ÇalıĢmada morfolojik karakterlerine göre izole edilen 42 fungal izolatın 15 Fusarium spp, 9 Aspergillus spp., 5 Verticillium spp., 7 Botrytis spp., 3 Beauveria spp. Ve 2 Gliocladium spp. olarak tanılandı. Ġzole edilen 236 bakteri suĢlarının 35 Kluyvera cryocrecens, 29 Salmonella spp., 27 Escherichia coli, 25 Klebsiella pneumoniae, 24 Bacillus spp 21 Enterobacter spp., 16 Photorhabdus luminescens, 11 Cedecea spp., 8 Stenotrophomonas maltophilia, 7 Pseudoxanthomonas broegbernensis, 6 Serratia spp., Enterobacter cancerogenus, Bacillus pumilus, 2 Bacillus sphaericus, Pantoea agglomerans, Salmonella choleraesuis, 2 Acinetobacter genomospecies, 5 Citribacter freundii, 4 Proteus mirabilis, 3 Shigella boydiii, 2 Chryseobacterium balustinum, 2 Microbacterium barkeri, 2 Nesternkonia halobia, ve 1 Staphylococcus sciuri olarak tanımlanmıĢtır. Yeditepe Üniversitesi seralarından biyoaktivite testleri yapılırken izole edilerek, tanımlanan iki adet fungusun sonuçları ise aĢağıdaki çizelgede yer almaktadır.
39
Çizelge 3.3 Potansiyel biyoajan fungus izolatlarının tanı sonuçları
Fungus MY1, MY4 Cladosporium cladosporioides Fungus MY3, MY5, MY7
Penicillium italicum var. İtalicum
Tanımlanan bakterilerin içinden üç adet Bacillus cinsi bakterinin (FS51, BS6 ve BS7) hem sera zararlıları hem de sivrisineklerle mücadelede kullanılabilme potansiyeli olduğundan daha detaylı tanıları yapılmıĢtır. Bu çalıĢmalar sonucunda nükleik asit temelli 16S-rDNA PZR amplifikasyonu ile dizi analizleri sonucunda Dünya için yeni birer Bacillus sphaericus suĢu olduğu belirlendi. Bu bakterilerin sırasıyla (FS51, BS6 ve BS7) yağ asidi profili, BIOLOG ve baz dizi analizi sonuçları aĢağıda yer almaktadır.
40
41
42
43
Çizelge 3.4 FS51, BS6 ve BS7 bakterilerin yağ asidi profili sonuçlarının bilinen ile karĢılaĢtırılması Yağ asitlerinin Nümerik isimleri (Pik isimleri) % FS 51 % BS 6 % BS 7 % B.sphaericus 14:0 iso 2,02 4,38 1,51 1,26 14:0 0,60 - 0,68 0,85 15:0 iso 45,00 44,99 45,84 46,61 15:0 anteiso 10,87 9,22 13,13 7,89 14:0 iso 3OH - - - 1,05 16:1 w7c alcohol 9,93 12,38 9,55 6,80 16:iso 12,65 15,24 8,14 5,48 16:1 w11c 3,31 2,04 3,31 5,62 16:0 1,72 0,78 1,78 1,64 17:1 iso w10c 1,43 1,40 2,35 4,92 Sum In Feature 4 1,65 1,72 2,32 2,58 17:0 iso 6,11 4,67 5,69 10,86 17:0 anteiso 4,70 3,19 4,67 4,45 18:1 w9c - - 1,03 -
Yağ asidi profilleri karĢılaĢtırıldığında 14:0 numaralı doymuĢ yağ asiti olan Myristic (n- tetradecanoic) BS6'nın yapısında bulunmadığı görülmektedir. Aynı Ģekilde 18:1 w9c numaralı tekli doymamıĢ yağ asidi olan Oleic (9-octadecenoic) sadece BS7'nin yapısında yer alırken diğer suĢlarda görülmemektedir. 14:0 iso 3OH numaralı yağ asidi ise sadece referans suĢta yer almaktadır. Bu sonuçlar her bir bakteri suĢunun birbirinden farklı olduğunu kanıtlamaktadır.
44
ġekil 3.6 FS51, BS6 ve BS7 bakterilerin BIOLOG sonuçları
BIOLOG sonuçlarında ise her bir bakterinin kullandığı metabolitlerin farklı olduğu analizin yapıldığı mikroplatelerdeki renk değiĢimlerinden görülmektedir. Fakat MIS ve BIOLOG kütüphaneleri kısıtlı olduğu için sadece mikroorganizmanın tür tanısını vermektedir. Bu bakterilerin birbirinden farklı ve yeni birer alt tür olduğunu kanıtlamak için 16 S rDNA baz dizilimi yapıldı.
45
ġekil 3.7 16 S rDNA baz dizi analizine göre filogenetik akrabalık Ģeması
Yukarıdaki filogenetik ağaçta FS51, BS6 ve BS7 suĢlarını sırasıyla MIB5, MIB6 ve MIB 7 temsil etmektedir. Filogenetik ağaca göre FS51, BS6 ve BS7 suĢlarının bilinen B. sphaericus suĢlarından 16 S rDNA baz dizilimine göre ayrıldığı görülmektedir.
46
3.3 Potansiyel Biyoajanların Laboratuvar, Sera ve Arazi KoĢullarında Belirlenmesi (Biyoaktivite Testleri)
ÇalıĢma kapsamında izole edilen ve tanılanan bütün bakteri suĢları ve fungus izolatlarının sera zararlılarına karĢı etkili bir biyoajan olarak kullanılma olanaklarının olup olmadığı laboratuvar, sera ve arazi koĢullarında yürütülen biyolojik etkinlik testleri ile belirlenmiĢtir (ġekil 3.8 ve 3.10).
Laboratuvar Testlerinin Sonuçları:
Beyazsinek popülasyonuna olan etkilerini gözlemek için bakteriyal süspansiyonlar ile bitki özütleri; patlıcan ve hıyar bitkilerinin yaprakları üzerine, petri kapları ve plastik kutular içerisinde uygulanmıĢtır. Bacillus pumilus (MY51), Salmonella choleraesuis (MY19), Stenotrophomonas maltophilia (FS227) ve Chryseobacterium balustinum (FS33) bakteri solüsyonları petri kapları içerisinde yapılan çalıĢmalarda baĢarı göstermiĢtir (ġekil 3.8).
47
ġekil 3.8 Laboratuvar koĢullarında petriler içerisinde potansiyel biyoajan organizmalar ile test edilen sera zararlıları
B A
48
ġekil 3.9 MY51, MY19, FS227 ve FS33 bakteriyal solüsyonların hıyar yaprağı üzerinde bulunan beyazsineklere sprey edildikten 48 saat sonra alınan steromikroskop görüntüleri
Petri ve plastik kutularda yapılan testlerde izole edilen suĢlardan Bacillus spp. FS51, Stenotrophomonas maltophilia FS227, Nesternkonia halobia FS78, Staphylococcus gallinarum SG1, Chryseobacterium balustinum FS33, Bacillus sphaericus BS6 ve BS7 ile 4 fungus izolatı afitler üzerinde potansiyel biyoajan (%10 dan fazla ölüm) olarak etkili bulunmuĢtur.
FS33 MY19
FS227 MY51
49
ġekil 3.10 Laboratuvar ortamında plastik kutular içinde bitki yaprakları üzerinde beslenen beyazsinek, k.örümcek ve afit populasyonları üzerine potansiyel biyoajan
50
ġekil 3.11 Laboratuvar koĢullarında plastik kutular içerisinde potansiyel biyoajan bakteriler ile test edilen afit örneklerinin stero mikroskop görüntüleri
BS6 FS4 FS78 FS78 FS 227 SG1
51
ġekil 3.12 Biyoaktivite testlerinde etkili bulunan fungus izolatlarının enfekteli afit örnekleri üzerindeki steromikroskop görüntüleri
Penicillium italicum var. italicum
Penicillium italicum var. italicum Cladosporium cladosporioides
52
ġekil 3.13 Chryseobacterium balustinum FS33 uygulamasından önce (üst) ve sonraki (alt) beyazsinek ve kırmızı örümcek örneklerinin steromikroskop görüntüleri
Kırmızı örümceklere karĢı hazırlanan bakteri solüsyonlarından Chryseobacterium balustinum FS33, Bacillus pumilus (MY51), Salmonella choleraesuis (MY19), Stenotrophomonas maltophilia (FS227), Bacillus sphaericus (BS6) ve Bacillus sphaericus (BS7) suĢları laboratuvar koĢullarında etkili bulunmuĢtur. Özellikle Chryseobacterium balustinum FS33 hem kırmızı örümceklere hem beyazsineklere karĢı etkinlik göstermiĢtir. ġekil 3.13 ve 3.14‟ de zararlılar üzerindeki ölümcül etkileri açıkça görülmektedir.
53
ġekil 3.14 Chryseobacterium balustinum FS33 uygulamasından sonraki ölen beyazsinek ve kırmızı örümcek örneklerinin taramalı elektron mikroskop görüntülerĠ
54
ġekil 3.15 ABÖ: aseton bitki özütü ile MBÖ: metanol bitki özütünün konukçu hıyar yaprağı üzerinde bulunan kırmızı örümceklere karĢı sprey edildikten 24 saat sonra
alınan görüntüleri
Bitki özütleri ile yapılan laboratuvar testlerinde kırmızı örümceklere karĢı aseton bitki özütünün etkili olduğu belirlendi. Çözücü seçimi bitki özütünden elde edilen bileĢiklere yansıdığı için hedefte seçicilik görüldü. Metanol ile edle edilen bitki özütleri kırmızı örümceklere karĢı etkin değil iken afitlere karĢı etkinlik gösterdi. ġekil 3.16‟da afitlere karĢı test edilen bitki özütlerinin etkinlikleri görülmektedir.
ġekil 3.16 ABÖ: aseton bitki özütü ile MBÖ: metanol bitki özütünün konukçu hıyar yaprağı üzerinde bulunan afitlere karĢı sprey edildikten 24 saat sonra alınan görüntüleri
MBÖ ABÖ ABÖ Kingbo Distile su MBÖ
55
Kırmızı örümceklere karĢı yapılan diğer bir çalıĢmada ise sera zararlılarına karĢı etkileri tespit edilen karıĢık bitki türlerinden elde edilen aseton ve metanol bitki özütleri (ABÖ ve MBÖ) ile potansiyel biyoajan olduğu belirlenen FS51 izolatı birlikte test edilmiĢtir (ġekil 3.17). Bu çalıĢmada pozitif kontrol olarak %1 aseton bitki özütü (ABÖ), %1 metanol bitki özütü (MBÖ) ile %1 Kingbo kullanılmıĢtır. Negatif kontrol olarak distile su kullanılmıĢtır. Ayrıca bakteri (FS51) ve bitki özütleri (aseton veya metanol)‟ den 0.5 ml alınarak 99ml distile su içerisinde karıĢtırılarak elde edilen bakteri ve bitki özütü (aseton veya metanol) kombinasyonu ayrıca yapraklara sprey edilerek test edilmiĢtir. Ayrıca, kontrol amaçlı bitki özütlerinin çözücüleri olan aseton ve metanol tek baĢlarına zararlılara karĢı test edilmiĢtir ve hiçbir ölümcül etki gözlenmemiĢtir. AĢağıda yer alan çizelgede ise laboratuvar koĢullarında yapılan biyoaktivite testlerinin sonuçları böcek popülasyonundaki ölüm oranı yüzdesi cinsinden gösterilmektedir.
ġekil 3.17 ABÖ+ FS51: aseton bitki özütü ile FS51 karıĢımı, MBÖ+ FS51: metanol bitki özütü ile FS51 karıĢımı, ABÖ: aseton bitki özütü, AMÖ: metanol bitki özütünün konukçu hıyar yaprağı üzerinde bulunan kırmızı örümceklere karĢı sprey edildikten 24
saat sonra alınan görüntüleri
ABÖ+ FS51 MBÖ FS51 MBÖ ABÖ
56
Çizelge 3.5 Laboratuvar koĢullarında test edilen biyoajan, bitki özütü ve organik biyoinsektisit uygulamalarının hıryar bitkisi üzerindeki konukçu populasyon üzerine
etkileri
Elde edilen sonuçlara göre (Çizelge 3.5) aseton bitki özütü (ABÖ) ile FS51 bakteri süspansiyon karıĢımı kırmızı örümcek popülasyonu üzerinde daha fazla (%92) ölümüne neden olduğu saptanmıĢtır. Bu uygulamayı aseton bitki özütü (ABÖ), metanol bitki özütü (MBÖ) ile FS51 karıĢımı, metanol bitki özütü uygulamaları takip etmiĢtir.
Uygulamalar Canlı K.Ö. sayısı (24 sa) Ölü K.Ö. sayısı (24 sa) Canlılık yüzdesi % %1 ABÖ+FS51 5 52 8 %1 MBÖ+FS51 38 22 63 %1 ABÖ 25 46 35 %1 MBÖ 68 8 89 %1 KĠNGBO 2 33 5
57
Çizelge 3.6 Potansiyel biyoajan bakteri, fungus izolatları ve bitki özütlerinin laboratuvar koĢullarında sera zararlıları üzerine etkileri
58
Sera Testlerinin Sonuçları:
Yeditepe Üniversitesi seralarında ve bitki büyütme kabinlerinde yetiĢtirilen bitkilerin yaprakları üzerinde beslenen beyaz sinek, k.örümcek ve afit popülasyonları üzerine mikrobiyal inokulumlar (108 CFU bakteri/ml veya 104 fungus sporu/ml) sprey edilerek uygulandı. Uygulamalarda kullanılan bitkiler ġekil 3.19'da görülmektedir.
59
ġekil 3.19 Biyoaktivite testlerinde kullanılan üstte bitki büyütme kabinlerinde ve altta serada biber patlıcan, domates ve hıyar bitkileri
Sera ve bitki büyütme kabinlerinde yapılan biyoaktivite testlerinin sonuçlarına göre daha önceki laboratuvar ortamında yapılan çalıĢmalarda etkili bulunan Bacillus spp. FS51 ve Bacillus sphaericus BS6 ve BS7 (Çizelge 3.6; ġekil 3.11) afit popülasyonu üzerinde sırası ile %12, 15 ve 22 oranında ölüme neden olarak etkili olmuĢlardır. ġekil 3.20'de yer alan bakterilerin (SG1, BL6, FS 4, FS 78, FS 227) etkinlikleri sadece laboratuvar koĢullarında kalmıĢ olup, serada biyolojik aktivite göstermemiĢlerdir.
60
ġekil 3.20 Sera koĢularında potansiyel biyoajan bakteriler ile test edilen afit örneklerinin stero mikroskop görüntüleri
Laboratuvar koĢullarında etkili bulunan fungus izolatları (Cladosporium cladosporioides MY1, MY4 ve Penicillium italicum var. italicum MY3, MY7) sera koĢullarında da afitlere karĢı %100 oranında etkili bulunmuĢtur (ġekil 3.21). Bunun nedeni; nemin yeteri kadar olması ve fungusların zararlı böcekler üzerinde epidemi oluĢturmasına olanak sağlamasıdır.
SG1 FS 227
FS 4 FS 78
BL6 FS 51
61
ġekil 3.21 Biyoaktivite testlerinde etkili bulunan fungus izolatlarının enfekteli afit örnekleri üzerindeki steromikroskop görüntüleri
62
Arazi Testlerinin Sonuçları:
2010 yılında tarla koĢullarında Adana‟da YALTIR A.ġ. organik çilek üretim alanları ve Antalya Kumluca‟da Makro Tarım A.ġ. hıyar üretim seralarında kırmızı örümcek popülasyonu üzerinde uygulamalar yapılmıĢtır. Diğer zararlı popülasyonları bulunmadığı için onlara karĢı arazi denemeleri yapılmadı. ÇalıĢmalarda Bacillus spp. FS51 Bacillus sphaericus BS6, BS7, fungus izolatları (Cladosporium cladosporioides MY1, MY4 ve Penicillium italicum var. italicum MY3, MY7) ve bitki özütlerinin kırmızı örümceklere karĢı etkinlikleri araĢtırıldı. Uygulama sonuçlarına göre bakteri, fungus ve bitki özütleri baĢarılı bulunmadı. Sadece Pozitif kontrol Kingbo %100 oranında baĢarılı olmuĢtur. Bu sonuçlar laboratuvar ve seralarda yapılan uygulama sonuçları ile uyumludur.
63
3.4 Potansiyel Biyoajanların Sivrisinek Larvaları Üzerine Etkinliklerinin