Çevre Eğitiminde Tarihsel GeliĢim

7.1 A Importância da Sequência CPMG

A sequência CPMG foi utilizada, pois se trata de uma sequência do tipo spin-eco otimizada, desta forma gasta muito menos tempo para fazer as medidas do que a spin eco convencional. Com ela, em uma só sequência é possível obter n séries de ecos ao passo que no spin-eco convencional é preciso N sequências para obter n séries ecos [2]. O pulso inicial de inversão foi necessário, pois o sinal da água é muito intenso (cerca de 90% do plasma é composto de água), portanto são necessários muitos pontos para digitalizá-lo. Infelizmente, o equipamento utilizado não apresenta gradientes e nem alta resolução dinâmica (possui apenas 12 bits), então foi necessário utilizar técnicas para suprimir o sinal da água. A técnica utilizada para suprimir o sinal da água foi a aplicação de um pulso de inversão z e posterior filtragem do sinal ajustando-se adequadamente o parâmetro inv.

Figura 23:

Sinal de água: A) sem o pulso de inversão B) com pulso de inversão

Além da água, os metabólitos de alto peso molecular presentes no plasma contribuem para o alargamento das linhas do espectro. Por isso foi necessária uma maneira de filtrar a contribuição deles. Estes metabólitos de alto peso molecular apresentam tempos de relaxação mais rápidos, pois seus prótons não apresentam muita mobilidade devido ao tamanho da molécula de qual fazem parte. Como não apresentam muita mobilidade, eles interagem intensamente entre si, e por isso apresentam um decaimento rápido no FID. Para filtrar a contribuição destes metabólitos utilizou-se um

tempo ao eco (tempo de captação do sinal após o início do FID) de 150ms, este tempo de acordo com Mika Ala-Korpela [12] é mais do que o suficiente para filtrar a sua contribuição. È preciso muito cuidado ao escolher um tempo ao eco, pois se for escolhido um tempo muito curto o sinal dos metabólitos de alto peso molecular não é bem filtrado. Se o tempo escolhido for muito grande, além de filtrar os metabólitos de alto peso molecular, filtra-se também a parte de interesse (baixo peso molecular), diminuindo a amplitude de todo espectro, o que causa perda de informação.

7.2 O Processo de Fitting da Albumina

Ao comparar o espectro da albumina com o do plasma diretamente não é possível fazer uma análise quantitativa, pois sabemos apenas a concentração da solução de soro albumina bovina (40mg/ml), mas não sabemos a concentração de albumina no plasma sanguíneo, por isso é necessário que se faça um ajuste (tratamento matemático) a fim de saber relativamente à quantidade de albumina presente no espectro de plasma.

Fitting, ou ajuste em português, é um processo de construção de uma curva ou função matemática que tem o melhor ajuste para uma série de dados. Ele é importante, pois com ele podemos fazer a comparação entre espectros semelhantes de maneira mais precisa, sabendo até a contribuição de um espectro para o outro.

O processo de fitting é semelhante ao processo de deconvolução (dividir uma função maior em funções menores). Para cada pico do espectro gerou-se uma função Lorentziana; pois a transformada de Fourier do FID (função exponencial decrescente) é uma função Lorentziana. Após criar as funções Lorentzianas para cada pico somou-se a contribuição da amplitude do espectro de albumina, desta forma o espectro “fitado” seria equivalente ao espectro real do plasma medido.

Uma função Lorentziana é dada pela seguinte fórmula:

2 2 0 ) .( 4 . 2 w x x w A y y c + − + = π (45)

Onde y representa o eixo das ordenadas, y0 representa um valor inicial no eixo

das ordenadas, A representa a amplitude do pico, w representa a largura de meia altura do pico, x representa eixo das abscissas e xc representa a posição do centro do pico no

eixo das abscissas.

Os valores utilizados como entrada no Microcal Oringin 6.0 para criar as curvas Lorentziana foram:

Figura 24: valores utilizados como entrada no Microcal Oringin 6.0.

Os valores a1 até a8 representam o termo 2A/ʌ dos oito picos presentes no

espectro do plasma onde A representa a amplitude de cada pico, xc1 ate xc8representa a

posição no eixo das abscissas no centro de cada um dos oito picos e w1 até w8 representa

a largura de meia altura dos oito picos. Ao lado de cada valor encontra-se o erro percentual.

alb é o valor inicial da amplitude do espectro de solução de albumina que foi calculado pelo programa Microcal Oringin, este não é um valor de entrada, mas sim o valor de saída. Ele representa o “valor” do ajuste, é o fitting propriamente dito. Como o TSP foi normalizado a 1 no eixo y podemos considerar esse valor como porcentagem. Desta forma, a albumina contribui em cerca de 26% na amplitude de espectro da amostra de plasma.

Abaixo encontra-se o espectro do plasma e o espectro da albumina (com a amplitude corrigida) na mesma escala e sobrepostos:

Figura 25: Fitting do espectro do plasma sanguíneo.

7.3 Análise Espectral

No gráfico acima, pode-se observar que as linhas do espectro de albumina em relação ao do plasma são muito mais largas, com isso pode se concluir que a albumina, além de aumentar a amplitude do espectro, alarga as linhas dos picos, dificultando a identificação dos mesmos.

O pico n° 1 é o sinal do TSP. Pode-se perceber que o pico do TSP no espectro da albumina está para cima enquanto o pico do TSP no espectro do plasma esta para baixo. Isto provavelmente ocorreu pois o tempo de repetição (tempo de relaxação total da amostra antes de começar outra série de pulsos) para amostra de plasma foi de 10 segundos. Como o TSP apresenta um alto valor de T1 ele não voltou totalmente a sua

magnetização para o eixo z, ficando uma parte em –z, por isso o seu pico está para baixo. Já o tempo de repetição da amostra com albumina foi de 15 segundos, tempo mais que o suficiente para a magnetização longitudinal voltar para seu estado de equilíbrio.

O pico n° 2 é referente ao sinal dos hidrogênios do grupo CH3, que geralmente

se encontram no final das longas cadeias carbônicas. Já o pico n° 3 é referente aos hidrogênios do grupo CH2, que geralmente encontram-se ao longo da cadeia. O pico n°

4 é referente ao sinal dos hidrogênios do radical metileno. O pico n° 5 é referente aos sinais dos hidrogênios ligados ao grupo acetila e dos hidrogênios ligados aos carboidratos acetilados em cadeias de glicoproteínas [12].

O pico n° 6 foi um pico inesperado que apareceu no espectro, provavelmente surgiu devido ao sinal proveniente de algum metabólito produzido por uma colônia de bactérias. O deslocamento químico próximo de 2,24 ppm é bem conhecido por este motivo [8].

Os picos 7 e 8 são referentes a algumas sobreposições de espectros, entre elas interações causadas quando o EDTA reage com os íons Ca+2 e o Mg+2. O EDTA atua como anti-coagulante pois compete com as enzimas da cascata de reações coagulativas pelos íons Ca+2. Este íon é fundamental para o processo de coagulação. Já o íon Mg+2 possui propriedades químicas muito semelhantes as do íon Ca+2 ambos são metais alcalinos ferrosos. Quando o EDTA reage com estes íons o ambiente químico sentido pelos hidrogênios da molécula sofrem uma ligeira alteração, pois ocorre um modificação da nuvem eletrônica. Com a mudança dos ambientes químicos altera-se o

chemical shift dando origem a estes dois sinais.

O pico 9 é ao sinal dos hidrogênios do grupo N+(CH3)3 da lipoproteína

fosfatidilcolina, que é um dos maiores componentes biológicos das membranas celulares [12].