tüp 0,5 ml Reagent Diluent ile sulandırılır. 15 dakika yavaşça çalkalandıktan sonra 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400, 800, 1600 ve 3200 pg/mL olacak şekilde Reagent Diluent ile seri sulandırmalar yapılarak standart hazırlanır.

IL-10 İçin ELISA Plate’in Hazırlanması

Kaplama antikoru ile hazırlanan çalışma solusyonundan 96’lık ELISA plate’ine 100 μl eklenerek bir gece oda sıcaklığında inkübasyona bırakılır. Kaplama antikoru ELISA plate’in yüzeyini kapladıktan sonra 3 kez yıkama tamponu ile yıkama yapılır. Daha sonra her kuyucuğa 300 μl bloklama tamponu eklenerek en az bir saat oda sıcaklığında inkübasyona bırakılır. İnkübasyon sonrası 3 kez yıkama tamponu ile yıkanır böylece plate örnek eklemeye hazırdır.

IL-10 için Örnek ve Standartların Eklenerek Ölçümün Yapılması

Daha önce fare dalak örneklerinden izole edilen lenfosit kültüründen alınan süpernatant örnekleri ile hazırlanan standartlardan 100 μl alınarak IL-10 için hazırlanmış plate’lere eklenerek 2 saat oda sıcaklığında inkübasyona bırakılır. Bu işlemden sonra 3 kez yıkama tamponu ile yıkama yapılır. Daha sonra her kuyuya 100 μl Biotin bağlı belirleyici antikor eklenir. Bu işlemden sonra da 3 kez yıkama tamponu ile yıkama yapılır. Daha sonra Streptavidin-HRP solusyonundan 100 μl eklenerek Biotin- Streptavidin bağlanması için 20 dakika ışıksız ortamda oda sıcaklığında beklenir. Bu işlemden sonra da 3 kez yıkama tamponu ile yıkama yapılır. Daha sonra 100 μl substrat solusyonu eklenerek dakika ışıksız ortamda oda sıcaklığında beklenir. Bu aşamadan sonra enzim substrat reaksiyonunu durdurmak için 50 μl durdurma solusyonu eklenir ve yavaşça karıştırılır. Son olarak optik yoğunluğu ölçmek üzere 96 kuyucuklu plağın kapağı açılarak 450 nm dalga boyuna ayarlanmış ELIZA cihazına yerleştirildi ve cihazın optik ölçüm sonuçları bilgisayar ortamından alındı.

84