2.3. Enzimler
2.3.1. Çalışmalarda kullanılan enzimler ve literatür çalışmaları
Bu kısımda çalışmalarda kullanılan enzimlerin yapıları, görevleri, özellikleri, yer aldıkları ilaç bileşimleri ve literatürde bulunan bazı farklı tayin çalışmaları anlatılacaktır.
2.3.1.1. Kreatin kinaz (CK)
Kireatin kinazın yapısında bir polipeptid zinciri bulunmaktadır. Zincirin kristal yapısı Şekil 2.28’de [426] gösterilmiştir. Yapısında 381 amino asit bulundurmaktadır.
Bir katalitik enzim olan kreatin kinaz, fosfokreatin, kreatin ve adenozin difosfatın adenozin trifosfata tersinir çevrimlerinden sorumludur. Ruhsal bozukluklar için serum belirteci olarak kullanılabilmektedir [427]. Ayrıca serum içerisindeki miktarı, miyokard enfarktüsü ve kas miyopatisi gibi doku yaralanmaları durumunda arttığından teşhis için kullanılmaktadır. Nedeni bilinmeyen bir şekilde siyahi insanların kanında beyazlara göre daha fazla bulunduğu tespit edilmiştir [428]. Üç farklı izoenzim halinde bulunabilmektedir; MM iskelet kaslarında bulunan, CK-MB kalpte bulunan ve CK-BB beyinde bulunan izoenzimleri ifade etmektedir [429]. Herhangi bir ilaç bileşiminde varlığı tespit edilmemiştir.
Literatürde kreatin kinazın tayin edilmesinde kullanılmış bazı çalışmalar aşağıda özetlenmiştir. Liu ve arkadaşları [430] geliştirdikleri amperometrik biyosensör ile tayin gerçekleştirmişlerdir. Polikarbonat üzerine altın kaplanmış elektrot yüzeyine platinyum nanoparçacıkları biriktirildikten sonra oluşan elektrot, Os(II/III) içeren yüksek aktiviteye sahip redox polimeri ile modifiye edilmiştir. Modifiye elektrot üzerine ise yabanturbu peroksidaz, gliserofosfat oksidaz ve gliserol kinaz enzimleri tutturulmuştur. Kreatin kinaz aktivitesi sonrası oluşan ATP, ADP’ye dönüşürken gliserol de gliserol kinaz vasıtasıyla gliserol-3-fosfata dönüşmektedir. Gliserol-3-fosfat gliseroGliserol-3-fosfat oksidaz vasıtasıyla dihidroksiasetona dönüşürken oksijen de hidrojen perokside dönüşmektedir. Hidrojen peroksit yabanturbu peroksidaz enzimi vasıtasıyla suya dönüşürken osmiyum yüksektgenme ve indirgenme reaksiyonu vererek bir akım oluşturmaktadır. Tayin aralığı 10,01 – 2748,05 U/L olarak belirtilmiştir. Fujima ve Danielson [431] kapiler elektroforez sistemini kullanmışlardır. Kreatin kinazın substratı olan fosfokreatin ile ADP varlığında reaksiyonu sonucu oluşan ATP’nin UV dedektör ile ölçümüne dayanmaktadır. Tayin aralığı 1 – 100 U/L olarak belirtilmiştir. Romero ve Castro [432] gözenekli cam üzerine tutturdukları hekzokinaz ve glukoz-6-fosfat dehidrogenaz enzimleri vasıtasıyla akış enjeksiyon sistemi kullanarak tayin gerçekleştirmişlerdir. Kreatin fosfat ADP varlığında ve kreatin kinaz vasıtasıyla kreatine dönüşürken ATP oluşmaktadır. Oluşan ATP, D-glukoz varlığında hekzokinaz enzimi vasıtasıyla ADP’ye ve D-glukoz da D-glukoz-6-fosfat’a dönüşmektedir. Glukoz-6-fosfat dehidrogenaz enzimi ise D-Glukoz-6-fosfat’ı D-glukono-δ-lakton-6-fosfat’a dönüştürürken NADP+’yı NADPH’a dönüştürmektedir. NADPH’nın floresans ve
absorbansı ölçülerek kreatin kinaz ile bağlantı kurulmuştur. Tayin aralığı absorbans için 0,1 – 2,0 U/L, floresans için 0,01 – 1,00 U/L olarak belirtilmiştir. Aminlari ve Rezaian [433] kreatin fosfat ve ADP arasında kreatin kinaz katalizliğinde gerçekleşen reaksiyon sonucu, kreatin oluşmasından faydalanmışlardır. Kreatin ve rho-nitrofenilglioksal arasında hafif bazik şartlar altında gerçekleşen reaksiyon sonucu oluşan renkli kompleksin absorbansının ölçülmesine dayalı yöntem geliştirilmiştir. Girotti ve Ghini [434] de kreatin oluşumuna dayalı yöntem geliştirmişlerdir. Oluşan kreatin ve naylon sarmal üzerine tutturulmuş ateş böceği lusiferaz enziminin reaksiyonu sonucu oluşan floresans ölçümüne dayalı tayin gerçekleştirilmiştir. Tayin aralığı 0,1 – 100,0 U/L olarak belirtilmiştir.
Tez çalışması kapsamında uygulanan tayin yöntemiyle bu enzim tayin edilmiştir.
2.3.1.2. Lizozim (LZ)
Lizozimin yapısında bir polipeptid zinciri bulunmaktadır. Zincirin kristal yapısı Şekil 2.29’da [435] gösterilmiştir. Yapısında 129 amino asit bulundurmaktadır.
Lizozim, yaşayan organizmalarda bulunan ve spesifik olmayan bağışıklık sistemi elemanıdır. Altı farklı çeşidi tanımlanmıştır; bakteriyel ve bitki tipi yanında c-tipi tavuk, g-tipi kaz, i-tipi omurgasız, T4 bakteriyofaj tipleri mevcuttur. C-tipi lizozim en çok bulunanıdır ve balıktan birçok memeliye kadar geniş bir çeşitlilikte bulunmaktadır [436]. Yumurta akında bulunan, en iyi karakterize edilebilen antimikrobiyal proteinlerden biridir ve yumurta akında bulunan proteinlerin % 3,5’unu oluşturur. Antibakteriyel özelliklerini gram pozitif bakterilere gösterebildiği gibi gram negatif bakterilerin bazılarına da etki gösterebilmektedir. Bu özelliği sayesinde gıda, kosmetik ve ilaç sektörlerinde geniş bir kullanım alanına sahiptir [437]. Son zamanlarda lizozim bulunan ürünlere karşı alerjik reaksiyonların gerçekleştiğine dair çalışmalar yayınlanmakta ve bu çalışmlara ışığında gıda kanunlarında lizozim kullanımına ilişkin sınırlamalar getirilmeye başlanmıştır [438]. İnsanlarda bulunan lizozim ise gözyaşı, tükürük ve sütte bulunabilmektedir. İnsan sütünde bulunması ile bakteri, virüs ve mantarlara karşı koruma sağlamaktadır [439]. Herhangi bir ilaç bileşiminde varlığı tespit edilmemiştir.
Literatürde lizozimin tayin edilmesinde kullanılmış bazı çalışmalar aşağıda özetlenmiştir. Cai ve arkadaşları [440] Cd dop edilmiş ZnSe kuantum noktaları kullanarak rezonans rayleigh saçılması metodu ile tayin gerçekleştirmişlerdir. Hazırlanan kuantum noktaları glutatyon ile modifiye edilmiştir. Modifiye kuantum noktalarının lizozim ile kurdukları kompleks GSH üzerinden gerçekleşmektedir. Lizozimde bulunan NH3+ grupları GSH de bulunan COO- grupları ile elektrostatik etkileşime girerek kompleks oluşturmaktadır. Bu sayede agregasyon artmakta ve kompleks boyutu büyümekte dolayısıyla da ışık saçılması artmaktadır. Tayin aralığı 0,08 - 2,00 µg/mL olarak belirtilmiştir. Qian ve arkadaşları [441] BSA ile modifiye edilen floresans yapabilen altın naoparçıklarını kullanarak bir floresans metodu geliştirmişlerdir. Lizozim bağlanması arttıkça floresans sinyalinde de artma gözlenmiştir. Tayin aralığı 2,0x10-7
– 8,0x10-6 mol/L olarak belirtilmiştir. Li ve arkadaşları [442] elektro oluşumlu kemiluminesans aptasensörü geliştirmişlerdir. Lizozim bağlayıcı aptamer altın elektroda tututurulmuştur. Elektro oluşumlu kemiluminesans ajanı olarak Ru(bby)32+ kullanılmıştır. Sistem lizozim ve kemiluminesans ajanının, aptamerin bağlayıcı bölgelerine yarışmalı olarak bağlanmasıyla çalışmaktadır. Aptamer ve Ru(bby)32+ bulunan ortama lizozim
eklendiğinde, lizozim seçimli kompleks oluşmakta ve dolayısıyla floresans sinyalinde düşme gerçekleşmektedir. Tian ve arkadaşları [443] La3+
-TiO2-zeolit mikro kolonu vasıtasıyla adsorpsiyon yöntemi kullanarak lizozim zenginleştirmesi yaptıktan sonra absorbans ölçümü yapmışlardır. Tayin aralığı 10 – 100 mg/L olarak belirtilmiştir. Wang ve arkadaşları [444] AFM kantileverinin eğilmesi sonucu oluşan rezonans değişikliklerini kullanarak tayin gerçekleştirmişlerdir. Altın kantilever, dodenkantiyol ile modifiye edildikten sonra lizozim ile etkileştirildiğinde lizozimin adsorbe olduğu görülmüştür. Adsorpsiyon sonrası kantileverin rezonans frekansı değişmektedir. Tayin aralığı 10,0 ng/L – 0,1 mg/L olarak belirtilmiştir. Sun ve arkadaşları [445] voltametri tekniği kullanmışlardır. Alizerin kırmısı S molekülünün voltametrik indirgeme pik şiddetinin lizozim ilavesi ile azaldığı belirtilmiştir. Bu azalmanın alizerin kırmısı S ile lizozim etkileşimi sonrası oluşan büyük molekülden kaynaklandığı belirtilmiştir. Tayin aralığı 0,8 – 35,0 mg/L olarak belirtilmiştir.
Tez çalışması kapsamında uygulanan tayin yöntemiyle bu enzim tayin edilmiştir.
2.3.1.3. Tripsin (TRY)
Tripsinin yapısında bir polipeptid zinciri bulunmaktadır. Zincirin kristal yapısı Şekil 2.30’da [446] gösterilmiştir. Yapısında 223 amino asit bulundurmaktadır. Pankreatik serin proteaz enzimi olan tripsinin substrat seçiciliği, pozitif yüklü lisin ve arginin yan dallarından kaynaklanmaktadır. Ester, amit ve peptit bağlarını hidroliz edebilmektedir [447]. Pankreastan ince bağırsağa salgılanarak proteinlerin parçalanmasında görev almaktadır [448]. Süt kazeininin hidrolizi, bebek gıdalarının ön özütleme işlemi, insan insülininin kısmi sentezi, proteomik çalışmaları için proteinlerin peptitlere parçalanması gibi pek çok uygulaması mevcuttur [447]. Protein parçalanması konusundaki üstün özelliği sayesinde pek çok çalışmada yer almaktadır [449]. Herhangi bir ilaç bileşiminde varlığı tespit edilmemiştir.
Şekil 2.30. Tripsin zincirinin ikincil yapısı
Literatürde tripsinin tayin edilmesinde kullanılmış bazı çalışmalar aşağıda özetlenmiştir. Hu ve arkadaşları [450] BSA ile modifiye edilmiş altın nanoparçacıklarının floresans özelliklerini kullanarak tayin gerçekleştirmişlerdir. Ortama katılan tripsinin, nanoparçacık çevresinde bulunan BSA proteinini parçalaması sonucu floresans sinyalinde azalma gözlenmiştir. Tayin aralığı 0,01 – 100,00 µg/mL olarak belirtilmiştir. Neff ve arkadaşları [451] silikon bazlı tabakanın direncini ölçmeye dayalı yöntem geliştirmişlerdir. Negatif yüklü silikon oksit yüzey üzerine pozitif yüklü poli-L-lisin adsorbe edilmiştir. Ortama eklenen tripsin ise adsorbe poli-L-lisini parçalayarak desorpsiyon gerçekleştirmektedir. Bu nedenle yüzey yükü değişmekte, yüzey potansiyeli düşmekte ve ölçülen tabaka direnci ise artmaktadır. Tayin aralığı 0,5x10-4
– 1,0 mg/mL olarak belirtilmiştir. Braca ve arkadaşları [452] hidrofobik etkileşim kromatografisi ve kapiler elektroforez tekniklerini kullanmışlardır. Hidrofobik etkileşim kromatografisi tekniğinde CNBr-aktiveli sefaroz kolon basit pankreatik tripsin inhibitörü ile modifiye edilmiştir. İnhibitör ile tripsinin oluşturduğu kompleksin absorpsiyonun ölçülmesi ile tayin gerçekleştirilmektedir. Kapiler elektroforez tekniğinde ise silika bazlı kapiler ve UV dedektör kullanılmıştır. Tayin aralığı 5 – 14 µg/mL olarak belirtilmiştir. Seegopaul ve Rechnitz [453] α-benzoil arginin amit molekülünün tripsin katalizliğinde amonyak oluşturmasından faydalanmışlardır. Oluşan amonyak prob ile ölçülerek
tayin gerçekleştirilmiştir. Tayin aralığı 0,5 – 20,0 µg/mL olarak belirtilmiştir. Suzuki ve arkadaşları [454] sentezledikleri tosil-L-arginil-L-fenil alanin molekülünü subtrat olarak kullanarak tayin gerçekleştirmişlerdir. Tripsin ile reaksiyon sonrası fenilalanin serbest kalmakta ve floreskamin ile reaksiyona sokularak floresans sinyali ölçülmektedir. Mayoral ve arkadaşları [455] spesifik substrat olarak (CBZ-L-alanil-L-arginin)2-rodamin-110 kullanarak floresansa dayalı ölçüm gerçekleştirmişlerdir. Tripsinin substrat ile reaksiyonu sonucu ortaya çıkan rodamin-110 floresansı ölçülmüştür. Tayin aralığı 1 – 10 ng/mL olarak belirtilmiştir.