ÇOCUK KİTAPLARI VE ŞİİR YAZMA ETKİNLİKLERİ

4.1- Estudo I- Desenvolvimento de um método simples e rápido para preparo de diferentes amostras de tecidos biológicos animais (ovo, músculos, fígado, crustáceos e moluscos) e determinação das espécies de arsênio (AsB, As3+, DMA, MMA e As5+_{) por LC-ICP-MS.}

4.1.1- Equipamentos e acessórios:

As análises foram realizadas utilizando um ICP-MS com cela de reação dinâmica (DRC-ICP-MS ELAN DRCII, PerkinElmer, SCIEX, Norwalk, CT, EUA) operando com argônio de alta pureza (99,999%, Praxair - White Martins, Brasil) e um LC (PerkinElmer L-200, SCIEX) hifenados por um injetor de seis saídas (Rheodyne 9725). O eluente do LC é introduzido diretamente no nebulizador do ICP- MS através de tubos “PEEK” (1,59 mm o.d.) e de conectores “PEEK” de baixo volume morto. A coluna de troca aniônica utilizada foi Hamilton PRP-X100 (Hamilton, Reno, NV, EUA) nas seguintes dimensões: 5 µm, 150 mm x 4,6 mm.

Ambos os equipamentos foram conectados em um computador Dell Pentium 4 com os “softwares” Elan® _{(versão 3.4) e Chromera}® _{(versão 2.1.0.1631), e}

impressora Hewlett-Packard Laserjet 4250 e encontram-se instalados no Laboratório de Toxicologia e Essencialidade de Metais da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – USP, em uma sala limpa classe “1000”.

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O sistema de introdução de amostra utilizado no ICP-MS foi composto por uma câmara de nebulização de quartzo tipo ciclônica e um nebulizador de Meinhard® conectados por tubos Tygon® a bomba peristáltica do ICP-MS (a 20 rpm geralmente). O ICP-MS foi equipado com cone de amostragem e “skimmer” de platina (PerkinElmer, Norwalk, EUA).

Foi também utilizada uma ponteira de ultrassom de titânio Vibracell VC 100 controlada por processador USS-100 (Sonics & Materials, Danbury, CT, EUA).

4.1.2- Reagentes e preparo de soluções contendo as espécies de arsênio:

Foi utilizada água deionizada de alta pureza (Millipore RiOs-DITM_{, EUA,}

resistividade 18,βmΩ cm) para o preparo das amostras, soluções e padrões. Todos os reagentes utilizados foram de grau analítico, exceto os ácidos nítrico (HNO3) e

clorídrico (HCl) (Synth, Brasil) que foram previamente purificados em destilador de quartzo (Kürner Analysentechnik).

O reagente mono-hidrogenofosfato de amônio ((NH4)2HPO4) foi adquirido da

Sigma (Steinheim, Alemanha), di-hidrogenofosfato de amônio ((NH4)H2PO4) e

hidróxido de amônia (NH4OHsol.) foram adquiridos da Fluka (St. Louis, EUA). Ródio e

gálio (10 mg L-1_{) e a solução multi-elementar rastreada (10 mg L}-1_{) contendo arsênio}

foram obtidos da PerkinElmer (Shelton, CT, EUA) e o metanol da J.T. Baker (EUA). Triton® _{X-100 e hidróxido de tetrametil-amônio em água (TMAH) 25% (m/v) foram}

Material e Método 30

Balões, béqueres e tubos cônicos (Becton Dickinson) foram limpos por imersão em HNO3 15% (v/v) por 24 h, lavados cinco vezes com água ultra pura e

secos em câmara de fluxo laminar antes do uso (FADINI e JARDIM, 2000). Os “vials” de plástico utilizados no LC foram submetidos a uma limpeza especial. Logo após a injeção, foram escovados e lavados com Extran®, enxaguados com água de torneira 5 vezes e 3 vezes com água ultra pura e colocados em banho de HNO3 30%

v/v por 48 h. Finalmente foram lavados 3 vezes com água ultra pura e secos em câmara de fluxo laminar.

Todas as soluções estoque das espécies de As foram preparadas na concentração de arsênio de 1000 mg L-1 e armazenadas em frascos âmbar em temperatura menor que 4 o_C.

O As3+ (As2O3, Aldrich, St. Louis, EUA) foi preparado dissolvendo-se a

respectiva massa em relação a arsênio em 25 mL de NaOH 0,18 mol L-1 e acidificado com 25 mL de HCl 0,3 mol L-1_{, o que torna o meio não-oxidante e}

evitando assim a conversão de As3+ a As5+. O As5+ (As2O5.H2O, Aldrich, St. Louis,

EUA) foi preparado dissolvendo-se a massa relativa a arsênio em 25 mL de NaOH 0,18 mol L-1 e acidificado com 25 mL de HNO3 0,3 mol L-1 (meio oxidante).

DMA (C2H7AsO2, Fluka, St. Louis, EUA), MMA (Na2CH3O3.As.6H2O, Chem

Service, West Chester, EUA) e AsB (C5H11AsO2, Fluka, St. Louis, EUA) foram

preparados dissolvendo-se a massa correspondente a arsênio em HNO3 0,15 mol L- 1_{. Soluções intermediárias contendo arsênio a 10 mg L}-1 _{foram preparadas}

solubilizando As3+ em HCl 0,024 mol L-1 e AsB, DMA, MMA e As5+ em HNO3 0,0014

mol L-1. Após o preparo das soluções, foi determinada a concentração real de arsênio por ICP-MS contra uma solução padrão rastreada.

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4.1.3- Avaliação de métodos cromatográficos para separação das espécies arsenobetaína (AsB), arsenito (As3+), dimetil arsênio (DMA), monometil arsênio (MMA) e arsenato (As5+_):

Foram avaliadas as colunas C8 (3 µm, 33 x 4,6 mm, Brownlee Aq, PerkinElmer, EUA), C18 (5 µm, 150 x 4,6 mm, Brownlee Aq, PerkinElmer, EUA) e troca aniônica (5 µm, 150 x 4,6 mm, Hamilton PRP X-100), bem como fases móveis variadas contendo trocadores aniônicos ou pareadores iônicos, como descrito na Tabela 5.1.1. Os volumes de injeção de amostra e vazão da fase móveis avaliados variaram de 5-100 µL e de 0,7-1,0 mL min-1, respectivamente.

4.1.4- Avaliação do uso de padrão interno e da interferência pelo poliatômico 40_Ar35_Cl+_:

Foram avaliadas os isótopos 71Ga, 69Ga e As5+ com injeção pós coluna em um sistema em fluxo utilizando uma bomba peristáltica complementar de 8 canais (Ismatec IPC, EUA) nas concentrações de 0,5-5 e 2-10 µg L-1 para Ga e As5+, respectivamente. O sistema em fluxo utilizado está descrito no item 4.1.8. O cloreto pode causar interferências na determinação de arsênio (m/z= 75), assim, 100 µL de uma solução contendo ácido clorídrico 1% v/v foi analisada para avaliação da interferência.

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4.1.5- Avaliação do uso de metanol e ácido nítrico na solução extratora, estudo da influência do tempo e da massa de amostra na extração das espécies de arsênio e parâmetros analíticos de validação:

O material de referência DOLT-3 (100mg) foi utilizado para avaliação do uso do metanol e ácido nítrico como extratores. As concentrações de metanol e ácido nítrico estudadas foram de 2-60% e de 0,1-20% v/v, respectivamente. Na avaliação da influência do tempo e da massa na eficiência de extração foi utilizado o material de referência DORM-3. Os tempos de sonicação e as massas estudadas variaram de 0-4 min e de 10-80 mg, respectivamente. Para todos os experimentos, as condições otimizadas adotadas estão descritas na Tabela 4.1.1. Nesta etapa também foram avaliados os parâmetros analíticos de validação como limite de detecção (3xDPbranco/coeficiente angular), coeficiente de correlação linear (R) e

intervalo de linearidade.

4.1.6- Determinação de arsênio total em amostras e materiais de referência de tecidos diversos:

As determinações de arsênio total nas diversas amostras e materiais de referência foram conduzidas de acordo com Batista et al. (2009c). As amostras e materiais de referência (aproximadamente 80 mg) foram pesados em triplicata e 1 mL de TMAH 50% (v/v) foi adicionado. Após, as amostras permaneceram em homogeneização rotacional (Tecnal TE 165, Brasil) por 24 horas. Então o volume foi

Material e Método 33

completado para 10 mL com um diluente contendo 0,5% (v/v) HNO3 e 0,01% m/v

Triton® X-100. Em todas as determinações de arsênio total foi utilizado o Rh como padrão interno na concentração de 10 µg L-1. O limite de detecção do método (3xDPbranco(n=20) x fator de diluição) foi de 0,023 µg g-1. Demais condições do ICP-MS

estão na Tabela 4.2.1.

4.1.7- Especiação de arsênio em amostras de tecidos biológicos (músculos de peixe, boi e frango, ovo, moluscos e material de referência) por LC-ICP-MS:

Previamente a cada análise, o LC foi exaustivamente purgado com água em todos os canais e os filtros ligados à tubulação também foram limpos. As amostras foram injetadas com seringa em um “loop” de 200 µL. Todas as separações foram realizadas em temperatura de 25oC, sob condições isocráticas. A fase móvel, preparada diariamente, foi feita de acordo com Sanz et al. (2005), empregando-se 10 mmol L-1 HPO42-/H2PO4- 98% (v/v) + metanol (MeOH) 2% (v/v), em pH 8,5.

Padrões de calibração analítica para espécies de arsênio foram preparadas diariamente, no intervalo de 2–20 µg L-1 _{por meio de diluições em série em MeOH}

2% (v/v) e HNO3 0,4% (v/v). A vazão da fase móvel utilizada foi de 1,0 mL min-1. A

quantificação foi feita baseada na calibração externa e área do pico. O equipamento utilizado está descrito no item 4.1.1 e a Tabela 4.1.1 resume as condições operacionais da técnica empregada para especiação química de arsênio em amostras de tecidos utilizando a técnica de LC-ICP-MS.

Material e Método 34

TABELA 4.1.1. Condições operacionais do LC-ICP-MS para determinação de arsênio total e especiação de arsênio em amostras de tecidos biológicos.

Condições do LC

Coluna Hamilton PRP-X100 (5 µm, 150 mm x 4,6 mm)

Fase móvel 10 mM HPO42-/H2PO4- (pH 8,5)+MeOH 2%(v/v)

Vazão da fase móvel 1 mL min-1

Temperatura da coluna 25o_C

Tempo de equilíbrio 1 min

Tempo de corrida 9,0 min

Tempo de lavagem 1 min

Modo Isocrático

Volume de injeção 100 µL

Quantificação Área do pico

Condições experimentais do ICP-MS Potência de rádio frequência 1200W

Modo de varredura “Peak hopping”

Vazão do gás (Ar) Plasma 15 L min-1_{; auxiliar 1,2 L min}-1

Vazão do gás de nebulização 0,86-0,98 L min-1

Padrão interno 103_{Rh (10 µg L}-1_{) para As total}

Padrão interno 69Ga (0,5 µg L-1) em confluência; bomba peristáltica a 10 rpm (0,5 mL min-1_{) para especiação de arsênio}

Interface Cones de platina

Cone de amostragem 1,1mm

“Skimmer” 0,9mm

Resolução 0,7 u

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4.1.8- Preparo das amostras de tecidos biológicos e material de referência para extração e especiação de arsênio por LC-ICP-MS:

O método desenvolvido para a extração das espécies de arsênio nos tecidos biológicos animais em estudo consistiu na utilização de metanol em meio ácido. Cerca de 50mg de amostra foram colocadas em tubos de fundo cônico de 15 mL. Posteriormente, foi adicionado 1 mL de extrator composto por HNO3 2 % (v/v) +

MeOH 10% (v/v) e agitado em “vortex” por 1 minuto. Essa mistura foi sonicada por 2 minutos utilizando uma ponteira de ultrassom (80% de amplitude, 50 W de potência e 20 kHz de frequência). Com o intuito de evitar contaminações, a ponteira foi lavada com água ultra pura, sonicada em solução de HNO3 2 % (v/v) por 20 segundos e

lavada com água ultra pura novamente. Finalmente, foi adicionado água ultra pura até 5mL, as amostras foram filtradas em filtros de celulose de 0,2 µm (Sartorius Stedim Biotech, Almanha) e 100 µL do extrato filtrado foram injetados no LC-ICP- MS. A Figura 4.1.1 mostra os procedimentos de tratamento e extração das amostras de tecidos.

O gálio foi utilizado como padrão interno na concentração de 0,5 µg L-1 em HNO3 0,2% v/v com sistema de injeção em fluxo. A bomba peristáltica do ICP-MS foi

colocada em 10 rpm (0,5 mL min-1_{) durante todo o experimento. O sistema de}

injeção em fluxo foi composto por uma confluência com duas entradas: a-) um tubo “peek” (diâmetro interno de 0,18 mm) vindo do LC para a confluência e; b-) um tubo “peek” (diâmetro interno de 0,76 mm) da bomba peristáltica do ICP-MS para a confluência; e a mistura para o nebulizador do ICP-MS. As condições estão descritas na Tabela 4.1.1.

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Seleção de 10g de partes comestíveis

Mistura dessas partes e congelamento a -80o_C

Liofilização

Moagem criogênica e homogeneização (<150µm tamanho de partícula)

50mg amostra + extrator (1mL de MeOH 10% v/v+ HNO32%v/v)

Diluição até 5mL com água ultra pura

Filtração do sobrenadante (filtro de celulose de 0,2 µm)