GEREÇ VE YÖNTEMLER
ÖLÇEĞİN PSİKOMETRİK ÖZELLİKLERİ
Como já abordado na introdução, as serino proteases de veneno de serpentes, apesar de um alto grau de similaridade estrutural e sequencial, são capazes de promover a catálise de macromoléculas bastante distintas entre si e a análise filogenética dessas proteínas poderia fornecer dados interessantes a respeito da história evolutiva desse grupo bem como ajudar no entendimento do mecanismo de ação dessas enzimas. Neste trabalho, realizamos uma análise filogenética, utilizando inferência bayesiana, a partir de sequências de aminoácidos de serino proteases de veneno de répteis da ordem Squamata (Figura 31). Essa ordem contém os répteis peçonhentos representados pelas famílias Varanidae e Helodermatidae, bem como todas as serpentes peçonhentas, representadas pelas famílias Viperidae, Elapidae (mais conhecidas), Colubridae e Hydrophiidae, sendo que sequências representantes de todos esses grupos foram encontrados nos bancos de dados. A árvore filogenética (Figura 31) mostra que as sequências representantes da família Elapidae – admitindo que o veneno de répteis das famílias Varanidae e Helodermatidae são mais primitivos que os das serpentes (Fry et al., 2006) e por isso escolhido como grupo externo – se agrupam fora da árvore, não mantendo relacionamento filogenético com sequências de nenhuma das outras famílias.
Figura 31: Árvore filogenética de serino proteases de veneno de vertebrados da ordem Squamata. As cores dos nomes e dos ramos correspondem à atividade farmacológica das enzimas. Os valores de probabilidade posterior após 1.000.000 ciclos estão indicados nos nós. Para ver os códigos, consultar tabela 12. E-value mínimo de 1e-
Tabela 12:Códigos utilizados nas árvores filogenéticas de serino proteases de vertebrados da ordem Squamata e da família Elapidae.
D ves1 5 3 De man siavestigia ta V estarinD1 1 1 8 1 5 1 7 1 4
D ves1 5 8 De man siavestigia ta V estarinD2 1 1 8 1 5 1 7 1 6
H ste1 6 9 Ho plo ce p ha lusste ph en sii H op sarinD 6 0 8 5 8 6 2 1
N scu 1 6 1 No techisscuta tu s N otecarinD 6 0 8 5 8 5 7 3
N scu 1 6 5 No techisscuta tu s N otecarinD 7 0 9 0 5 1 2 9
O m ic1 5 9 O xyuran usmicrole pido tu s O m icarinC 6 0 8 5 8 5 5 2
O scu 1 5 6 O xyuran usscutellatus O cu starinC 6 0 8 5 8 5 3 8
P p or1 5 5 P se ud ech isp orp hyriacus P orp h arinD 6 0 8 5 8 5 9 6
P tex1 4 9 P seu do na jate xtilistextilis B loodcoag u lationfactorX 1 6 8 1 3 2 0 8 2
P tex1 5 7 P seu do na jate xtilistextilis F actorXͲlikep rotease 4 8 4 2 9 4 4 7
P tex1 6 0 P seu do na jate xtilistextilis P seu tarinC 3 2 6 9 9 4 0 8
P tex1 6 2 P seu do na jate xtilistextilis B loodcoag u lationfactorX 2 6 8 1 3 2 0 8 4
P tex1 6 4 P seu do na jate xtilistextilis F actorXͲlikep rotease 4 8 4 2 9 4 4 5
Tcar1 5 2 Trop ide chiscarina tus B loodcoag u lationfactorX 5 5 7 9 4 1 3 3
Tcar1 6 3 Trop ide chiscarina tus F actorXͲlikep roteasetrocarinD 5 4 4 0 2 0 9 9
P olf9 7 P h ilod rya so lfersii S erin ep roteasep recu rsor 1 1 4 4 3 8 2 3 9
P olf1 2 1 P h ilod rya so lfersii .DOOLNUHLQ3KL 7 3 3 4 8 3 8 4
P olf1 3 1 P h ilod rya so lfersii K allikreinͲP h i3 7 3 3 4 8 3 5 0
P olf1 3 5 P h ilod rya so lfersii K allikreinͲP h i3 7 3 3 4 8 3 5 0
P olf1 3 6 P h ilod rya so lfersii kallikreinͲP h i1 7 3 3 4 8 2 4 7
H y d ro p h iid a e L h ar1 0 9 L ap emisha rd wickii S erin ep roteasep recu rsor 5 6 5 6 6 1 7 9
A b il1 1 9 A gkistro do nb iline atu s B ilin eob in 9 9 8 9 0 3
A con 1 0 0 A gkistrod onco nto rtrixcon tortrix C on tortrixob in 3 2 4 6 9 8 0 0
A con 6 0 S ynthe ticco nstru ct P roteinCactivator 2 9 4 6 8 3 4 7
B alt1 1 7 B o th rop sa lte rna tu s S erin ep rotein aseB th aTl 4 8 0 9 3 5 2 8
B asp 3 1 B oth ro psasp er Th rom b inͲlikeen zym e 8 2 4 6 6 4 8 3
B atr3 2 B o throp sa tro x B atroxob in 6 2 4 6 4
B atr3 3 B o throp sa tro x B atroxob in
B g ab 8 5 B itisgab on ica S erin ep rotease1
B in s2 1 B o throp sinsula ris S erin ep rotease
B jar1 2 B o tro psjararaca P roteaseA
B jar1 2 2 B o tro psjararaca P AͲB J
B jar2 3 B o tro psjararaca S erin ep rotease
B jar2 4 B o tro psjararaca S erin ep rotease
B jar2 7 B o tro psjararaca .1%-
B jar5 0 B o tro psjararaca S erin ep rotease
B jar7 9 B o tro psjararaca S erin ep rotease
B jar8 2 B otrop sja ra ra cussu B ju ssu S PͲI
B jar9 6 B o tro psjararaca B oth rom b in
C ad a8 0 Cro talu sa da ma nte us S erin ep rotease
Calb 9 2 Cryp te lytro psalb ola b ris Th rom b inͲlikeen zym e
Calb 9 5 Cryp te lytro psalb ola b ris Th rom b inͲlikeen zym e
C atr5 5 Cro ta lu sa trox C atroxaseII
C atr6 6 Cro ta lu sa trox C atroxaseI
Ccer7 8 Cerastescerastes P roag g reg an tS erin ep rotease
C d u r1 2 3 Cro talu sd urissuste rrificus G yroxin
C d u r2 Cro talu sd urissuste rrificus S erin ep rotease
C rh o1 2 5 Callo sela smarh od ostoma A n crod
C rh o1 3 7 Callo sela smarh od ostoma A n crodalp h aͲfib rin og en ase
D acu 1 0 1 Deina gkistro do na cu tus D A VͲP A
D acu 1 0 4 Deina gkistro do na cu tus Th rom b inͲlikeen zym e
D acu 1 0 5 Deina gkistro do na cu tus A avͲS PͲI
D acu 1 1 6 Deina gkistro do na cu tus A cu tin
D acu 1 1 8 Deina gkistro do na cu tus Th rom b inͲlikeen zym e
D acu 1 2 7 Deina gkistro do na cu tus Th rom b inͲlikeen zym e
D acu 1 2 8 Deina gkistro do na cu tus D A VͲX
D acu 1 2 9 Deina gkistro do na cu tus Th rom b inͲlikeen zym e
D acu 1 3 2 Deina gkistro do na cu tus Th rom b inͲlikeen zym e
D acu 4 Deina gkistro do na cu tus Th rom b inͲlikeen zym e
D acu 4 2 Deina gkistro do na cu tus Th rom b inͲlikeen zym e
D acu 4 3 Deina gkistro do na cu tus A avͲS PͲII
D acu 4 6 Deina gkistro do na cu tus Th rom b inͲlikeen zym e
D acu 5 Deina gkistro do na cu tus A cu b in
D acu 5 3 Deina gkistro do na cu tus Th rom b inͲlikeen zym e
D acu 5 8 Deina gkistro do na cu tus Th rom b inͲlikeen zym e
D acu 5 9 Deina gkistro do na cu tus Th rom b inͲlikeen zym e
D acu 6 Deina gkistro do na cu tus A cu b inII
D acu 6 1 Deina gkistro do na cu tus Th rom b inͲlikeen zym e
D acu 6 5 Deina gkistro do na cu tus Th rom b inͲlik een zym e
D acu 8 4 Deina gkistro do na cu tus A cu tob in
D acu 9 9 Deina gkistro do na cu tus DA VͲK N
D ru s1 2 6 Dab oiaru sselliisia me nsis V en omFactorVA ctivatorA lp h a
D ru s1 3 0 Dab oiaru sselliisia me nsis V en omF actorVA ctivatorG am m a
G b lo1 1 3 G lo yd iu sb lomho ffib re vicau du s H alystase
G b lo1 2 0 G lo yd iu sb lomho ffib re vicau du s K an g sh u an m ei
G b lo1 6 G lo yd iu sb lomho ffib re vicau du s S alm on ase
G b lo2 5 G lo yd iu sb lomho ffib re vicau du s P lasm in og enactivatorH alyͲP A
G b lo4 4 G lo yd iu sb lomho ffib re vicau du s H alyͲII
G h al1 0 8 G lo ydiu sh a lyspa llas P allase
G h al1 4 1 G lo ydiu sh alyspa llas P TL 3
G h al2 0 G lo ydiu sh alyspa llas P TL 1
G h al2 2 G lo ydiu sh alyspa llas S alm ob in
G h al3 0 G lo ydiu sh alyspa llas S alm ob inP recu rsor
G h al6 9 G lo ydiu sh alyspa llas P allab inͲI
G h al7 7 G lo ydiu sh alyspa llas P allab inͲII
G sax3 5 G loydiussa xatilis Th rom b inͲlikeen zym ed efib raseI
G sh e1 0 6 G lo ydiu ssh ed ao en sis Th rom b inͲlikeen zym e
G u ss1 4 G loyd iusussurie nsis C ap illaryp erm eab ilityͲin creasin gen zym e2
G u ss3 G loyd iusussurie nsis Th rom b inͲlikeen zym e
G u ss5 1 G loyd iusussurie nsis C alob in
G u ss8 9 G loyd iusussurie nsis Th rom b inͲlikeen zym ed efib raseI
L m u t1 3 3 La ch esismutamuta G yroxinh om olog
L m u t1 8 La ch esismutamuta S erin ep rotease
L ste1 L ache sissten o ph rys S erin ep rotease
M leb 5 6 M acrovip erale be tin a S erin eb etaͲfib rin og en asep recu rsor
M leb 5 7 M acrovip erale be tin a S erin ealp h aͲfib rin og en asep recu rsor
M leb 1 0 2 M acrovip erale be tin a FactorVactivatin gen zym e
M leb 7 4 M acrovip erale be tin a S erin ep rotease
P ele1 1 1 P roto bo th rop se legan s E leg axob inͲI
P ele1 1 4 P roto bo th rop se legan s E leg axob inͲII
P m u c3 8 P roto bo th ro psmucrosqua ma tu s M u cofiraseͲIII
P m u c4 5 P roto bo th ro psmucrosqua ma tu s M u cofiraseͲIV
P m u c4 7 P roto bo th ro psmucrosqua ma tu s M u cofiraseͲII
P m u c4 9 P roto bo th ro psmucrosqua ma tu s P rep rotrim u b in
P m u c5 2 P roto bo th ro psmucrosqua ma tu s M u cofiraseͲI
P m u c5 4 P roto bo th ro psmucrosqua ma tu s M u cofiraseͲV
P m u c6 7 P roto bo th ro psmucrosqua ma tu s S erp en tokallikreinͲII
P m u c9 4 P roto bo th ro psmucrosqua ma tu s S erp en tokallikreinͲI
Tfla1 2 4 Trime resuru sflavo virid is Flavoxob in
Tfla2 6 Trime resuru sflavo virid is S erin ep rotease
Tfla7 1 Trime resuru sflavo virid is S erin ep rotease
Tfla7 5 Trime resuru sflavo virid is S erin ep rotease
Tg ra1 1 Trime resuru sgra mine us S erin ep rotease
Tg ra1 1 5 Trime resuru sgra mine us S erin ep rotease
Tg ra2 9 Trime resuru sgra mine us S erin ep rotease
Tg ra3 7 Trime resuru sgra mine us S erin ep rotease
Tg ra7 2 Trime resuru sgra mine us S erin ep rotease
Tjer2 8 Trimere su rusjerdo nii S erin ep rotease
Tjer4 0 Trimere su rusjerdo nii S erin ep rotease
Tjer6 8 Trimere su rusjerdo nii S erin ep rotease
V ste1 0 V irid ovip erastejn ege ri S tejn efib raseI
V ste1 0 7 V irid ovip erastejn ege ri K NͲIII
V ste1 1 0 V irid ovip erastejn ege ri K NͲII
V ste1 1 2 V irid ovip erastejn ege ri K NͲX I
V ste1 3 V irid ovip erastejn ege ri K NͲV II
V ste1 5 V irid ovip erastejn ege ri K NͲIV
V ste1 7 V irid ovip erastejn ege ri S erin ep rotease
V ste1 9 V irid ovip erastejn ege ri TS VͲP A
V ste3 4 V irid ovip erastejn ege ri CLͲIII
V ste3 6 V irid ovip erastejn ege ri C LͲIV
V ste3 9 V irid ovip erastejn ege ri C LͲV
V ste4 1 V irid ovip erastejn ege ri S erin ep roteasep lasm in og enactivator
V ste4 8 V irid ovip erastejn ege ri S tejn efib raseII
V ste6 2 V irid ovip erastejn ege ri K NͲV
V ste6 3 V irid ovip erastejn ege ri S tejn ob in
V ste7 V irid ovip erastejn ege ri K NͲX II
V ste8 V irid ovip erastejn ege ri K NͲX III
V ste8 1 V irid ovip erastejn ege ri K NͲIX
V ste8 3 V irid ovip erastejn ege ri C LͲI
V ste8 6 V irid ovip erastejn ege ri K NͲX
V ste8 8 V irid ovip erastejn ege ri K NͲI
V ste9 V irid ovip erastejn ege ri S erin ep rotease
V ste9 0 V irid ovip erastejn ege ri C LͲII
V ste9 1 V irid ovip erastejn ege ri K NͲV I
V ste9 3 V irid ovip erastejn ege ri K NͲX IV
V ste9 8 V irid ovip erastejn ege ri K NͲV III
V m it1 3 8 V aran usmitch elli K allikreinͲV arͲV
V aca1 3 9 V aran usa ca nth urus K allikreinͲV arͲIV
H e lo d e rm a tid a e H h or1 4 2 Helo de rmah orrid u m G ilatoxin
C ó d ig od ea c e sson o N C BI(G I) F a m ília C ó d ig ole tr a sd eq u a tro S e rp e n te Pr o te ín a E la p id a e C o lu b ri d a e V ip e ri d a e V a ra n id a e
A análise dos domínios conservados utilizando o programa on line Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk/) (Finn et al., 2006) mostrou que as sequências da família Elapidae
possuem três domínios, um domínio tripsina, um domínio EGF-like e um domínio de carboxilação vitamina K-dependente (GLA); enquanto que as sequências de todas as outras famílias de serpentes e de répteis venenosos possuem apenas o domínio tripsina conservado. Além disso, enquanto que nas outras famílias de serpentes, há sequências com diferentes ações tóxicas sobre a cascata de coagulação, na família Elapidae, todas as sequências funcionam apenas como ativadoras de protrombina. Por fim, a busca por sequências homólogas nos bancos de dados utilizando o programa BLAST (Altschul et al., 1990), retorna diferentes resultados quando comparamos as sequencias de Elapidae e as demais famílias de serpentes.
Na família Elapidae, a busca por sequências homólogas em outros vertebrados resulta em sequências correspondentes ao fator de coagulação Xa de mamíferos e, inclusive de fatores de coagulação Xa de serpentes da própria família Elapidae (Tabela 13), corroborando anteriormente apresentada (Reza et al., 2006) onde as serino proteases do veneno destas serpentes seriam originadas de duplicações do fator de coagulação Xa do fígado. Entretanto, todas as sequências de serino proteases da família Elapidae que encontramos nos bancos de dados pertencem a espécies endêmicas da Austrália e, portanto, não sabemos se podemos extrapolar estes dados para todas as espécies da família Elapidae devido ao isolamento geográfico que a Austrália sofreu há 23 milhões de anos, no período Oligoceno (Salgado- Laboreau, 1998). Utilizando como grupo externo três sequências de trombinas isoladas do fígado de Cynos puyrrhorgaster (Salamandra, Cpuy1), Elaphe sp. (Serpente, família Colubridae, Ela1) e de Gekko gecko (Lagarto asiático, Ggec1) construímos uma árvore filogenética para as sequências encontradas de serino proteases da família Elapidae (Figura 32). Na árvore, é possível visualizar a duplicação gênica a partir do fator Xa presente no fígado, com a presença de sequências desse tipo em ramos ancestrais ou em ramos irmãos das
sequências oriundas do veneno dessas serpentes. Além disso, podemos observar também que a ativação de protrombina do tipo D parece ser o caráter ancestral, pois só requer uma transformação de caráter (sendo que se fosse a do tipo C requereria duas transformações, ou seja, é menos parcimonioso) e que as enzimas ativadoras de protrombina do tipo C parecem ser uma duplicação exclusiva da subfamília Acantophiinae.
Figura 32: Árvore filogenética de serino proteases de serpentes da família Elapidae. A cor do ramo corresponde pela atividade farmacológica da enzima. A cor do nome da seqüência corresponde à subfamília a qual a serpente que possui esta enzima pertence. No nome de cada seqüência há um código que identifica o tecido de origem da enzima. Os valores de probabilidade posterior após 500.000 ciclos estão indicados nos nós. Para ver os códigos, consultar tabela 12. Ramos com valores de probabilidade posterior menor que 0,70 foram colapsados. E-value
Tabela 13: Sequências homólogas às serino proteases do veneno de Elapidae encontradas no banco de dados do NCBI através do programa BLAST (Altschul et al., 1990).
O rg an is m o P rote ín a C ó d ig od ea ce ss o(N C BI) Id e n tid ad e(% ) EͲva lu e
Daniorerio c oagulationfac torX 53 3eͲ74
Takifugurubripes c oagulationfac torX 51 4eͲ73 G allusG allus c oagulationfac torX 45384308 61 2eͲ89
O rnithorhynchusanatinus c oagulationfac torX 9837158 53 5eͲ80
B ostaurus c oagulationfac torX 58 8eͲ84
S usscrofa c oagulationfac torX 56 1eͲ81
O ryctolaguscuniculus c oagulationfac torX 57 2eͲ83
M usmusculus c oagulationfac torX 56 3eͲ81
Homosapiens c oagulationfac torX 56 1eͲ81
Já com relação às outras famílias de serpentes, a busca por sequências homólogas em outros vertebrados resulta em sequências correspondentes às enzimas presentes na saliva de diversos animais (Tabela 14). Esses dados indicam, portanto, uma origem evolutiva diferente entre as serino proteases presentes no veneno das serpentes da família Elapidae e as presentes no veneno de outras famílias de serpente peçonhentas. Mais uma vez, graças à falta de sequências de serino proteases de serpentes da família Elapidae de outros locais do planeta, não podemos concluir se isso pode ser extrapolado para toda a família Elapidae. De qualquer maneira, por conta da particularidade observada nessas serpentes australianas, podemos concluir que as serino proteases não constituem um ramo monofilético2 nos venenos de serpentes, já que dois ancestrais para essa classe de proteínas no veneno de serpentes: um para as serpentes da família Elapidae australianas e outro para as demais famílias de serpentes.
Tabela 14: Sequências homólogas às serino proteases do veneno de Viperidae, Colubridae, Hydrophiidae, Varanidae e Helodermatidae encontradas no banco de dados do NCBI através do programa BLAST (Altschul et al., 1990).
O rg an ism o P roteín a L ocald eorig ema C ó d ig od ea cess o(N C BI) Id en tid a d e(% ) EͲva lu
B ostaurus K allikreinI P aratóidesalivar 40 1eͲ44
Rattusnov ergicus K allikrein1Ͳrelatedpeptidaseb3 G lândulassalivarepituitária 40 9eͲ42
M usmus culus K allikreinI G lândulassalivarepituitária,testíc ulo,língua,ovário 40 3eͲ42
M usmus culus K allikrein1Ͳrelatedpeptidaseb3 G lândulasalivar,testíc ulo,pânc reas 38 1eͲ41
M usmus culus K allikrein1Ͳrelatedpeptidaseb4 G lândulasalivar 36 9eͲ38
M usmus culus K allikrein1Ͳrelatedpeptidaseb22 G lândulasalivar 40 2eͲ41
M usmus culus E piderm algrow thfac torbindingproteintypeB G lândulasalivar,testíc ulo,c élulashem atopoiétic as 37 5eͲ38
M usmus culus K allikrein1Ͳrelatedpeptidaseb24 G lândulasalivar,testíc ulo 36 5eͲ38
Homos apiens K allikreinI P ooldeglândulas 39 9eͲ42
2
Por fim, observando a árvore filogenética de serino proteases da ordem Squamata (Figura 31) observamos que todas as sequências se agrupam de acordo com a família a qual a serpente que as possui faz parte. Em relação à família Viperidae, podemos verificar que as três principais atividades farmacológicas das serino proteases presentes em seu veneno – ativação de plasminogênio (PA), liberação de bradicinina (KN) e atividade coagulante (CL) – não formam três ramos monofiléticos distintos, ao contrário de estudos anteriores (Wang et al., 2001). Estes estudos, entretanto, apresentam valores estatísticos questionáveis nos nós dos ramos. Em nossa árvore, há um grande número de cópias com diferentes atividades farmacológicas que possuem diferentes graus de parentesco filogenético indicando um grande número de duplicações ao longo do tempo nas mais diferentes espécies de serpentes da família Viperidae.
4.2.2 Inferências evolutivas de fosfolipases de venenos de serpentes da família Viperidae,