Biyolojik örnekler ve tabletler de dahil olmak pek çok örnekte flurbiprofen tayini için genellikle YBSK, KE ve İTK gibi kromatografik teknikler kullanılmaktadır.
Flurbiprofen de içeren profenlerin tayini için, türevlerini oluşturmak suretiyle lazer eşleşmiş kapiler elektroforez kullanılmış ve sonuçlar YBSK’dan elde edilen sonuçlarla karşılaştırılmıştır. Elektrolit olarak 2.4 mM β-siklodekstrin içeren NH4Ac–HAc tamponu (pH 3.1) kullanılmıştır [10]. Kapiler elektroforez çalışmalarında genellikle silika kapiler kullanılmasına rağmen NSAİ grubu ilaçların analizinde histidin ile yüzeyi modifiye edilmiş kapilerin kullanıldığı çalışmalar da mevcuttur. Bu amaçla kapiler kolonun silanol grupları %10’luk (v/v) m-ksilen içerisinde 3-klorotrimetoksisilan ile 110 ºC’de aktive edildikten sonra histidin ile modifiye edilmiş ve profen grubu yedi ilaç etken maddesi ayrılmıştır [11]. Flurbiprofen ve/veya ibufren içerdiği bilinen toplam on adet tablet ve kremde CE kullanılarak yapılan analizde tabletlerde iddia edilen ilaç etken madde miktarlarının analiz sonuçları ile uyuştuğu görülmektedir. Bu çalışmada flurbiprofen için tayin limiti 0.1 mg L-1 ve ibufren için ise 0.5 mg L-1 olarak bulunmuştur [12]. 3 µm partikül çaplı oktadesil silan bağlı silika kapiler kolonlar da YBSK ile profen grubu ilaçların ayrılmasında kullanılmaktadır [13]. CE’de susuz elektrolit kullanarak on üçe yakın NSAİ grubu ilaç etken maddeyi ayırmak da mümkündür. Bu amaçla metanolde hazırlanmış 50 mM amonyum asetat-13.75 mM amonyak karışımı kullanılmış ve 25 ºC’de 11, 36 ºC’de 13 NSAİ grubu ilaç etken madde birbirinden ayrılmıştır [14].
İnsan plazma ve idrarındaki flurbiprofenin ve onun yükseltgenmiş bir metaboliti olan 4-hidroksiflurbiprofenin analizi için YBSK’nın kullanıldığı bir çalışmada herhangi bir ekstraksiyon metodu kullanılmadan analizler gerçekleştirilmiştir [15]. Hareketli faz olarak metanol–1% (v/v) suda hazırlanmış fosforik asit, 80:20 (v/v) ve YBSK tekniği kullanılarak rat plazmasındaki flurbiprofenin farmokinetiği ve deri üzerindeki birikimi çalışılmıştır [16]. Ters faz kolonun kullanıldığı bir YBSK çalışmasında flurbiprofen için tayin limiti 15 ng mL-1 iken, aynı çalışmada UV ile yapılan deneyler sonucunda tayin limiti 0.34 µg mL-1 olarak hesaplanmıştır [17]. Kromatografik tekniklerle tabletlerde ilaç etken madde analizlerinde genellikle öğütme ve basit bir ekstraksiyon yöntemi yeterli doğruluk ve hassasiyette analiz imkânı sağlamasına rağmen katı faz ekstraksiyonu yönteminin kullanıldığı çalışmalar da
mevcuttur. Katı faz olarak Sep-Pak Silica kartuşlar ve elüent olarak da etil asetat kullanılmış ve 11 adet NSAİ grubu ilaç etken madde başarılı bir şekilde bir birinden ayrılmıştır [18].
Plazma gibi biyolojik örneklerde ise basit ekstraksiyon metotlarının yeterli olmayacağı bilinmektedir. Bu tür biyolojik örneklerde ilaç etken maddelerin analizi için geliştirilen bir yöntemde, örnek içindeki protein gibi makromoleküllerin yarı geçirgen bir membran yardımıyla ayrılması ve böylece analizin daha da kolaylaşması amaçlanmıştır. İlaçların, proteinlere bağlanabileceği de göz önüne alınarak bu etkiyi azaltmak için farklı stratejiler de geliştirilmiştir [19].
Son zamanlarda kromatografik teknikler kütle spektrometrisi ile on-line bağlantılı olarak da kullanılmaktadır. Bu ikili sistemin birlikte kullanıldığı, son yıllarda yapılan bir çalışmada katı faz ekstraksiyon metodu kullanılarak plazmadaki flurbiprofen ekstrakte edilmiş ve yüksek basınçlı sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (HPLC-MS) ile analiz edilmiştir. Bond Elut Certify katı faz kartuşları ve elüent olarak da %1’lik amonyum hidroksit içeren metanol kullanılmıştır [20]. NSAİ grubu ilaçlardan daha az gastrointestinal toksisite gösterdiği bilinen ve azot monoksit açığa çıkaran seçici siklooksijenaz tip-2 inhibitörlerden (NO-NSAIDs) biri olan HCT1026 (NO-flurbiprofen) ve metabolitleri olan HCT1027 ve flurbiprofenin rat plazma ve beyin dokularında analizi amacıyla da HPLC-MS kullanılmıştır [21]. NSAİ grubu ilaçların sadece insanlarda değil hayvanlarda da kullanıldığı ve uzun süreli kullanımlarda toksik etki gösterdiği bilinmektedir. Bu doğrultuda NSAİ grubu 14 ilaç etken madde elektrosprey iyonlaştırıcı kullanılarak HPLC-MS/MS [22] ile, YBSK ile rat plazmasında [23,24] analiz edilmiştir. İlaç etken maddelerin kendileri kadar parçalanma ürünlerinin analizi de son yıllarda önem kazanmaktadır. GC-MS ile fotokimyasal bir reaktör içerisinde flurbiprofenin parçalanma ürünleri de tanımlanmıştır [25].
Kiral bir merkeze sahip olan ve R ve S olmak üzere iki enantiyomeri bulunan flurbiprofenin enantiomerik ayrılması ve tayini ile ilgili çalışmalar da son yıllarda gittikçe önem kazanmaktadır. Bu amaçla aynı bir çalışmada dört farklı yöntem geliştirilmiştir; (1) hareketli faza kiral bir katkı ve ters fazlı YBSK (RP-HPLC) ile analiz, (2) (R)-l-(naphthen-l- yl)ethylamine ile ön kolon türevlendirme yapılarak RP-HPLC analiz, CSP (Chiralpak AD) (3) ve CSP (Chiralpak AD) (4) kiral kolon içeren YBSK ile analiz [26]. CSP (Chiralpak AD) kolonunun kullanıldığı bir diğer çalışmada flurbiprofen ve 4-hidroksi metabolitlerinin analizi plazmada yapılmıştır [27]. R ve S-flurbiprofen glukuronidlerin ayrılması için de TSKgel ODS-80Ts kolonu kullanılarak YBSK ile analizleri yapılmıştır. Hareketli faz olarak 20 mM
amonyum asetat tamponu (pH:5.6)-etanol-asetonitril karışımı kullanılmıştır [28]. R ve S- flurbiprofenin enantiomerik ayrılması [29-36] ve enantiomer miktarlarının tayini için de geliştirilmiş analitik yöntemler bulunmaktadır [4,37-39]. Kiral bir selektör ile doldurulmuş kapiler sabit fazlar da NSAİ grubu ilaçların enantiomerik ayrılmasında kullanılmıştır [40]. Kiral selektör olarak vancomycin [41,42], β-siklodekstrin ve türevleri [43,44], makrosiklik antibiotik [45] . Kiral selektörlerin kromatografik tekniklerle birlikte daha yaygın bir kullanım alanı bulunmasına rağmen, potansiyometrik membran elektrot olarak kullanıldığı çalışmalar da mevcuttur [46,47].
Tablo 2.1. Flurbiprofen tayini ve enantiomerik ayrılması için geliştirilen kromatografik yöntemler
Kullanılan Teknik Lineer çalışma aralığı (µg mL-1) Tayin limiti (µg mL-1) Referans
CE 10-70b 0.24 µg mL-1 (1.1 µM) 11 CE 1-60 0.1 12 CE YBSK 1.6-45a 2.9-50a 0.16a 0.29a 10 YBSK 0.1-10 0.1 16 YBSK UV 0.05-1 1-20 0.015 0.34 17 YBSK 0.25-15 0.5 (idrarda) 0.25 (plazmada) 15 YBSK 0.05-10 - 27 YBSK 0.05-10 0.05 18 YBSK 1-15 0.01 19 YBSK 0.05-5 0.05 23 YBSK - 2.5 24 YBSK 2-18 (S enantiomer) 4.7f 4 CLC - 3 13 HPLC-MS 10-500c 5c (gözlenebilme limiti) 20 HPLC-MS 25-300 - 22 HPLC-MS 0.13-300d (plazmada) 0.3-30e (beyinde) 0.13d (plazmada) 0.3e (beyinde) 21 a fmol pmol-1 b ng mL-1 c nmol mL-1 d µM e nmol g-1 f pg
3. MATERYAL VE YÖNTEM
3.1. Materyal
3.1.1. Kullanılan Reaktifler
Flurbiprofen (Sigma) herhangi bir saflaştırma işlemi uygulanmadan kullanıldı. Deneyler boyunca analitik saflıkta H2O2, HCl ve NaOH (Merck), kromatografik saflıkta kloroform, etil asetat, ksilen, karbon tetra klorür, etanol, metanol (Merck) kullanıldı.
3.1.2. Kullanılan Çözeltiler
Flurbiprofen stok çözeltilerinin hazırlanması için gerekli miktarda flurbiprofen tartılarak metanol içerisinde çözüldü. YBSK ve KE çalışmalarında 0.05-0.1-0.25-0.5-1.0 µg mL-1 derişimlerinde, İTK çalışmalarında ise 50-100-200-300-400-500-600 ng spot-1 derişimlerinde çözeltiler hazırlanarak kalibrasyon grafikleri oluşturuldu. Daha seyreltik flurbiprofen çözeltileri ise metanol ile seyreltilerek hazırlandı. HCl, H2O2 ve NaOH çözeltileri gerekli miktarda bazın tartılması ve gerekli hacimlerde derişik asitlerin alınıp saf suyla istenilen hacme tamamlanmasıyla hazırlandı.
3.1.3. Kullanılan Aletler
Kapiler elektroforez ile ilgili çalışmalarda 50 µm iç çaplı, toplam 65 cm uzunluğunda ve dedektöre kadar olan etkin uzunluğu 56.5 cm olan kaplanmamış silika kapiler içeren HP3DCE (Hewlett-Packard) cihazı kullanıldı. Günlük olarak deneysel çalışmalara başlanmadan önce, kapiler 1 dk boyunca metanol, 3 dk boyunca tampon çözelti ve son olarak tekrar 5 dk boyunca metanol ile yıkandı. Çalışmalarda 20 kV’luk elektrik potansiyeli kullanıldı. Çalışma şartlarında kapiler sıcaklığı sabit 25ºC’de tutuldu. Çözeltiler, hidrodinamik olarak kapiler girişine 4 sn süre ile 3.4 kPa basınç uygulanarak enjekte edildi. Sonuçların değerlendirilmesi ise ChemStation yazılımı yardımıyla yapıldı.
.
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile ilgili çalışmalarda üzerinde ters faz kolon içeren HPLC (Agilent 1100 dedektör, Agilent degasser, Agilent pompa) cihazı kullanıldı.
Günlük çalışmalara başlamadan önce ve her kullanım sonrasında kolon metanol ile yıkandı. Sonuçların değerlendirilmesi ise ChemStation yazılımı yardımıyla yapıldı.
İnce tabaka kromatografisi ile ilgili çalışmalarda Camag marka HPTLC cihazı (Camag Linomat V-100 µL, Camag Scanner III) kullanıldı. Sabit faz tabakalar (Merck) deney öncesinde metanol ile yıkandı ve 50ºC de 5 dk süre ile aktive edildi. Standart ve örnek çözeltileri; 6 mm’lik bir bant genişliğinde, tabakanın soldan ve aşağıdan 15 mm’lik kısımlarından başlanarak inert gaz N2 yardımıyla tabakaya ekildi. Ekimler arasındaki mesafe kullanılan tabakanın boyutuna bağlı olarak otomatik olarak seçildi. Yürütme işlemlerinde (9.5 cm), hareketli faz ile önceden yaklaşık olarak 20 dk süre ile doygun hale gelmiş olan tank (Camag Twin Trough Chamber, 20×10 ve 10×10 ) kullanıldı. Yürütme işleminden sonra çözücünün uzaklaşması beklenildi ve tarama işlemleri, 6.00×0.45 mm slit aralığında, 1 mm s-1 tarama hızında, 100 µm s-1 çözünürlükte gerçekleştirildi. Işın kaynağı olarak D2&W lambaları kullanıldı. Sonuçların değerlendirilmesi ise winCATS yazılımı yardımıyla yapıldı.
3.1.4. Tabletlerin Analize Hazırlanması
Etken madde olarak flurbiprofen içerdiği bilinen ve eczanelerden temin edilmiş dört farklı markadaki ilaçlardan gruplar halinde onar tablet alınarak ayrı ayrı tartıldı ve dört farklı marka ilaç için ayrı ayrı ortalama tablet ağırlıkları belirlendi. Homojen bir örnekleme sağlamak için onarlık gruplar halindeki tabletler öğütülerek saklama kaplarına alındı. YBSK, KE ve İTK için yaklaşık 0.05 gr aralığında öğütülmüş haldeki ilaç tartılarak üzerine 20 mL metanol eklendi ve 20 dk süre ile bir magnetik karıştırıcı yardımıyla karışması sağlandı. Bu çözeltiden 0.2 mL’likbir kısım alınarak 20 kat seyreltildi ve 100 µL’lik bir şırınga yardımıyla 10 µL’lik hacimler halinde ince tabakaya ekimleri yapıldı. YBSK ve KE için ise 0.2 mL’lik kısım 100 kat seyreltilerek enjekte edildi.
3.2.4. Stres Şartlarının Hazırlanması
Farklı stres şartları altında flurbiprofenin bozunma kinetiğinin incelenmesi amacıyla YBSK ve KE’ye göre daha ekonomik olması, analizlerin daha kısa sürede tamamlanması ve parçalanma ürünlerinin tayininde duyarlı bir analiz tekniği olması bakımından İTK seçildi ve
aşağıdaki belirtilen işlemler standart flurbiprofen çözeltisine uygulandı. Stres şartlarının oluşturulmasında ICH tarafından belirlenen kriterler göz önüne alındı [48-49].
Asidik ortamda flurbiprofenin davranışını incelemek için 100 µg mL-1’ FBP (Flurbiprofen) çözeltisinden 15 mL alınarak üzerine 5 mL 5 M HCl eklendi ve 70 ºC’de magnetik karıştırıcı yardımıyla 1 saat karışması sağlandı. Bu süre sonunda 8 µL (600 ng spot-1 içerecek şekilde) alınarak sabit faza ekimi yapıldı.
Bazik ortamda flurbiprofenin davranışını incelemek için 100 µg mL-1 FBP çözeltisinden 15 mL alınarak üzerine 5 mL 5 M NaOH eklendi ve 70 ºC’de magnetik karıştırıcı yardımıyla 1 saat karışması sağlandı. Bu süre sonunda 8 µL (600 ng spot-1 içerecek şekilde) alınarak sabit faza ekimi yapıldı.
Yükseltgeyici ortamında flurbiprofenin davranışını incelemek için 100 µg mL-1 flurbiprofen çözeltisinden 15 mL alınarak üzerine sırasıyla 5 mL %5’lik ve %15’lik H2O2 eklendi ve 70 ºC’de magnetik karıştırıcı yardımıyla 1 saat karışması sağlandı. Bu süre sonunda 8’er µL (600 ng spot-1 içerecek şekilde) alınarak sabit faza ekimi yapıldı.
Kuru ısıtma çalışmalarında 0.005 g flurbiprofen tartılarak 70 ºC’de etüvde 3 saat bekletildikten sonra metanolde çözülerek sabit faza 8 µL (600 ng spot-1 içerecek şekilde) ekimi yapıldı. Yaş ısıtma çalışmalarında ise 100 µg mL-1 flurbiprofen çözeltisinden 15 mL alınarak üzerine 5 mL metanol eklendi ve 70 ºC’de magnetik karıştırıcı yardımıyla 1 saat karışması sağlandı. Bu süre sonunda 8 µL (600 ng spot-1 içerecek şekilde) alınarak sabit faza ekimi yapıldı.
Işık etkisiyle flurbiprofende meydana gelecek olası parçalanmaların incelenmesi amacıyla 100 µg mL-1 derişimindeki flurbiprofen çözeltisi yaklaşık 24 saat süre ile gün ışığına maruz bırakıldı ve bu süre sonunda çözeltiden 6 µL alınarak (600 ng spot-1) sabit faza ekimi yapıldı.