FUNGAL İNFEKSİYONLARDA MİKROBİYOLOJİK TANI- SORUNLAR. Dr. Betil ÖZHAK BAYSAN Akdeniz Üniversitesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı

FUNGAL İNFEKSİYONLARDA MİKROBİYOLOJİK TANI-

SORUNLAR

Dr. Betil ÖZHAK BAYSAN

Akdeniz Üniversitesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı

• Candida türleri ve Aspergillus türleri İnvaziv fungal infeksiyon (İFi)’lere neden olan başlıca etkenlerdir.

Candida

Aspergillus

Fusarium Cryptococcus neoformans

- Hematopoietik kök hücre transplantasyonu (HSCT) hastalarında İFİ insidansı;

İnvaziv aspergillozis (İA) %43, invaziv kandidiyazis (İC) %28*

-Solid organ transplant (SOT) hastalarında;

kandidiyazis %53, İA %19 **

*Kontoyiannis DP ve ark. CID 2010.

** Peter G. Pappas ve ark. CID 2010.

FUNGAL İNFEKSİYONLARDA MİKROBİYOLOJİK TANI

• Klinik

• Mikrobiyoloji

• Histopatoloji

• Radyoloji

FUNGAL İNFEKSİYONLARDA MİKROBİYOLOJİK TANI

• Konvansiyonel yöntemler

– Direkt mikroskobik inceleme-Boyama – Kültür

• Serolojik yöntemler

– Antijen-antikor saptanması

• Moleküler yöntemler

Direkt mikroskobik inceleme-boyama yöntemleri

• Gram

• Giemsa

• Kalkoflor beyazı

• PAS

• H&E

• Wright

• Gomori

metanamin gümüş

• Fontana-Masson

• KOH

• Çini mürekkebi

Direkt mikroskobik inceleme-boyama yöntemleri

Örnekler;

• Uygun yerden ve yeterli miktarda

– Kan 20-30 ml,

– BOS ≥2 ml santrifüj, – steril sıvı 10ml)

• Laboratuvara hızlı transport

– Kan ≤2s OI,

– BOS ≤15 dk OI, 30 C ≤ 24 s OI)

• Hemen işleme alınması

• Klinik ön tanı

Direkt mikroskobik inceleme-boyama

• Avantajlar Hızlı

Uygulaması kolay yöntem

Uygun klinik bilgi ile birlikte özgül morfolojik özellikler (Aspergillus türleri çapı eşit hifler 4-6 µm, 45

açı ile dallanır. Septumsuz hifler kurdele gibi kıvrımlı ve 90 lik açı ile dallanma Zygomycetes,

pigmentli hifler Feohifomikoz

tanısı ) incelenerek tanımlamaya yardımcı olabilir.

• Dezavantajlar

Artefaktlar (yalancı negatif ve yalancı pozitif sonuçlar ortaya çıkabilir) Parçalanmış lenfositler

(BOS C. neoformans)

Kollajen lifler, eküvyon lifleri (kalkoflor ile hif)

Yağ damlacıkları (tomurcuklanan maya)

Örnek miktarı az ise duyarlılık çok düşer.

Kesin tanı koyduramaz.

•Negatif direkt mikroskobik inceleme mantar infeksiyonunu dışlamaz.

Kültür

Kültür

• Altın standart

• Kandidemi tanısında kan kültürü çok değerli

• Kandidemide kan kültürünün duyarlılığı ortalama%50

• Sıklıkla sonuç en az 5 günde çıkmaktadır.

• Mikroorganizma identifikasyonu ve gerekirse antifungal

duyarlılığın belirlenmesi için yapılmalı

Kültür

• İzolasyon

– Selektif ve selektif olmayan besiyerleri birlikte kullanılmalı (BHI agar, SABHI agar, sikloheksimit, kan, A.B, zeytinyağı ilaveli besiyerleri …vs.)

MAYALAR

• İdentifikasyon

– Koloni morfolojisi, – Germ tüp testi

– Mısır unlu tween 80 besiyerinde morfolojik görünüm – Kromojenik besiyerleri

– Kapsül

– Üreaz aktivitesi

– Otomatize sistemler (Phonex, MALDI-TOF MS)

• Kan kültüründen tür düzeyinde direkt tanımlama

– Candida PNA-FISH (Peptid nükleik asit floresan in situ hibridizasyon) kiti ile floresan problar kullanarak patojen mikroorganizma genomundaki hedef bölge tanımlanarak floresan mikroskopla değerlendirilir.

– Kan kültürü şişelerinden Candida albicans-non albicans ayrımı yapılabilmekte

– infeksiyonlarının tanımlanmasında duyarlılığının ve özgüllüğünün yüksek olduğu gösterilmiştir.

– Avantajları; kan kültüründe üreme sinyali alındıktan 1-2 saat içinde C. albicans içerip içermediği anlaşılmış olur.

– C. dubliniensis PNA-FISH probu ile saptanamamaktadır.

MAYALAR

• Kan kültürlerinde C. glabrata izole edilen 19 hastanın 157 epizodu incelenerek üreme zamanları değerlendirilmiştir. Anaerobik kan

kültürü şişelerinde C. glabrata üremesinin %58 oranında daha erken olduğu belirtilmiştir.*

• BACTEC Myco/ F litik şişeleri ile izolasyon oranı artmamaktadır.

Myco/ F litik sistem kullanıldığında C. glabrata daha hızlı üreyebilmektedir.**

* Cobos-Trigueros N. Ve ark JCM 2014.

**Kirby et al. Arch Pathol Lab Med 2009;133:93.

Kültür

KÜFLER

• Koloni morfolojisi

• Laktofenol pamuk mavisi ile mikroskobik inceleme

• Diğer yöntemler (Moleküler yöntemler, MALDI-TOF MS)

Kültür

Kültür

• Avantajlar

Kesin tanı koydurur. Altın Standart yöntem

Cins ve tür düzeyinde tanımlama yapılabilir.

Antifungal duyarlılık testlerinin

çalışılabilmesini sağlar.

• Dezavantajlar

Üreme süresi uzun (küf mantarları erken tanıya yardımı sınırlıdır.

Kontaminasyon riski (küf) yalancı pozitiflik olasılığı

kontaminasyon-kolonizasyon- enfeksiyon ayırımının

yapılması zor.

Duyarlılık düşük (uygun ve yeterli örnek alınmazsa)

Özgüllük değişken

Biyopsi örneklerinde duyarlılık daha yüksek

MALDI-TOF-MS

• Klinik Mikrobiyoloji Laboratuvarlarında mantarların hızlı tanımlanmasında

• Yeni bir yaklaşım.

• Daha çok identifikasyonda kullanılmakta

• Direkt koloniden veya ön ekstraksiyon işleminden sonra mantarların protein profillerinin analizi yapılabilmektedir.

• Peptidlerin kütle parmak izini çıkarmaktadır.

• >%90 konvasiyonel yöntemlerle uyumlu

• Antifungal duyarlılık yapılabiliyor

MALDI-TOF-MS

Veri tabanındaki bilinen türlerin spektraları ile karşılaştırılarak skorlama yapılır

Skor ≥2 :tür düzeyinde identifikasyon

Skor ≥1.7-1.999 genus düzeyinde identifikasyon

Skor ≤ 1.7 doğru identifikasyonun olmadığını gösterir

MALDI-TOF-MS

Bu çalışmada mayalarda değerlendirilmiş.

7 genus 12 tür

%85’inde doğru identifikasyon elde edilmiş.

Van Veen SQ ve ark. JCM 2010;48:900

Dhiman N JCM 2011

• Bruker MALDI-TOF-MS ile Shimadzu MALDI-TOF-MS sistemleri karşılaştırılmış.

• Klasik yöntemlerle maya izolatlarının %96.7’si

• Bruker ile %97.6

• Schimadzu ile %96.1’i doğru tanımlanmış

Serolojik yöntemler

BİYO-BELİRTEÇLER

Fungal infeksiyon TANI, hastalığın İZLEMİ, TEDAVİYE YANIT izleminde kullanılmaktadır.

• Hücre duvar antijenleri ( mannan, -glukan, galaktomannan)

• Kapsül antijeni

• Mannan antikoru (anti-mannan)

• Fungal metabolitler (L/D-arabinitol)

Serolojik yöntemler

Galaktomannan (GM) antijen testi

Aspergillus , Penicillium türlerinin hücre duvarında yer alır.

İnvaziv aspergillosis (IA) için tanı göstergesidir (ECIL, EORTC/MSG ).

• Bir metaanalizde* ,

• Duyarlılık: %71

• Özgüllük: %89

• KİT hastalarında duyarlılık %82’ye çıkmakta

• Allojenik transplant hastalarda duyarlılık daha da yükselir.

• SOT hastalarında duyarlılık %22

*Pfeiffer CD ve ark. CID. 2006

Serolojik yöntemler

• ESCMID IDSA/ECIL öneri gücü ve kanıt düzeyi

Serum ve BAL/BL örneklerinde GM laboratuvara geldiğinde en kısa sürede çalışılmalı (AI)

Serum +4C de uzun süre bekletildiğinde GM parçalanıp yalancı negatif sonuçlar vermektedir.

BAL örnekler -20 C saklanabilir stabilitesi iyi

• İA tanısında kan GM değerliliği;

HKHN nötropenik hasta (AI)hematolojik malignite nötropenik hasta (AII) non- nötropenik hasta (BII)  YBÜ hastaları ve SOT alıcıları (CII)

Tüm hasta gruplarında akciğer aspergillozu tanısı BAL da GM (AII)

GM: Sorunlar

• GM performansını etkileyen faktörler

– İnfeksiyonun yeri

– Etken Aspergillus türü – Antifungal kullanımı

– M.o tarafından salınan galaktomannan molekül yapısı – İmmunsupresyon derecesi (nötrofil sayısı)

– Hastanın karaciğer ve böbrek fonksiyonları – Galaktomannan Ab varlığı

– Örneklerin saklama koşulları

• Örneklerin çalışma sıklığı

• Örnek tipi (serum, BAL, BOS)

• Testin eşik değeri (cut-off) farklılıkları

GM: Sorunlar

Yalancı pozitiflikler

-Otoantikorların varlığı -Immunglobulin

-Siklofosfamit

-Amoksisilin-klavulanik asit

-Piperasilin-tazobaktam tedavisi -Diğer mikozların varlığı

Cuenca-Estrella M.JAC 2011.

Serolojik yöntemler

1,3 -D-Glukan testi

• Maya ve küflerin hücre duvarında

• Candida spp.

Aspergillus spp.

Pneumocystis jirovecii

• Mantarların polisakkarit yapıdaki karakteristik hücre duvar elemanıdır.

• Diğer polisakkaritler ile çapraz reaksiyonu yoktur.

• Plazma, serum, BAL, BOS örneklerinde beta–glukan aktivitesi

• Antifungal tedavisi ile azalmaz. Panfungal tarama sağlar.

• FDA onaylıdır

Cryptococcus Blastomyces

dermatitidis Zygomycetes

-D-Glukan

1,3 -D-Glukan testi Kullanılan yöntem

Kabul edilen eşik sınır değeri testin performansını etkilemektedir.

İnvazif kandidiyazis

İnvazif Aspergillozis benzer tanısal değer

İFİ radyolojik ve klinik belirtiler ortaya çıkmadan 5-10 gün önce saptanabilir.

Ardışık iki pozitif testin özgüllük(%98.9) ve NPV(%94.6) değerleri yüksek olup tanıda değerlidir.

Duyarlılık düşük (%49.6) olduğundan -Glukan test klinik, radyolojik, mikrobiyolojik testlerle birlikte değerlendirilmelidir.

Lamort F ve ark. CID.2012 54(%):633-43.

-D-Glukan

mikroorganizma -D-Glukan testi Duyarlılık (%) Özgüllük (%)

Candida spp. serum 77.6-81.3 87.1-92.4

Aspergillus spp. serum 55-95 77-96

P. jirovecii serum 94.8 86.3

Marios Arvanitis M ve ark. Clin. Microbiol Reviews 2014

-D-Glukan

• Pneumocystis pnömonisi tanısında β-Glucan testi

• Özgüllük %94, duyarlılık %98, NPV, %99.8, PPV %64.7

• Negatif sonuç PcP’nin olmadığını kesinleştirir.

• β-Glucan düzeyi ile hastalığın şiddeti arasında ilişki yok

• Serum ve BAL örnekleri kullanılabilir

-D-Glukan

• Yanlış pozitiflik oranları yüksek

bazı antitümör preparatlar, antibiyotikler albümin, globulin kullanılması

hemodiyaliz hastalarında sellüloz membran kullanılması gazlı bez

• Örneklerde ardışık iki kez pozitiflik oranları düşük

• Rutin tanıda destekleyici

• Test çok pahalı

Kit

Cut-off

Pg/ml Yöntem Duyarlılık% Özgüllük%

Fungitec-G-MK

Test 20 kromojenik 55-94 76-86

-Glucan Test 11 turbidimetrik Kromojenik

50-95 84-98

Fungitell (FDA onaylı)

60-80

80

kromojenik 88-90 90-94

Karageorgopoulos D.E. -D-Glucan Assay for the Diagnosis of Invasive Fungal Infections: A Meta-analysis. CID 2011;52(6):750-70.

Serolojik yöntemler

• Mannan antijen/Antimannan antikor

invaziv Candidiasis mannan ve anti-mannan Ab testlerinin birlikte va ardışık serum örneklerinde birden fazla çalışmalarla* duyarlılık (%80) ve özgüllük(%93) oranları artmıştır.C. albicans duyarlılık

%100 olarak bildirilmiştir.

• ECIL klavuzunda kandidemi (CII)

İnvaziv kandidiasis (BII) tanısında önerilmektedir.

•

• D-arabinitol

• Enolaz, aldolaz candida enzimlerine karşı Ab larda kullanılmaktadır.

*ECIL-3 Non-Invasive Diagnostic Procedures for Yeast Infections 25-29 September 2009 Juan- Ies-Pins France

Serolojik yöntemler

Lateral Akım Yöntemi (Lateral-Flow Device)LFD

• Aspergillus türlerinin aktif çoğalma aşamasında salgıladıkları

ekstraselüler glikoproteine karşı geliştirilen monoklonal antikor (JF5) kullanılarak gerçekleştirilen immünkromatografik yöntemdir.

• Aspergillusa spesifik, hızlı, hasta başında uygulanabilir.

• BAL, serum BII-BIII

LFD

• 103 hematolojik malignite, 529 serum

• Serumda LFD performansı PCR ve GM ile karşılaştırılmıştır.

• PCR+LFD: Duyarlılık %77.3 (57-90), Özgüllük:%100(94-100)

• PCR+GM: Duyarlılık %77.3 (57-90), Özgüllük:%100(94-100)

serum LFD PCR GM

Duyarlılık (%) 81.8 95.5 77.3

Özgüllük(%) 98 96.6 91

PPV(%) 66.7 56.8 60.7

NPV(%) 92.6 97.7 90.6

Lewis White P. J Clin Microbiol 2013;51:1510-6

Serolojik yöntemler

• Hoenigl M et al.Performance of Galactomannan, Beta-d-Glucan, Aspergillus Lateral-Flow Device, Conventional Culture, and PCR Tests with

Bronchoalveolar Lavage Fluid for Diagnosis of Invasive Pulmonary Aspergillosis. J Clin Microbiol. 2014 Jun;52(6):2039-45.

• 78 bağışıklığı baskılanmış hasta 78 BAL örneği,

• 3 kanıtlı, 14 yüksek olasılıklı, 17 düşük olasılıklı İA, 44 non-İA

• Kültür dışındaki yöntemlerin duyarlılığı %70-88

• GM + LFD: Duyarlılık %94 Özgüllük %95

• GM + PCR: Duyarlılık %100 Özgüllük %98

• Konvansiyonel kültür ve

• Beta glukan duyarlılık düşük

Moleküler yöntemler

• Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR)

Avantajlar

Kısa sürede sonuç Kültürde zor üreyen

mantarların gösterilebilmesi Nükleik asit miktarlarının

saptanması

Sorunlar

• Standardizasyon

uygun örnek seçimi

• Doku

• Steril vücut sıvıları (BOS )

• Bronkoalveolar lavaj (BAL)

• Kan fraksiyonları (serum, plazma, tam kan)

uluslararası standartar yok mantar DNA miktarı ile kantitatif sonuç değerlendirme güçlükler)

• Kontaminasyon

• Kolonizasyon-infeksiyon ayırımı X Real-time PZR

• Proflaksi /antifungal tedavinin DNA salınımına etkisi

• Antifungal kullanımı duyarlılığı etkiliyor.

İFİ tanısında PZR rehberlerde yer almamaktadır.

Moleküler yöntemler

• İFİ tanısında Aspergillus PCR testi

• Klavuzlarda, EORTC/MSG kriterleri arasında PCR testleri henüz yer

almamaktadır.

• Kültür dışı yöntemler arasında; PCR testleri önemli

cins ve tür düzeyinde tanımlama

potansiyel azol direnci saptanması

PCR

• PCR testlerinin yeterince validasyonlarının yapılıp

standardize edildiklerinde İFİ tanısında EORTC/MSG kriterleri arasında yer alabileceği belirtilmiştir.

• İA tanısında GM-EIA ve -D-Glukan duyarlılık ve

özgüllük değerlerinin sırasıyla (%81.6-%91.6) ve (%76.9-

%89.4) olduğu, PCR testi ile benzer duyarlılık (%76.8-

%88), özgüllük (%75-%94.5) belirtilmiştir.

Lewis White P ve ark. CID 2015:61;1293-1303.

PCR

IA GM-EIA -D-Glukan PCR

Duyarlılık (%) Kan 79.3

BAL 83.6-85.7

Kan 56.8-77.1 Kan 84-88 BAL 76.8-79.6

Özgüllük (%) Kan 80.5-86.3 BAL 89.0-89.4

Kan 81.3-97 Kan 75-76 BAL 93.7-94.5

Lewis White Pve ark CID 2015:61;1293-1303.

Karageorgopoulos DE,ve ark Clin Infect Dis 2011; 52:750–70.

Lamoth F, ve ark. Clin Infect Dis 2012; 54:633–4 Mengoli C ve ark. Lancet Infect Dis 2009; 9:89–96.

Pfeiffer CD, ve ark. Clin Infect Dis 2006; 42:1417–27.

PCR

• IA GM-EIA ve PCR birlikte duyarlılığı(%91.6), özgüllüğü(%94.4) arttırdığı bildirilmiştir.

Avni T et al. J Clin Microbiol 2012; 50:3652–58.

Cuenca-Estrella M et al J. Clin. Microbiol. 2009; 47:379–384.

• İnvaziv Candidiasis duyarlılık ve özgüllük değişken (% 56.2 -%100) ve (%54-%100)

• Kan kültürü negatif olan yüksek riskli İC hastalarında PCR pozitifliğinin saptanmasının önemi belirtilmiştir.

• İC tüm hasta gruplarında duyarlılık %95, özgüllük %92

• Proven/probable hastalarda %85 PCR pozitiflik, kan kültür pozitifliği %38 saptanmıştır.

Avni T ve ark J. Clin. Microbiol. 2011. 49:665–670.

Marios Arvanitis M et.al Clinical Microbiology Reviews 2014 ;27 (3): 490–526.

Moleküler yöntemler

• Nükleik asitler

Hibridizasyon Amplifikasyon

• Uygun klinik örnek seçimi

• DNA ekstraksiyonu

hücre duvarının uzaklaştırılması (kimyasal, enzimatik, mekanik) 18S rRNA bölgesi panfungal,

28S rRNA bölgesi cins, ITS tür

• primerler

• İnternal kontrol

• Multipleks PCR

Yeni yöntemler

• Raman spektrometrisi (SERRS) altın veya gümüş metal düzeyde özel boya ile kaplanmış DNA’nın yaydığı ışığı özel sensörleriyle algılayan yeni bir

tekniktir.

• Mikro array yöntemi çok sayıda işaretsiz probun cam, naylon veya silikon yapıdaki katı yüzeylere yapıştırılıp tanımlanacak olan DNA’nın floresan işaretli primerler kullanılarak PCR ile çoğaltılması esasına dayanan hibridizasyon tekniğidir. Lazer teknolojisi ile bağlanan ve bağlanmayan problara bakılarak tür tayini yapılır.

• T2 Nuclear magnetic resonance (T2MR) tam otomatik direkt kandan candida türlerini saptayan yeni moleküler yöntemdir.*

• Volatil organik bileşiklerin nefeste saptanması 2 pentil-furan nefes testi

İnvaziv Aspergillus fumigatus hastalarının nefeslerinde saptanmıştır.**

*Mylonakis E. et al. CID 2015 **Chambers ST ve ark. Med Mycol 2011.

SONUÇLAR

• Klasik yöntemler duyarlılıkları düşük olmasına rağmen altın standart,

• Serolojik testlerin uygulama kolaylığı ve standart kitlerinin olması ile tanı klavuzlarında yer

almakta

• ancak tek başlarına değil klasik yöntemlerle birlikte kullanılması önerilmektedir.

• Hızlı tanı için PCR testlerinin standardizasyonu üzerinde çalışılmaktadır.

• Diğer moleküler yeni yöntemlerin karşılaştırmalı

çalışmaların yapılmasına ihtiyaç duyulmaktadır.

TEŞEKKÜRLER

TEŞEKKÜRLER

mikroorganizma Tanı testleri örnek Duyarlılık (%)

Özgüllük (%) Yanlış pozitiflik Yanlış negatiflik

Candida spp. Kültür

-glukan CAGTA

kan serum serum

50-60 77.6-81.3 77-89

95 87.1-92.4 91-100

-

Diğer fungal inf,sellüloz bilinmiyor

-

Hemolizli örnek,cut-off değerleri

bilinmiyor Aspergillus spp. Histopatoloji

Kültür

Galaktomannan Ag

-glukan Lateral-flow Ag





Serum,BAL,BOS Serum

Serum,BAL

100 30-68 71, 90 55-95 48-100

100 72-100 89, 94 77-96 100

Fusarium, Scedosporium

Hemolizli örnek,cut-off değerleri

bilinmiyor

Pneumocystis spp.

-glukan Serum ^94,8 86.3

Cryptococcus spp.

Kültür Histopatoloji Ag

BOS BOS BOS, serum

95 75 97, 87

100 100 93-100

bilinmiyor bilinmiyor Trichosporon sp.

In conclusion, using the BACTEC 9240 system, either a TTP

≤56.5 h or growth only or earlier in aerobic flasks is useful to rule out the presence of C. glabrata. In addition, in settings with an 12% prevalence of C. glabrata candidaemia, yeast detection

exclusively

or earlier in anaerobic vials increases the probability of

C. glabrata being present to 58%. Knowing the type of medium in which the growthis detectedwould improve the value of TTP in

predicting

the presence of C. glabrata and could be useful for early treatment optimization.