Özel Sebepler

Com o objetivo de determinar o cariótipo constitucional das células retiradas dos cordões umbilicais, foi realizada a análise citogenética das CTMH isoladas de CUP001, CUP003, CUP004, CUP005, CUP006, CUP009, CUP010 e CUP012. As células foram retiradas dos frascos em passagens iniciais, assim que houve crescimento suficiente para obtenção de um bom número mitótico, sem interferir com a posterior expansão necessária para outros experimentos.

Alguns pesquisadores publicaram artigos descrevendo metodologias para obtenção de cromossomos em CT (Catalina et al., 2008; Meisner e Johnson, 2008; Bochkov et al., 2009; Campos et al., 2009; Moralli et al., 2011). A principal preocupação dos autores foi com a obtenção de cromossomos metafásicos adequados para garantir a qualidade da análise citogenética, uma metodologia que deve ser utilizada em todos os centros de terapia celular para avaliar a integridade genômica e a estabilidade cariotípica das linhagens celulares, evitando que CT com instabilidade cromossômica sejam utilizadas em programas de terapia celular e medicina regenerativa.

No presente trabalho foram necessárias várias modificações na técnica visando à obtenção de material confiável para a análise citogenética. Ficou estabelecido que a confluência celular não devia exceder 60%, culturas muito confluentes produziram cromossomos de péssima qualidade por causa da formação de grumos celulares. As CTMH foram retiradas dos frascos de cultura com o auxílio de tripsina, este procedimento não alterou a qualidade dos cromossomos metafásicos e nem impediu o bandamento, estes resultados foram diferentes daqueles descritos por Bochkov e colaboradores (2009) que indicam o uso da tripsina para soltar as células somente na coleta das células para FISH e não para o bandamento GTW.

O principal problema encontrado na análise citogenética de CTMH foi o excesso de citoplasma residual ao redor das metáfases que atrapalhava o espalhamento dos cromossomos. Como descrito por Meisner e Johnson (2008), o espalhamento adequado das metáfases nas lâminas é essencial para a obtenção de bandas G bem definidas. Para diminuir este problema, foi necessário controlar parâmetros críticos como umidade e temperatura na hora de pingar o material nas lâminas e realizar a visualização de cada lâmina no

57 microscópio, verificando se os cromossomos estavam bem espalhados, sem resíduo de citoplasma e com coloração grafite escuro sob contraste de fase. O protocolo descrito por Henegariu e colaboradores (2001) foi utilizado para adequar a maneira de pingar o material e assim foi possível obter boas metáfases em diferentes níveis de resolução de bandas. Este fator é extremamente dependente da passagem do cultivo (células mais velhas têm os cromossomos mais curtos) e das condições de cultivo (mesmo células jovens que passaram por excessiva confluência têm cromossomos mais curtos).

Outra situação recorrente foi a presença de monossomias casuais não clonais (não entram na definição do cariótipo final), isto pode ser artefato técnico: a tentativa de retirar o citoplasma (com uso de ácido acético) pode ter rompido as células que apresentaram tais perdas cromossômicas.

O número ideal de metáfases a ser analisado é 20, entretanto, isto não foi possível em todos os cordões devido ao baixo índice mitótico, refletido na perda da cultura posterior (CUP005 e CUP006). Todos os cordões, exceto o CUP004, apresentaram cariótipo constitucional normal (46,XX ou 46,XY).

O presente trabalho vem demonstrar a importância da análise citogenética correta das CT antes de implantar num paciente, sejam elas cultivadas por longo tempo ou não, pois foi encontrada uma alteração constitucional em CUP004, presente em todas as metáfases analisadas em diferentes condições de tratamento. Trata-se de uma alteração estrutural aparentemente balanceada: inversão paracêntrica no braço curto do cromossomo 3, cariótipo: 46,XY,inv(3)(p13p25~26) (Figura 7).

As inversões paracêntricas presentes na população normal são consideradas como heteromorfismos, não trazendo problemas de saúde ao portador na maioria dos casos. Inversões em que o ponto de quebra está na região heterocromática (1qh, 9qh, 16qh e Yq) são frequentes e são consideradas variantes normais. Outras inversões heteromórficas frequentes são: inv(2)(p11q13), inv(5)(p13q13) e inv(10)(p11q21.2). Excluindo esses exemplos, as inversões são dez vezes mais raras do que todos os outros rearranjos balanceados (translocações robertsonianas: 1 em 1000; translocações recíprocas: 1 em 625 (Shaffer and Lupski, 2000), com uma frequência de 0.012 a 0.07% para inversões pericêntricas, e 0.01 a 0.05% para paracêntricas (Gardner e Sutherland, 2004). Apesar de ser uma alteração

58 estrutural aparentemente balanceada, a inversão paracêntrica pode predispor à ocorrência de rearranjos não balanceados na descendência do portador, e a uma elevação na frequência de abortos espontâneos quando comparados à população em geral (Grati et al., 2008). Além disso, em casos raros ela pode envolver perda ou ganho de segmentos de DNA e originar rearranjos gênicos. Watson et al. (2007) demonstraram que translocações citogeneticamente balanceadas podem estar associadas com perda ou ganho de segmentos de DNA. Jiang et al. (2008) encontraram microdeleções por hibridação genômica comparativa por array (CGH-array) nas regiões de pontos de quebra de uma inversão no cromossomo 14, inv(14)(q21q23), detectada na análise do cariótipo. Kwasnicka-Crawford e colaboradores (2005) descreveram uma inversão paracêntrica no braço longo do cromossomo 3, no ponto de quebra 3q29 eles identificaram um novo gene, ATP13A4, que foi alterado pela inversão e considerado como um candidato potencial pelo atraso de linguagem apresentado pela paciente. Também deve ser considerado que alterações cromossômicas balanceadas encontradas em bebês saudáveis já foram associadas com a subsequente ocorrência de tumores sólidos e doenças hematológicas (Bonne et al., 2007; Poland et al., 2007; Yamamoto et al., 2007; Vandepoele, 2008).

Em 3p25~26 há genes envolvidos em vias de reparo de DNA e/ou na susceptibilidade ao desenvolvimento de tumores: gene supressor tumoral von Hippel-Lindau (VHL), gene do grupo de complementação D2 de anemia de Fanconi (FANCD2), peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARG), oncogene viral homólogo v-raf-1 de leucemias em camundongos (RAF1), gene responsável por xeroderma pigmentosum, grupo de complementação C (XPC), e o gene da glicosilase de DNA OGG 8-oxoguanine (OGG1).

O VHL é um gene supressor tumoral cuja mutação na linhagem germinativa causa a doença de von Hippel-Lindau, uma síndrome de predisposição familial ao câncer, levando ao desenvolvimento de vários tumores benignos e malignos (Kaelin e Maher, 1998), principalmente de carcinomas renais. Wallerstein e colaboradores (2007) relataram o caso de uma paciente com cariótipo 46,XX,del(3)(p25.2~pter), que foi posteriormente analisada por CGH-array, e demonstraram que a deleção não envolveu o gene

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VHL. Uma translocação balanceada constitucional, t(3;8)(p14;q24.1), foi

encontrada em dois irmãos com carcinoma renal de células claras bilateral, a translocação alterou os genes FHIT e TRC8, resultando numa susceptibilidade genética aumentada à ocorrência do carcinoma (Poland et al.,2007). O gene

OGG1 codifica a enzima 8-oxoguanina glicosilase envolvida no reparo por

excisão de base do DNA. Esta enzima retira a 7,8-dihidro-8-oxoguanina (8- oxodG), uma lesão altamente pré-mutagênica produzida no DNA como resultado da exposição a espécies reativas de oxigênio (ROS) (Gokden et al., 2008). Polimorfismos no gene OGG1 podem alterar a função da glicosilase e a capacidade individual de reparar danos oxidativos no DNA, possivelmente resultando em instabilidade genética que pode levar à carcinogênese (Weiss et

al. 2005). Mutações nos genes FANCD2 e XPC predispõem seus portadores

ao desenvolvimento de vários tipos tumorais, pois ambos os genes são importantes em vias de reparo do DNA. O gene PPARG, quando alterado, está envolvido na etiologia de várias doenças como obesidade, diabetes e câncer. A ativação de RAF1 está envolvida com a proliferação celular e tumorigênese em mais de 30% de todos os cânceres humanos.

A análise citogenética das CTMH foi realizada também após a criopreservação e posterior recuperação das CTMH a fim de assegurar a autenticidade das linhagens e de verificar se houve aumento na instabilidade cariotípica (Duarte et al., 2012). Alterações cromossômicas clonais não foram observadas, entretanto, um grande número de alterações cromossômicas não clonais foi encontrado após a criopreservação nas CTMH de um dos cordões (CUP003), inclusive alterações estruturais (Duarte et al., 2012).

Estes resultados sobre a análise citogenética de CTMH, em condições corriqueiras de cultivo utilizadas em ensaios clínicos (estabelecimento da cultura e criopreservação), demonstraram que a aplicação de tais células em terapia celular exige uma investigação cuidadosa para assegurar a biossegurança dos procedimentos.

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Figura 7. Cariótipo parcial das CTMH CUP004 mostrando a inv(3)(p13p25~26) e seu ideograma. Cromossomo 3 normal à esquerda, o inv(3), à direita (Duarte et al., 2012).

A RDC nº 9 da ANVISA (2011) coloca a análise citogenética como um dos requisitos mínimos para a garantia de segurança e qualidade das células humanas e seus derivados. Entretanto, tal análise só é obrigatória se as células passaram por cultivo celular. No presente estudo fica evidente que é necessário se conhecer o cariótipo constitucional do doador das CTMH antes das mesmas serem transfundidas em um paciente.

5. Tratamento das CTMH com as micropartículas de titânio