Şerif Hüseyin ile Yazışmalar ve Hicaz Sefer Kuvveti

O modo de ação das proteínas Cry envolve diversas etapas, como: ingestão do complexo esporo-cristal pela larva suscetível, solubilização e processamento da toxina, ligação ao receptor, inserção na membrana, formação do poro e citólise. As proteínas Cry apresentam–se na forma de pró–toxinas e precisam ser ativadas por proteases para liberarem fragmentos tóxicos (SCHNEPF et al.,1998; MONNERAT; BRAVO, 2000).

Para que ocorra a solubilização da pró–toxina, ela deve entrar em contato com o pH alcalino do intestino médio das larvas de insetos alvo (KNOWLES, 1994). Diferenças na solubilização podem contribuir para determinar as alterações no grau de toxicidade entre as proteínas Cry (ARONSON et al., 1991). Após a solubilização é necessário o processamento das pró–toxinas por proteases especiais presentes no intestino médio do inseto, para que ocorra a liberação do fragmento tóxico (TOJO; AIZAWA, 1983). A clivagem proteolítica é um fator importante que pode contribuir para determinar a especificidade; o principal tipo de protease digestiva em insetos das ordens Lepidoptera e Diptera é o tipo serino– protease, enquanto que para Coleoptera são, principalmente, cisteíno e aspártico– proteases (DE MAAGD; BRAVO; CRICKMORE, 2001).

Após serem ativadas, as proteínas Cry passam através da membrana peritrófica do intestino médio, um revestimento de proteção, e chegam ao local- alvo e se unem a receptores específicos presentes nas microvilosidades das células colunares do intestino médio das larvas dos insetos suscetíveis (ZHANG et al., 2012). As toxinas Cry interagem com receptores específicos, sendo um fator importante para a toxicidade e especificidade, determinando o espectro de ação das -endotoxinas (MONNERAT; BRAVO, 2000; DE MAAGD; BRAVO; CRICKMORE, 2001; BRAVO; GILL; SOBERÓN, 2007). Ocorre então a formação

de poros que conduzem a lise celular e o extravasamento do conteúdo intestinal para a hemocele (COPPING; MENN, 2000; PRAÇA et al., 2004). Alternativamente, a ligação das toxinas Cry com a proteína caderina no intestino médio poderia ser ativada por uma via de sinalização celular, levando a morte da célula (ZHANG et al., 2005; ZHANG et al., 2006).

Os sintomas de intoxicação nos insetos são: paralização na alimentação, paralisia do intestino, vômito, diarreia, paralisia total e posterior septicemia, levando o inseto à morte (GUPTA et al., 1985; BRAVO; JANSENS; PEFEROEN, 1992; MONNERAT; BRAVO, 2000).

Embora muitos insetos sejam suscetíveis às toxinas Cry, o modo de ação do Bt ainda não está bem definido. Após a ingestão de esporos/cristais pelo inseto, os cristais são dissolvidos e, em seguida, em maior ou menor grau, são clivados por proteases digestivas e transformados em toxinas ativas. Estas toxinas passam através da membrana peritrófica, ligando-se a receptores específicos localizados na membrana apical das células colunares do intestino médio, formando poros na membrana. A formação desses poros acarreta na interferência da fisiologia da célula, mediante a supressão dos gradientes iônicos trans- membrânicos, o que pode levar à lise coloido-osmótica das células devido a um influxo massivo de solutos no lúmen do intestino médio. Por sua vez, a destruição das células resulta em grande dano para o tecido epitelial do intestino médio e morte das larvas intoxicadas. Os insetos também podem sofrer por inanição, já que, logo após a ingestão da toxina, o inseto deixa de se alimentar (COPPING; MENN, 2000; CRICKMORE, 2006; JURAT-FUENTES; JACKSON, 2012; VACHON; LAPRADE; SCHWARTZ, 2012).

Nos últimos anos, um modelo elaborado envolvendo a ligação sequencial das toxinas a diferentes receptores de membrana foi proposto para descrever os acontecimentos que conduzem à inserção da membrana e formação de poros. No entanto, também foi proposto que, em contradição a esse mecanismo, toxinas Bt funcionam por meio da ativação de vias de sinalização intracelular que conduzem à morte necrótica das suas células-alvo, sem a necessidade de formação de poros (BRAVO; GILL; SOBERÓN, 2007). Vachon, Laprade e Schwartz (2012)

apontaram que as informações disponíveis ainda apoiam a ideia de que as toxinas Bt agem por meio da formação de poros, mas a maioria dos eventos que levam à sua formação, após a ligação das toxinas ativas nos receptores, permanecem pouco conhecidos.

Por outro lado, a resistência dos insetos à ação das proteínas Cry tornou-se mais complexa, pois mutações no gene que codifica um transportador do gene ABCC2 são responsáveis pela resistência às toxinas Bt em quatro espécies de insetos (HERNANDEZ-MARTINEZ et al., 2012; HECKEL, 2012).

A superfamília de proteínas ABC leva o seu nome a partir da ligação com o ATP, um domínio intracelular que se liga e hidrolisa ATP em um ciclo que leva o transporte de moléculas através de uma membrana de bicamada lipídica. O transportador funcional consiste em dois domínios de ligação nucleotídeo citosólico (NBDs) que se ligam e hidrolisam ATP e dois domínios trans- membrânicos integrais (HECKEL, 2012). A função biológica do gene ABCC2 é desconhecida, mas sua semelhança com proteínas de resistência a múltiplas drogas sugere que poderia exportar pequenas toxinas hidrofóbicas, a partir de células epiteliais do intestino médio, para a eventual eliminação nas fezes.

Heckel (2012) especula que o gene ABCC2 poderia funcionar como uma das proteínas de ligação no modelo de ligação sequencial discutida por Bravo (2007) e, ainda, propõe que a ligação da toxina com o gene ABCC2 apenas ocorre quando o transportador se encontra na sua configuração aberta. Quando o transportador fecha, a toxina é empurrada para dentro da membrana. Essa interação transitória entre a toxina e gene ABCC2 pode explicar por que este gene ainda não foi identificado como uma proteína de ligação de toxinas. Hernandez- Martinez et al. (2012) sugeriram um modelo alternativo em que o gene ABCC2 estaria afetando indiretamente o mecanismo de ação das toxinas Bt . Mutações no gene que codifica ABBC2 afeta sua função, que, na sequência, afeta a fisiologia da célula, de forma que na sequência interfere na capacidade da toxina Bt em formar o poro. Ambos os trabalhos concluem que o papel funcional da proteína ABCC2 ainda não foi estabelecido, mas que mutações têm claramente consequências significativas na suscetibilidade de insetos ao Bt.

Em dois estudos controversos, Broderick, Raffa e Handelsman (2006 e 2009) sugeriram que Bt é incapaz de matar Lymantria dispar (Linnaeus, 1758) (Lepidoptera: Lymantriidae), Manduca sexta Linnaeus, 1763 (Lepidoptera: Sphingidae), Pieris rapae (Linnaeus, 1758) (Lepidoptera: Pieridae) e Vanessa cardui (Linnaeus, 1758) (Lepidoptera: Nymphalidae) na ausência de bactérias intestinais. A exposição prévia de larvas a uma combinação de quatro antibióticos para eliminar as bactérias do intestino reduziu severamente a toxicidade de uma preparação comercial de Bt. A reinfecção de larvas com um isolado de Enterobacter sp. resgatou a toxicidade do Dipel®. Um estudo subsequente de Johnston e Crickmore (2009) mostrou que a perda da atividade do produto foi resultado do efeito direto dos antibióticos residuais nas larvas e nas bactérias vivas presentes no produto Dipel®. Eles não só concluíram que as bactérias nativas do intestino não eram necessárias para a toxicidade de Bt, mas de fato, mostraram que a presença de bactérias intestinais nativas ajudou a proteger o inseto contra o Bt. Ao resumir esses dados, Raymond et al. (2010) concluiram que o Bt é, principalmente, um agente patogênico para insetos, e que o seu principal meio de reprodução é por cadáver de insetos, e que não requer a ajuda de outros microrganismos para expressar sua patogenicidade.