Hepatit B Virus DNA Düzeyi Tayini ve Eş Zamanlı
Olarak YMDD Motif Mutasyonu Analizi Yapan
Gerçek Zamanlı PCR Testi*
A Real-Time PCR Assay for the Quantification of
Hepatitis B Virus DNA and Concurrent Detection of
YMDD Motif Mutations
Harun AĞCA1, A. Arzu SAYINER2, Aylin ŞENGÖNÜL2, İlkay ŞİMŞEK3, Mesut AKARSU3
1 Kütahya Doç. Dr. Mustafa Kalemli Tavşanlı Devlet Hastanesi, Mikrobiyoloji Laboratuvarı, Kütahya. 1 Kutahya Doç. Dr. Mustafa Kalemli Tavsanli State Hospital, Microbiology Laboratory, Kutahya, Turkey. 2 Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İzmir.
2 Dokuz Eylul University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Izmir, Turkey. 3 Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi, Gastroenteroloji Bilim Dalı, İzmir.
3 Dokuz Eylul University Faculty of Medicine, Department of Gastroenterology, Izmir, Turkey.
* Bu çalışma Dokuz Eylül Üniversitesi Bilimsel Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir.
ÖZET
Kronik hepatit B enfeksiyonu tedavisi için lamivudin alan hastalarda tedavi takibinde genotipik yön-temler ve viral DNA düzeyi tayini yönyön-temleri kullanılmakta olup, yoğun bir iş yükü ve uzun bir zaman gerektirmektedir. Bu çalışmada, aynı testte eş zamanlı olarak hepatit B virusu (HBV) DNA düzeyi tayini ve YMDD (tirozin, metionin, aspartat, aspartat) motif mutasyonu analizini gerçekleştirebilecek yeni bir test geliştirilmesi hedeflenmiştir. Test, YMDD motifine özgü hibridizasyon probu temelli gerçek zaman-lı polimeraz zincir reaksiyonu (Rt-PCR) ile gerçekleştirilmiştir. YMDD motifinin belirlenmesi için erime noktası sıcaklığı analizi kullanılmıştır. HBV-DNA düzeyi 1000 ile 3 milyon kopya/ml arasında değişen standart serum örneklerinin (VQC S2220) çalışılmasıyla elde edilen standart eğri kullanılarak viral DNA düzeyi tayin edilmiştir. Geliştirilen yöntem, viral yük tayininde kullanılan kantitatif ticari bir kit (Artus HBV RG PCR; Qiagen, Almanya), ticari “line prob” (INNO-LiPA HBV DR v1.0; Innogenetics, Belçika) ki-ti ve DNA dizi analizi yöntemleriyle karşılaştırılmıştır. Çalışmada, kronik hepaki-tit B enfeksiyonu olan ve tek başına lamivudin tedavisi alan, HIV ve HCV antijen ve antikorları negatif 20 hastaya (7 kadın, 13 er-kek; yaş aralığı: 27-70 yıl) ait 38 serum örneği test edilmiştir. Geliştirilen yöntemin analitik duyarlılık sı-nırının 200 kopya/ml, dinamik aralığının ise 1 x 103ile 3 x 107 kopya/ml arasında olduğu tespit
edil-Geliş Tarihi (Received): 03.05.2011 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 27.06.2011
İletişim (Correspondence): Uzm. Dr. Harun Ağca, Tavşanlı Doç. Dr. Mustafa Kalemli Tavşanlı Devlet Hastanesi, B Blok,
miş; yöntemin PCR etkinliği 1.98 olarak belirlenmiştir. Geliştirilen yöntem ve ticari kit ile elde edilen log10HBV-DNA kopya/ml değerleri arasında yüksek bir korelasyon saptanmıştır (r= 0.681). Geliştirilen yöntem ile erime noktası sıcaklığı (Tm) analizine göre YMDD motifi mutasyonu araştırılmış ve Tm değe-ri YMDD için 59.86°C, YVDD için 56.34°C ve YIDD için 55.10°C olarak belirlenmiştir. Homojen viral po-pülasyon içeren örneklerde, geliştirilen yöntemin sonuçları dizi analizi ve LiPA ile benzer bulunmuş; ka-rışık viral popülasyon içeren serum örneklerinin analizinde ise geliştirilen yöntemin baskın olan viral ti-pi belirlediği testi-pit edilmiştir. Sonuç olarak, çalışmamızda geliştirilen bu testin hızlı, güvenilir ve tekrar-lanabilir bir biçimde HBV-DNA düzeyi tayini ve YMDD motifi analizini, aynı çalışmada eş zamanlı ola-rak iki saat süre içinde gerçekleştirebildiği belirlenmiş; bu yöntemin, lamivudin tedavisi almakta olan kronik hepatit B enfeksiyonlu hastaların takibinde kullanılabilecek uygun bir yöntem olduğu düşünül-müştür.
Anahtar sözcükler: Hepatit B virusu; HBV-DNA; lamivudin; direnç; mutasyon; YMDD; gerçek zamanlı
po-limeraz zincir reaksiyonu.
ABSTRACT
Monitoring therapy in chronic hepatitis B patients receiving lamivudine therapy, is done by two different assays; determination of viral load and genotypic resistance. These methods are labor inten-sive and time consuming. It was aimed to develop an assay to quantitate hepatitis B virus (HBV) DNA in serum and detect YMDD (thyrosine, methionine, aspartate, aspartate) motif mutations in the same run. The assay was based on real-time polymerase chain reaction (Rt-PCR) with YMDD-specific hybri-dization probes. Determination of YMDD motif was done by melting temperature analysis. External standard curve was used for quantifying viral DNA, which was generated by standard sera (VQC S2220) including HBV-DNA between concentrations of 1000 to 3 million copies/ml. The assay was compared with commercial quantitative kit (Artus HBV RG PCR; Qiagen, Germany), commercial line prob assay (INNO-LiPA HBV DR v1.0; Innogenetics, Belgium) and direct DNA sequencing method. Thirty-eight serum samples obtained from 20 chronic hepatitis B patients (7 female, 13 male; age ran-ge: 27-70 years) treated with only lamivudine and were negative for HIV and HCV antigen and anti-bodies were tested in the study. The analytical sensitivity of the assay was found as 200 copies/ml, with a dynamic range of 1 x 103to 3 x 107 copies/ml. PCR efficiency of the in-house assay was found to be 1.98. Comparison of log10HBV-DNA concentrations determined by the in-house and commercial qu-antitative kits showed a significant correlation (r= 0.681). Melting temperature (Tm) analysis was used for the YMDD motif determination and found to be 59.86°C for YMDD, 56.34°C for YVDD and 55.10°C for YIDD. The results of the in-house assay, DNA sequencing and LiPA were concordant in samples with homogeneous virus population, and in-house assay could also detect the major type of YMDD motif in mixed viral populations The Rt-PCR method which was developed in this study is a ra-pid, accurate and reproducible method for quantifying HBV-DNA and detecting the predominant YMDD motif in the same run in two hours duration. It was concluded that this method may be a con-venient tool for monitoring HBV-infected patients receiving lamivudine treatment.
Key words: Hepatitis B virus; HBV-DNA; lamivudine; resistance; mutation; YMDD; real-time PCR.
GİRİŞ
Hepatit B virusu (HBV) hepatotropik DNA virusu olup, kronik enfeksiyona yol açar. Dünya genelinde yaklaşık 350 milyon kişi HBV ile kronik olarak enfektedir1,2. Kronik HBV
kul-lanılmaktadır. Lamivudin ve adefovir ile ilgili çok sayıda veri mevcut olup, entekavir, tel-bivudin ve tenofovir kullanıma giren diğer ilaçlardır3.
Lamivudin {(-) 2’,3’-dideoksi-3’-thiasitidin} zincir sonlandırıcı özelliği ile HBV-DNA replikasyonunu inhibe eder4. Lamivudin güvenilir, etkin ve pahalı olmayan bir ilaç
ol-masına karşın, viral yükteki artış ve serum alanin aminotransferaz (ALT) düzeyindeki ar-tışla birlikte ortaya çıkan ilaç direnci önemli bir sorundur. Viral polimeraz bölgesindeki YMDD motifinde bulunan ikinci aminoasitteki (rtM204V/I/S) mutasyon lamivudin di-rencine neden olmaktadır5-7. Tam olarak viral süpresyonun sağlanamadığı veya direnç gelişen hastalarda, lamivudin ya bir başka ilaçla değiştirilmeli ya da farklı bir nükleotid analoğu ile kombine edilmelidir3,8. Viral süpresyon HBV-DNA düzeyi ile takip edilir. Ge-notipik yöntemler ve viral DNA takibi direnç gelişimini takip etmede kullanılan yöntem-lerdir. HBV-DNA düzeyindeki bir logaritma (log) artış, dirençli mutantların ortaya çıktı-ğının göstergesidir. Sıklıkla kullanılan genotipik yöntemler ise dizi analizi, LiPA (line prob assay) ve restriksiyon enzim analizidir (REA)9. Tedavi takibinde iki farklı yöntemin
kullanılması (viral DNA düzeyi belirlenmesi ve genotipik direnç tayini) maliyeti artırmak-ta, yoğun iş yükü gerektirmekte ve uzun zaman almaktadır. Bu çalışmada, HBV-DNA düzeyi ve eş zamanlı olarak YMDD motif mutasyonunu saptayabilecek gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (Rt-PCR) testinin geliştirilmesi amaçlanmış ve bu yöntemin lamivudin alan hastalarda tedavi takibi ve ilaç değişimine karar vermede yardımcı ol-ması hedeflenmiştir.
GEREÇ ve YÖNTEM
Hastalar ve Klinik Örnekler
Bu çalışmada tek başına lamivudin tedavisi almakta olan 20 kronik hepatit B hastası-na (7 kadın, 13 erkek; yaş aralığı: 27-70 yıl, ortanca yaş: 50 yıl) ait 38 serum örneği kul-lanıldı. Hastalardan altısı HBeAg pozitif iken, kalan 14’ü negatif bulundu. Hastaların ta-mamının genotip D ile enfekte olduğu S gen bölgesinden yapılan dizi analizi ile belirlen-di. Tüm hastaların anti-HCV, anti-HDV ve anti-HIV1/2 testleri negatif ibelirlen-di. Serum örnekle-ri lamivudin tedavisinin başlangıcından 2-32 hafta içeörnekle-risinde alınarak alikotlandı ve kul-lanılıncaya kadar -80°C’de saklandı. Hastaların her birinden 1-3 arasında serum örneği alındı.
Viral DNA Ekstraksiyonu
Viral DNA 200 µl serum örneğinden üretici firma önerileri doğrultusunda “High Pure Viral Nucleic Acid Kit” (Roche Applied Science, Mannheim, Almanya) kullanılarak ger-çekleştirildi. Saflaştırılmış serum ekstraktları LiPA testi, dizi analizi ve geliştirilen Rt-PCR testinde kullanıldı.
LiPA Testi (INNO-LİPA HBV DR)
Dizi Analizi
HBV genomunun polimeraz gen bölgesi PCR ile çoğaltıldı. Seçilmiş primerler olarak; ön-cül primer; 5’-CCCTGCTCGTGTTACAGGCGG-3’ (188-208. nükleotidler), revers primer; 5’-GTTGCGTCAGCAAACACTTGGCA-3’ (1176-1198. nükleotidler) kullanıldı. 50 µl’den oluşan PCR karışımı içerisinde 10 µl DNA ekstraktı, 0.2 mM dNTP, 0.5 mM MgCl2, 20 pmol öncül ve revers primer, 1.5 U Taq DNA polimeraz (Hot Start Taq DNA polymerase, Fermen-tas, Vilnius, Litvanya) ve 5 µl 10x Taq bulunmaktaydı. PCR, 94°C’de denatürasyon sonra-sı, 54°C’de 1 dakika, 72°C’de 2 dakikadan oluşan 35 siklustan oluşuyordu. Ürünler, etid-yum bromür ile boyandıktan sonra %2’lik agaroz jel elektroforezi ile tespit edildi. Ampli-konlar ticari kit ile (High Pure PCR Product Purification Kit; Roche Applied Science) saflaş-tırıldı. PCR ürünlerinin dizi analizi, her iki dizi için ayrı ayrı gerçekleştirildi (Macrogen Inc. Seul, Kore). Mutasyonlar referans HBV-DNA dizileri ile karşılaştırılarak tespit edildi.
Serum HBV-DNA Kantitasyonu
Viral DNA miktarı, ticari bir Rt-PCR kiti ile (Artus HBV RG PCR kit, Qiagen Inc., Ham-burg, Almanya) üretici firma önerileri doğrultusunda tayin edildi. 200 µl plazmadan ti-cari kit (Qiagen Inc., Hamburg, Almanya) ile ekstrakte edilen DNA kullanıldı.
Geliştirilen Eş Zamanlı HBV-DNA Analizi ve YMDD Motif Mutasyonu Analizi Testi Polimeraz gen bölgesinde 680 ile 783. nükleotidler arasında yer alan ve Cane ve ar-kadaşları10tarafından tanımlanan PCR primerleri (5’-TACTAGTGCCATTTGTTCAGTGG-3’ ve 5’-CACGATGCTGTACAGACTTGG-3’) kullanıldı. Bu yöntemde Cy5 ve FAM ile işaretli hibridizasyon probları ile Cane10tarafından tarif edilen üç probdan sadece YMDD moti-fi için belirlenen prob kullanıldı (Şekil 1). Primer ve prob dizileri GenBank’tan elde edi-len farklı HBV genotipleri ile karşılaştırılarak kontrol edildi (Şekil 2).
HBV-DNA kantitasyonu için, 1000 ile 3 milyon kopya/ml arasında viral DNA içeren beş farklı serum örneğinden oluşan VQC S2220 paneli (güncel adıyla Acrometriks, ABD) kullanıldı. Her çalışmada paneldeki beş farklı serum örneği de kantitasyonu belirlemek amacıyla kullanıldı.
PCR, cam kapillerler içerisinde LightCycler 2.0 (Roche Diagnostics) cihazında gerçek-leştirildi. Reaksiyon parametreleri üretici firma önerilerine göre belirlendi. En uygun kon-santrasyonun tespitinde, en yüksek floresansın tespit edildiği en düşük siklus (Ct) belir-lendi. Amplifikasyon için 2x premiks Taq (2mM MgCl2) içeren 25 µl’lik reaksiyon
karışı-Şekil 1. Geliştirilen Rt-PCR yönteminde HBV-DNA düzeyi tayini ve YMDD motif mutasyonu analizinde
kullanı-lan problar (HBV genotip D için belirlenen dizi üstte yer almaktadır. Fam ve Cy5 arasındaki floresans rezonans enerji transferi 670 nm dalga boyunda elde edilmektedir).
Genotip D ….CCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGG… CCCCCACTGTTTGGCTTTCAG TATATGGATGATGTGGTATTGG
Y M D D
Şekil 2.
Prob (a,b) ve primer (c,d) dizilerinin GenBank’
tan indirilen farklı genotipteki HBV
-DNA dizileri ile karşılaştırılması (en üstt
e yer alan sıra primer veya prob
mı kullanıldı. Her bir prob ve primerden 8 pmol ve 5 µl ekstrakte edilmiş DNA, reaksi-yon karışımına dahil edildi. PCR programı; 95°C’de 10 saniyelik işlem sonrasında, 95°C’de 3 saniye, 50°C’de 10 saniye, 72°C’de 10 saniyeden oluşan 45 siklusluk program olarak belirlendi. Hasta serumlarının tamamından yapılan izolasyon ve amplifikasyon ça-lışmaları tekrar edilerek ikili çalışıldı.
YMDD motif mutasyonu tespitinde erime noktası sıcaklığı analizi kullanıldı. Bu yön-temde PCR sonrası elde edilen ürün önce 95°C’ye kadar ısıtıldı, ardından hızlıca 40°C’ye soğutuldu ve sonra yeniden 95°C’ye ısıtıldıktan sonra saniyede 0.2°C’lik ısı azaltımı esnasında 670 nm dalga boyunda elde edilen floresansdaki değişim incelendi. Vahşi tip ve mutant türlerinin tayininde YMDD, YVDD ve YIDD içeren HBV-DNA’nın klonlanlanmış gen fragmanları kullanıldı. Klonlanmış gen fragmanları 104 kopya/ml
konsantrasyonda idi.
Geliştirilen yöntemde mutant ve vahşi tip HBV-DNA içeren karışımların saptama sını-rını tespit edebilmek için, YMDD’nin yanı sıra, YVDD veya YIDD’den yüzde 0, 10, 25, 50, 75, 90 ve 100 oranında içeren örnekler hazırlandı.
Klonlanmış HBV-DNA Gen Fragmanları
YMDD bölgesinde farklılık gösteren (YMDD, YVDD ve YIDD) klonlanmış HBV-DNA gen fragmanları, H. G. Niesters ve S. Pas (Erasmus Tıp Merkezi, Hollanda) tarafından sağlandı.
İstatistiksel Analiz
Bu amaçla SPSS (versiyon 11) programı kullanıldı ve p< 0.05 değerleri anlamlı kabul edildi.
BULGULAR
Duyarlılık ve Özgüllük Analizi
Analitik duyarlılık sınırının tespitinde ve eksternal kantitasyon eğrisinin oluşturul-masında VQC referans paneli kullanılmış ve yöntemin analitik duyarlılık sınırı 200 kopya/ml, dinamik aralığının ise 1 x 103-3 x 107kopya/ml olduğu tespit edilmiştir. Geliştirilen yöntemin özgüllüğünün tespitinde 20 farklı kişiden alınmış, HBsAg, anti-HBc ve HBV-DNA negatif serum örneği incelenmiş ve hiçbir örnekte yalancı pozitiflik saptanmamıştır.
Test içi ve testler arası değişkenlik analizinde VQC panel örnekleri kullanılmış, her bir serum örneği üç farklı günde üçer kez çalışılmıştır. Ortalama Ct değerleri, belirsizlik kat-sayısı (CV) ve teste giren HBV-DNA miktarları Tablo I’de gösterilmiştir. Test içi (ortalama 1.02) ve testler arasında (ortalama 1.02) (p= 0.900) yapılan belirsizlik analizinde istatis-tiksel açıdan anlamlı bir fark tespit edilmemiştir.
Vahşi ve mutant tip virusların tespitindeki duyarlılık oranı ise %50/50 olarak saptanmıştır. Gerçek Zamanlı PCR (Rt-PCR) ile Elde Edilen Kantitasyon Değerlerinin Doğruluğu Rt-PCR ile elde edilen kantitasyon değerlerinin doğruluğunun belirlenebilmesi için HBV-DNA içermeyen ve 1 x 103ile 3 x 107kopya/ml HBV-DNA içeren VQC paneli
kul-lanılmış ve geliştirilen yöntemle elde edilen log10HBV-DNA değerleri, beklenen değerler ile yüksek korelasyon göstermiştir (Şekil 4). PCR etkinliği ise 1.98 olarak bulunmuştur.
Viral Yük ve YMDD Motif Mutasyonu Sonuçlarının Karşılaştırılması
Geliştirilen yöntemle elde edilen HBV-DNA düzeyi ve YMDD motif mutasyonu analizi sonuçları ticari bir kit olan Artus HBV RG PCR kit (Qiagen Inc.), LiPA ve dizi analizi sonuç-larıyla karşılaştırılmıştır (Tablo II).
Toplam 18 hastadan elde edilen 38 serum ile yapılan çalışmalarda, geliştirilen yöntem ve ticari Artus kitinin sonuçlarından 18’i her iki yöntemde de dinamik aralık içerisinde bulunmuştur. Örnek sayısı az olmasına karşın her iki yöntemle elde edilen sonuçların log10HBV-DNA korelasyonu incelenmiş ve sonuçların birbirine yakın olduğu tespit edil-miştir (r= 0.681, p= 0.002) (Şekil 5). Geliştirilen yöntemle elde edilen HBV-DNA düzeyi genellikle ticari Artus kitine oranla daha yüksek izlenmiştir. Testler arasında ortalama fark 0.54-1.06 (0.19-2.09) log10kopya/ml olarak bulunmuştur. İki yöntemle yapılan test
so-YIDD YVDD YMDD
40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 0.759 0.659 0.559 0.459 0.359 0.259 0.159 0.050 (d/dT) Fluorescence (670) Temperature (°C) Melting Peaks
Şekil 3. Erime ısısı analizi ile elde edilen YMDD motif erime ısıları.
Tablo I. Geliştirilen Yöntemde Test İçi ve Testler Arası Elde Edilen HBV-DNA Düzeyi Varyasyon Katsayısı (CV)
Örnek Ortalama Ct (CV%)
(VQC paneli) HBV-DNA (kopya/ml) Test içia Testler arasıb
nuçları karşılaştırıldığında; testlerin %27’si (5 serum) 0.5 log10‘dan daha az fark
gösterir-ken, %55’inde (10 serum) 0.5-1 log10kopya/ml fark tespit edilmiştir.
Geliştirilen yöntemde YMDD motif analizi 38 örnekten 36’sında yapılmış, diğer iki ör-nekte ise HBV-DNA düzeyi 1000 kopya/ml’nin altında olduğu için analiz yapılamamıştır. LiPA’da birden fazla bant varsa, koyu renkli olan bant; dizi analizinde ise birden fazla ami-noasit varsa amiami-noasit belirteci yüksek olan baskın tip olarak belirlenmiştir. Geliştirilen yöntem YMDD motif mutasyon analizi açısından dizi analizi ve LiPA ile karşılaştırıldığın-da, karışık örneklerde baskın olan tipin tespit edilebildiği görülmüştür. Tek tip viral po-pülasyon varlığında üç yöntemle elde edilen sonuçlar tam olarak birbiriyle uyumlu bu-lunmuştur. Serum örneklerinden 8’inde (serum no: 5-7, 12-13, 15, 17, 19) dizi analizi ve LiPA ile birbirleriyle uyumlu olarak karışık popülasyon varlığı saptanmasına karşın, bu örneklerin altısında geliştirilen yöntemle baskın olan tip, ikisinde ise (serum no: 6 ve 7) baskın olmayan tip viral popülasyon saptanmıştır.
Dört numaralı hastaya ait örneklerde LiPA ile 204 numaralı aminoasit pozisyonunda herhangi bir sonuç elde edilememiştir. Hastanın dizi analizi sonuçları incelendiğinde, rtM204I mutasyonunun (YIDD) yanı sıra 201. kodonda LiPA ile hibridizasyon probu olu-şumunu engelleyen ilave bir mutasyon daha olduğu tespit edilmiş ve bu durum üretici firmaya da aktarılmıştır. 7.00 6.00 5.00 4.00 3.00 inhouse= 0.02 + 1.00* artus R-Square= 1.00
VQC-HBV-DNA log10 kopya/ml
In-house assay-HBV
-DNA log
10
kopya/ml
3.00 4.00 5.00 6.00 7.00
Tablo II. Lamivudin Tedavisi Alan Hastalardan Tedavinin Farklı Zamanlarında Alınan Örneklerde HBV-DNA
Düzeyi ve YMDD Motif Mutasyonu Analizinin Karşılaştırmalı Sonuçları*
Serum HBV-DNA düzeyi
YMDD motif sonucu (log10kopya/ml
Hasta Serum Geliştirilen Dizi Geliştirilen Artus
no no yöntem analizi LiPA yöntem kiti
1 1 YIDD YIDD YIDD 3.34 < 3.24
2 YIDD YIDD YIDD 5.97 4.55
3 YIDD YIDD YIDD 7.05 5.09
2 4 YIDD YIDD YMDD + YIDD 4.33 4.65
5 YIDD YIDD + YVDD YIDD + YVDD 6.31 5.52
6 YIDD YIDD + YVDD YIDD + YVDD > 7.48 6.00
3 7 YMDD YMDD + YIDD + YVDD YMDD + YIDD + YVDD 3.44 < 3.24
8 YIDD YIDD YMDD + YIDD + YVDD 5.09 4.92
9 YIDD YIDD YIDD 7.02 6.37
4 10 YIDD YIDD ND** 6.34 5.66
11 YIDD YIDD ND** 7.45 6.00
5 12 YMDD YMDD + YIDD YMDD + YIDD 3.78 3.19
13 YMDD YMDD + YIDD YMDD + YIDD 3.34 < 3.24
14 YMDD YMDD YMDD + YVDD < 3.00 < 3.24
6 15 YMDD YMDD + YIDD YMDD + YIDD 4.09 < 3.24
16 YMDD YMDD YMDD 6.28 5.39
7 17 YMDD YMDD + YIDD + YVDD YMDD + YIDD + YVDD 4.87 3.94
18 YVDD YVDD YVDD > 7.48 7.54
19 YVDD YMDD + YVDD YMDD + YVDD 6.83 5.20
8 20 YVDD YVDD YVDD > 7.48 5.41
21 YVDD YVDD YVDD > 7.48 6.36
9 22 YMDD YMDD YMDD 5.07 < 3.24
10 23 YMDD YMDD YMDD < 3.00 < 3.24
24 YMDD YMDD YMDD 3.39 < 3.24
11 25 YMDD YMDD YMDD 7.15 5.06
12 26 ND YMDD YMDD < 3.00 < 3.24
27 YMDD YMDD YMDD 4.52 4.71
13 28 YMDD YMDD YMDD 3.99 < 3.24
14 29 YMDD YMDD YMDD < 3.00 5.06
15 30 YMDD YMDD YMDD 3.31 < 3.24
31 YMDD YMDD YMDD > 7.48 6.97
In-house assay-HBV
-DNA log
10
kopya/ml
ARTUS-HBV-DNA log10 kopya/ml
8 7 6 5 4 3 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
Şekil 5. Hasta serumlarına ait sonuçların geliştirilen yöntem (dikey eksen) ve ticari Artus kiti (yatay eksen) ile
karşılaştırılması.
Tablo II. Lamivudin Tedavisi Alan Hastalardan Tedavinin Farklı Zamanlarında Alınan Örneklerde HBV- DNA
Düzeyi ve YMDD Motif Mutasyonu Analizinin Karşılaştırmalı Sonuçları (devamı)*.
Serum HBV-DNA düzeyi
YMDD motif sonucu (log10 kopya/ml
Hasta Serum Geliştirilen Dizi Geliştirilen Artus
no no yöntem analizi LiPA yöntem kiti
17 33 YMDD YMDD YMDD > 7.48 7.06
34 YMDD YMDD YMDD 7.26 5.77
18 35 YMDD YMDD YMDD 4.16 4.73
19 36 ND YMDD YMDD < 3.00 < 3.24
20 37 YMDD YMDD YMDD 4.39 3.89
38 YMDD YMDD YMDD 5.11 4.63
* HBV-DNA düzeyi tayininde geliştirilen yöntem ve Artus kiti karşılaştırılırken, YMDD motif mutasyonu analizinde geliştirilen yöntem, dizi analizi ve LiPA yöntemleri karşılaştırılmıştır. Kalın karakterler, baskın olan viral popülasyonu göstermektedir.
TARTIŞMA
Lamivudin kronik HBV tedavisinde yaygın olarak kullanılan bir ilaçtır. Viral polimeraz geninde bulunan YMDD motifinde görülen mutasyon nedeniyle tedavi takibinde YMDD motif mutasyonu analizi ve viral yük tayini önem taşır. Tedaviden önceki viral yük ve te-davi süresi, mutasyon gelişimini etkilemektedir. Tete-davi süresinin beş yıla uzadığı olgular-da mutasyon oranı %60-70’e varabilmektedir11. Antiviral direnç gelişiminde önce direnç-le ilgili mutantlar saptanırken, bunu viral yük artışı ve ALT düzeyindeki artış takip eder11,12.
Bu çalışmada geliştirdiğimiz yöntem, HBV-DNA düzeyi tayini ve eş zamanlı olarak YMDD motif mutasyonu analizini hızlı ve pahalı olmayan bir şekilde gerçekleştirebilmek-tedir. Bu yöntemde YMDD mutasyonu analizi için erime noktası sıcaklığı (Tm) analizine dayalı YMDD motifine özgü hibridizasyon probları kullanılmıştır. Problar yüksek düzey-de korunmuş olan bir bölgedüzey-den seçildiği için farklı HBV genotiplerindüzey-de düzey-de kullanılabilir; ancak bu çalışmada sadece genotip D’nin bulunması nedeniyle, konu ile ilgili daha ileri çalışmaların yapılması gerektiği düşünülmüştür. Tmanalizi ile mutant virusların (YIDD ve-ya YVDD) vahşi tipten daha düşük erime noktası sıcaklığı gösterdikleri, ayrıca mutant vi-rusların da kendi aralarında farklı Tmdeğerleriyle birbirinden ayırt edilebildikleri saptan-mıştır. Geliştirilen yöntemle, karışık viral popülasyonlarda baskın olan tipin tespit edildi-ği de izlenmiştir. Bu yöntem, dizi analizi ile benzer şekilde üç serum örneedildi-ğinde (serum no: 4, 8, 14) eş sonuçlar vermesine karşın, bu üç örnekte LiPA ile karışık viral popülasyon varlığı saptanmıştır. LiPA’nın özellikle karışık viral popülasyon varlığında yakalama alt sı-nırı %10’luk değer ile ön plana çıkmakta olup, dizi analizinde %30 olan bu oran, geliş-tirdiğimiz yöntemde %50 olarak belirlenmiştir12,13. Ancak LiPA testinde mutasyon sap-tamada alt sınırın düşük olmasına karşın, LiPA şeridi üzerinde bulunmayan mutasyonla-rın tespit edilmesi mümkün değildir. Bu nedenle 4 numaralı hastaya ait örneklerde YMDD motifi dışında bir başka bölgede görülen mutasyon, hibridizasyonu engelleyerek testin sonuç vermesini engellemiştir. Bu durum üretici firmaya iletilmiş ve yeni kuşak tes-tin çıkarılmasıyla düzeltilmiştir.
Lamivudin tedavisi alan hastalarda HBV-DNA düzeylerinin düşmesi, analitik duyarlılık sınırının önemini artırmaktadır14. Geliştirilen yöntemin analitik duyarlılık sınırı 200
kop-ya/ml (yaklaşık 40 IU/ml), dinamik aralığı ise 103ile 107kopya/ml olarak tespit
edilmiş-tir. Geliştirilen yöntem ve ticari Artus kiti ile elde edilen HBV-DNA düzeyleri karşılaştırıl-dığında, örnekler arasında anlamlı bir korelasyon olmasına karşın, örneklerin yaklaşık ya-rısında 1 log10kopya/ml’den fazla fark olduğu belirlenmiştir. Bu farklılığın DNA siyon yöntemlerindeki farklılıktan ve ayrıca Artus kitinde kullanılan plazmidlerin ekstrak-siyona dahil edilmemesinden kaynaklanabileceği düşünülmüştür. Ayrıca son dönemde Artus HBV-DNA testi tekrar kalibre edilmiş ve elde edilen sonuçların iki ile çarpıldığı öğ-renilmiştir. Geliştirilen yöntemin en önemli dezavantajı ise iç kalite kontrolünün yapılma-masıdır. Bu durum yalancı negatifliklere yol açabilecek olmasına karşın, çalışmamızda ya-lancı negatifliğe rastlanmamıştır.
olarak Rt-PCR yöntemiyle gerçekleştirmeye yönelik az sayıda çalışma mevcuttur21-23.
Ge-liştirilen yöntemin klinik uygulamada en önemli avantajı, HBV-DNA düzeyini belirleyebil-mesinin yanı sıra aynı testte eş zamanlı olarak baskın olan YMDD motif analizini de kısa sürede gerçekleştirebilmesidir. Tedavide kullanılan antiviral ajanın değişimi için genellik-le viral yükün tedavi esnasında 10 kat artması karar verdirici olmaktadır11. Bu nedenle
vi-ral yük tayini ve baskın vivi-ral popülasyonun aynı testte eş zamanlı olarak ve kısa sürede saptanması tedavi takibini kolaylaştıracaktır. Sonuç olarak bu çalışmada geliştirilen Rt-PCR testi, HBV-DNA düzeyi ve YMDD motif mutasyonu analizini tek bir çalışmada ve iki saat süre içerisinde gerçekleştirebilen ekonomik bir yöntem olup, lamivudin tedavisi alan kronik HBV hastalarında tedavi takibinde alternatif olarak kullanılabilir.
TEŞEKKÜR
Bu çalışmada kullanılan plazmidleri temin eden S. Pas ve H.G. Niesters’e (Erasmus Tıp Merkezi, Viroloji Bilim Dalı, Hollanda) teşekkür ederiz.
KAYNAKLAR
1. Lee WM. Hepatitis B virus infection. N Engl J Med 1997; 337(24): 1733-45.
2. Hilleman MR. Critical overview and outlook: pathogenesis, prevention, and treatment of hepatitis and
he-patocarcinoma caused by hepatitis B virus. Vaccine 2003; 21(32): 4626-49.
3. Nguyen MH, Keeffe EB. Chronic hepatitis B: early viral suppression and long-term outcomes of therapy with
oral nucleos(t)ides. J Viral Hepat 2009; 16(3): 149-55.
4. Fischer KP, Gutfreund KS, Tyrrell DL. Lamivudine resitance in hepatitis B: mechanisms and clinical
implica-tions. Drug Resist Updat 2001; 4(2): 118-28.
5. Stuvyer LJ, Locarnini SA, Lok A, et al. Nomenclature for antiviral resistant human hepatitis B mutations in
the polymerase region. Hepatology 2001; 33(3): 751-7.
6. Niesters HG, De Man RA, Pas SD, Fries E, Osterhaus AD. Identification of a new variant in the YMDD
mo-tif of the hepatitis B virus polymerase gene selected during lamivudine therapy. J Med Microbiol 2002; 51(8): 695-9.
7. Bozdayi AM, Uzunalimoglu O, Turkyilmaz AR, et al. YSDD: a novel mutation in HBV DNA polymerase
con-fers clinical resistance to lamivudine. J Viral Hepat 2003; 10(4): 256-65.
8. Dan YY, Wai CT, Lee YM, Sutedja DS, Seet BL, Lim SG. Outcome of lamivudine-resistant hepatitis B virus is
generally benign except in cirrhotics. World J Gastroenterol 2005; 11(28): 4344-50.
9. Sablon E, Shapiro F. Advances in molecular diagnosis of HBV infection and drug resistance. Int J Med Sci
2005; 2(1): 8-16.
10. Cane PA, Cook P, Ratcliffe D, Mutimer D, Pillay D. Use of real-time PCR and fluorimetry to detect lamivudi-ne resistance associated mutations in hepatitis B virus. Antimicrob Agents Chemother 1999; 43(7): 1600-8. 11. Lok AS, McMahon BJ. Chronic hepatitis B. Hepatology 2007; 45(2): 507-39.
12. Pas SD, de Man RA, Fries E, Osterhaus AD, Niesters HG. The dynamics in the YMDD motif of the hepatitis B virus polymerase gene during and after lamivudine treatment as determined by reverse hybridisation. J Clin Virol 2002; 25(1): 63-71.
13. Aberle SW, Kletzmayr J, Watschinger B, Schmied B, Vetter N, Puchhammer-Stockl E. Comparison of sequ-ence analysis and the INNO-LiPA HBV DR line probe assay for detection of lamivudine resistant hepatitis B virus strains in patients under various clinical conditions. J Clin Microbiol 2001; 39(5): 1972-4.
15. Whalley SA, Brown D, Teo CG, Dusheiko GM, Saunders NA. Monitoring the emergence of hepatitis B virus polymerase gene variants during lamivudine therapy using the LightCycler. J Clin Microbiol 2001; 39(4): 1456-9.
16. Chieochansin T, Chutinimitkul S, Payungporn S, et al. Rapid detection of lamivudine-resistant hepatitis B virus mutations by PCR based methods. Tohoku J Exp Med 2006; 210(1): 67-78.
17. Wang RS, Zhang H, Zhu YF, Han B, Yang ZJ. Detection of YMDD mutants using universal template real-ti-me PCR. World J Gastroenterol 2006; 12(8): 1308-11.
18. Pas Sdi Fries E, De Man RA, Osterhaus AD, Niesters HG. Development of a quantitative real-time detection assay for hepatitis B virus DNA and comparison with two commercial assays. J Clin Microbiol 2000; 38: 2897-901.
19. Allice T, Cerutti F, Pittaluga F, et al. COBAS AmpliPrep-COBAS TaqMan hepatitis B virus (HBV) test: a novel automated real-time PCR assay for quantification of HBV DNA in plasma. J Clin Microbiol 2007; 45(3): 828-34.
20. Liu Y, Hussain M, Wong S, Fung SK, Yim HJ, Lok AS. A genotype-independent real-time PCR assay for qu-antification of hepatitis B virus DNA. J Clin Microbiol 2007; 45(2): 553-8.
21. Punia P, Cane P, Teo CG, Saunders P. Quantitation of hepatitis B lamivudine resistant mutants by real-time amplification refractory mutation system PCR. J Hepatol 2004; 40(6): 986-92.
22. Wightman F, Walters T, Ayres A, et al. Comparison of sequence analysis and a novel discriminatory real-ti-me PCR assay for detection and quantification of lamivudine-resistant hepatitis B virus strains. J Clin Micro-biol 2004; 42(8): 3809-12.
