Şart Kipi

Os ensaios de dinâmica molecular foram inicialmente empregados no modelo da galectina- 4 com o intuito de encontrar o mínimo energético mais favorável e as posições ótimas para os CRDs, uma vez que não há dados na literatura sobre o posicionamento correto desses domínios. As estruturas cristalográficas que foram resolvidas para a galectina-8 do grupo tandem-repeat com os dois domínios na mesma cadeia polipeptídica são resultantes de uma forma resistente a proteólise da proteína, na qual apenas dois resíduos de aminoácidos constituem o elo entre um domínio e outro (Yoshida et al., 2012; Kim, B. W. et al., 2013). As simulações de dinâmica molecular foram realizadas pelo Dr. Ricardo Oliveira dos Santos Soares, atualmente pós-doutorando no Laboratório de Cristalografia de Proteínas de Ribeirão Preto.

Todas as simulações de dinâmica molecular foram feitas através do pacote GROMACS (Pronk et al., 2013), e, a não ser que explicitamente indicado, contaram essencialmente com os mesmos parâmetros a seguir. Para o conjunto de potenciais que envolvem as interações entre átomos ligados e não ligados, utilizamos o campo de força AMBER99SB-ILDN (Lindorff-Larsen

eletrostáticas foram tratadas pelo esquema PME (Particle Mesh Ewald) (Darden, York e Pedersen, 1993), com raios de corte de Coulomb e van der Waals ambos iguais a 1 nm, enquanto as interações covalente tiveram constrições pelo algoritmo LINCS (Linear Constraint Solver) (Hess et al., 1997).

A temperatura do sistema foi descrita inicialmente pelas velocidades geradas por uma distribuição de Maxwell-Boltzmann e então controlada pelo algoritmo de Berendsen (durante o equilíbrio) e V-Rescale (durante a produção) (Berendsen et al., 1984; Bussi, Donadio e Parrinello, 2007). A pressão do sistema foi determinada indiretamente pelo volume da unidade de simulação (sistemas dodecaédricos) e foi controlada pelos algoritmos de Berendsen e Parrinello-Rahman, nas fases de equilíbrio e de produção, respectivamente (Parrinello e Rahman, 1981; Berendsen et al., 1984). Os efeitos de borda foram minimizados pela utilização de condições de contorno periódicas. O tempo de integração de cada passo do algoritmo leap-frog foi ajustado para 2 fs.

As etapas típicas das simulações descritas seguem basicamente o mesmo esquema, com os programas GROMACS em cada passo indicados entre parênteses. Primeiramente o modelo da proteína no formado pdb foi transformado para o formato GROMACS ao mesmo tempo em que geramos a topologia equivalente a um pH 7,0, de acordo com os parâmetros do campo de força (pdb2gmx). Em seguida, criamos uma caixa de simulação em forma de dodecaedro, de maneira que a proteína foi centralizada e teve seu eixo de simetria mais longo alinhado a 1,2 nm de distância das paredes (editconf). Em seguida, preenchemos todo o volume dodecaédrico com moléculas de água, representadas pelo modelo TIP3P, para então removermos aquelas que sobrepõem ao espaço ocupado pela proteína (genbox). De acordo com o estado de ionização da proteína, correspondente ao pH neutro, a carga total do sistema foi neutralizada, ao mesmo tempo em que íons Na+ _{e Cl}-

suficientes foram adicionados para se alcançar o valor padrão de força iônica fisiológica (150 mM) (genion).

A introdução de várias moléculas no sistema pode causar o surgimento de forças espúrias, por isso procedemos com uma minimização de energia com o algoritmo steep-descent até que o sistema atingisse um patamar de energia potencial menor que 2.103_{KJ/mol (grompp e mdrun). Para}

o próximo passo, procedemos com uma simulação de equilíbrio, onde a temperatura e a pressão foram estabilizadas. Para não danificar a estrutura inicial da proteína, aplicamos uma restrição de movimento nos átomos da cadeia principal enquanto a camada de solvatação foi ajustada (grompp e mdrun). Após 2 ns de dinâmica de restrição, procedemos com a dinâmica de produção, onde o tempo de simulação varia de acordo com cada sistema descrito nos próximos itens.

2.2.5.1 Determinação da conformação do peptídeo de ligação da hGal4

Em simulações de equilíbrio, em condições normais, os domínios da hGal4 mostraram uma forte tendência de aglomeração. No entanto, a conformação final do peptídeo de ligação se mostrou variável, e aconteceu de acordo com o ângulo em que ocorre a aproximação inicial entre os CRDs. Por isso, utilizamos a técnica de flooding (Lange, Schäfer e Grubmüller, 2006), em que foi aplicada uma força vetorial em estados de baixa energia, o que estimula o sistema a explorar o espaço conformacional em uma velocidade muito superior que uma simulação convencional. Para isso, procedemos com uma simulação de produção da hGal4 (40 ns) e extraímos uma trajetória baseada na matriz de covariância (programa g_covar) e PCA (Principal Componente Analysis, programa g_anaeig), os quais foram utilizados para guiar a aplicação das energias na simulação de flooding (programas make_edi, grompp e mdrun).

2.2.5.2 Parâmetros e simulações dos ligantes LacNAc

Uma das perguntas que levantamos era se a o peptídeo de ligação entre os domínios poderia modular a ligação ao carboidrato via posicionamento dos CRDs. Para dar início a esses estudos, primeiramente foram gerados modelos da hGal4 em complexo com duas moléculas de LacNAc (N-acetil-D-lactosamina), uma em cada CRD. Para chegar a esses modelos, a estrutura da galectina- 8 complexada com lactose (PDB 3VKL) foi submetida ao alinhamento estrutural com o modelo da hGal4, um CRD por vez. Uma vez superpostos, a lactose de cada domínio da hGal8 foi transferida para o modelo da hGal4. Para posicionar o ligante, as unidades de galactose do LacNAc foram superpostas com as de lactose. As moléculas de LacNAc foram obtidas da estrutura do N- terminal da galectina-9 (PDB 2D6N) (Kumar, Frank e Schwartz-Albiez, 2013).

As moléculas do LacNAc em formato pdb foram parametrizadas pelo uso do módulo

Carbohydrate Builder da interface do website www.glycam.org (Kirschner et al., 2008), segundo suas

sequências descritas na literatura (Kumar, Frank e Schwartz-Albiez, 2013). Após a geração dos modelos, os parâmetros foram convertidos do formato nativo do programa AMBER para o formato GROMACS com o uso do script acpype (Wang et al., 2004; Sousa Da Silva e Vranken, 2012). Os modelos foram então incluídos na topologia da cadeia proteica da hGal4 e tiveram seus resíduos renomeados de forma a serem mais diretamente identificados nas análises subsequentes.