identificar os vários compon
Os componentes instrum de processamento de dado 2010).
olunas diferentes. Pelo que, a avaliação compar ra equivalente a um prato (H), que correspon ), e N, eliminando a influência dos diferente 008).
cia de N na resposta da coluna cromatográfica (Argento
o de HPLC
-se representado um esquema típico de HP ponentes instrumentais e químicos.
umentais são a bomba, o injector, a coluna, o d dos, enquanto os componentes químicos são
arativa entre colunas onde à razão entre o tes comprimentos da (6) nton, 2010). PLC, onde se pode o detector e o sistema a FM e FE (Ferro,
Figur
Fase Móvel
A FM é um líquido que não só como transportador papel importante no grau de É a interacção química entr grau de migração e separaç composição da FM influenc O sucesso da separação uma FE conveniente. A escolha da composiçã propriedades físico portanto, a separaçã propriedades física componentes, como coluna;
ura 9 - Montagem típica de HPLC (Bottoli, 2007).
ue está continuamente a ser bombeado para a c or da amostra (Ferro, 2010), mas desempenh de separação que é possível atingir com uma d
tre a FM e amostra com o enchimento da colu ração dos componentes contidos na amostra,
ncia a separação numa dada coluna (Ferro, 201 ão cromatográfica só é possível se for aplicada
ição da FM tem em conta vários factores, tais c -químicas que afectam a solubilidade, part ção;
icas que afectam tanto a possibilidade mo as que dificultam o manuseamento das b
a coluna e que actua, nha, igualmente, um determinada coluna. luna que determina o a, por isso o tipo e a
010). a uma FM correcta a como: rtição e adsorção e, de detecção dos bombas, detector e
propriedades que afectam a segurança (toxicidade e inflamabilidade); custo (Argenton, 2010).
O abastecimento da FM é equipado com um ou mais reservatórios que podem ser de vidro ou o próprio recipiente do solvente, desde que este seja inerte, ou de aço inoxidável, sendo que este não é apropriado para fases móveis tamponadas com pH baixo, pois poderá ocorrer a corrosão do recipiente.
Fases móveis como a água e outros solventes polares têm tendência a dissolver gases como o oxigénio e azoto. Se estes gases forem libertados dentro do equipamento podem formar bolhas na coluna e no sistema de detecção essas bolhas podem causar o espalhamento de banda, interferindo assim na eficiência do detector. Por este motivo os solventes devem ser desgaseificados, através de sistemas de bomba de vácuo, sistemas de destilação e dispositivos de aquecimento (Pombeiro, 2003).
Alguns sistemas contem filtros a fim de impedir que a poeira e materiais particulados no solvente causem danos no sistema de bombeamento, de injecção e entupimento da coluna (Rutz, 2009).
Fase Estacionária
A FE consiste em pequenas partículas porosas que aumentam a área superficial. Os principais parâmetros desta são: o tamanho da partícula, a distribuição do tamanho da partícula, o tamanho do poro, área de superfície, tipo e quantidade de ligantes.
A natureza das fases estacionárias é um importante parâmetro para determinar as propriedades dos sistemas de separação de FN ou FR (Ferro, 2010).
Bombas de Alta Pressão
Devido ao facto de trabalhar com colunas de partículas com dimensões muito reduzidas, a HPLC necessita que o fluxo da FM seja constante e a alta pressão (até 6000kpsi), o que se consegue através de um sistema de bombeamento eficaz. A utilização da alta pressão é necessária, pois as partículas da FE exercem alta resistência ao fluxo da FM e se esta não fosse utilizada, a análise seria muito lenta (Argenton, 2010).
O fluxo deve ser consta da análise (Rutz, 2009). Al como já se referiu anterior (Argenton, 2010).
Normalmente utilizam- o que minimiza a pulsação.
Sistema de Injecção da Am
Para se obter uma bo importante a considerar é a
O sistema de injecção m além de ser reprodutível, volume injectado não neces amostradora (loop), ilustrad amostra, sendo o excesso le que faz com que a introduç volume (Argenton, 2010).
Figura
stante para garantir a reprodutibilidade, sensib Além disso, o bombeamento pode ser isocrátic ormente. No caso de ser isocrático utiliza-se a
-se bombas recíprocas com um ou preferencia o.
Amostra
boa eficiência nas análises cromatográficas, a maneira como se introduz a amostra na colun
mais utilizado, é o da válvula rotatória (utiliza l, elimina o problema de retorno da amostra essita de ser preciso, pois a válvula rotatória te rado na figura 10, capaz de selecionar volumes
levado para fora do equipamento (Rutz, 2009) ução da amostra, figura 11, tenha grande prec
ra 10 - Loop.
Figura 11- Introdução da
bilidade e exactidão tico ou por gradiente, e apenas uma bomba
ialmente dois pistões
as, um factor muito luna.
zado no estudo), pois tra. Neste sistema o tem uma alça capilar es de 1 a 100 µL de 9), para um esgoto, o ecisão e exactidão de
Na figura 12 pode ser rotatória no interior do lo amostra é carregado, enqu geralmente é feita manualm fazendo com que a FM pas (Rutz, 2009).
Figura 12 - Sistema
Coluna
Num sistema de HPLC as analíticas. A que foi ut encontra a FE.
er visualizado o método de injecção da amos loop. Na posição de carregar (a) um determ quanto a FM vai directa para a coluna. A r almente. Assim na posição injectar (b), muda passe pela alça de amostragem e arraste a amo
a de injecção da amostra com a válvula rotatória (Botto
C podem existir três tipos de colunas, as de satu utilizada neste estudo, figura 13, era analític
ostra, com a válvula erminado volume de rotação da posição dam-se as conexões, mostra para a coluna
ttoli, 2007).
aturação, de guarda e ítica. É nesta que se
Normalmente, a coluna vidro reforçado e sílica fun de resistir às elevadas pres 2003).
As colunas mais utiliza entre 4-6mm e um compr tabela 2 (Argenton, 2010).
Tabela 2
Detector
Os detectores são senso um sinal eléctrico a um pr forma de um pico cuja á (Argenton, 2010).
Assim, um detector par função da concentração de
Figura 13 - Coluna utilizada no trabalho.
na é constituída por aço inoxidável, mas també undida, desde que o material seja inerte, de m essões, além de que o diâmetro deverá ser un
izadas apresentam normalmente um diâmetro primento que depende da granulometria da F
2 - Características das colunas analíticas (Argenton, 201
nsores com dispositivos electroquímicos, que processador (Raghavan, et al., 2007). Esse s
área é proporcional à quantidade do com
ara HPLC deve ser caracterizado por dar uma e soluto, numa grande gama de concentrações
bém pode-se utilizar modo a ser de capaz uniforme (Pombeiro,
tro interno que varia FE como mostra a 010). e detectam e enviam sinal é registado na mponente analisado a resposta linear em es. Além disso, deve
ter uma elevada relação si perturbações na temperatur devido ao circuito eléctric concentrações de soluto pos Neste estudo o detector baseia-se na possibilidade aplica um potencial eléctric
Processador de dados
O processador de dados Para isso é necessário um s de modo a aumentar a vers da FM, o fluxo que sai d podendo diagnosticar possí os dados adquiridos pelo de 2010) efectuando a integra com a concentração dos ana
sinal/ruído (atendendo a que o ruído é devid tura, pressão ou alterações do fluxo da FM, po
rico do detector). Este ruído deve ser baixo ossam ser detectadas (Raghavan, et al., 2007). tor utilizado foi o electroquímico, figura 14. Es
e de muitos compostos serem oxidados ou re rico (Argenton, 2010).
Figura 14 - Detector electroquímico.
os estabelece a conexão entre os vários comp software adequado, neste caso foi utilizado o ersatilidade, exactidão e precisão permite cont
da bomba, a injecção da amostra e a temp ssíveis problemas que surjam (Rutz, 2009). A
detector, apresentando-os na forma de um cro ração das áreas e mediante calibração relacio nalitos.
vido a flutuações ou podendo ser também ixo para que baixas
.
Este tipo de detector reduzidos quando se
mponentes de HPLC. o 32 Karat 7.0, que ntrolar a composição peratura da coluna, Além disso processa romatograma (Ferro, iona-os directamente