T.C. ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU

(1)

T.C.

ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ

KESİN RAPORU

Türkiye’de Yayılış Gösteren Bazı Aspicilia (Massal.) Liken Türlerinin Moleküler Biyolojik Yöntemlerle Tanımlanması

Doç. Dr. E. Sümer ARAS Proje Numarası 2004-07-05-093

Başlama Tarihi 02.08.2004 Bitiş Tarihi 02.08.2007 Rapor Tarihi 21.09.2007

Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara - " 2007 "

EK-

8

(2)

TÜRKİYE’DE YAYILIŞ GÖSTEREN BAZI ASPICILIA (Massal.) LİKEN TÜRLERİNİN MOLEKÜLER BİYOLOJİK YÖNTEMLERLE TANIMLANMASI

IDENTIFICATION OF SOME ASPICILIA (MASSAL.) SPECIES GROWING IN TURKEY BY MOLECULAR BIOLOGICAL METHODS

ÖZET

Bu proje kapsamında beşi manna grubuna ait olan yedi farklı Aspicilia türü RAPD analizi ile, 16 Aspicilia cinsine ait örnek de rDNA ITS (internal trancribed spacer) bölgesi dizi analizi ile incelenmiştir. Likenlerden mantar izolasyonu ile DNA izole edilmiştir. Moleküler belirteç (markır) çalışmaları için öncelikle geliştirilen mantar kültürü protokolü DNA izolasyonu için kullanılmıştır (Cordeiro ve ark., 2004; Yamamoto ve ark., 1985; Ahmadijan, 1974).

RAPD analizlerinde kullanılan likenlerin manna grubu Aspicilia esculenta, A. aspera, A.

fruticulosa, A. hispida, A. desertorum Anadolu’dan farklı yerlerden toplanmıştır. Benzer gruplar olarak değerlendirilen A. contorta subsp. hoffmanniana ve A. calcarea ise manna grubu ile filogenetik ilişkilerini incelemek için çalışmalarda kullanılmıştır.

Çalışmalarımızın 2. bölümü daha kapsamlı ve detaylı veriler elde etmek için ITS bölgesi dizi analizi yönünde devam etmiştir. RAPD analizlerinde incelenmiş olan 7 türde dahil olmak üzere değişik lokalitelerden toplanmış 16 Aspicilia cinsine ait örnekde dizi analizi çalışmaları yapılmıştır. RAPD verilerinden elde edilen sonuçlar dizi analizi verilerini destekler nitelikde olup ITS bölgesi dizi analizi verilerine göre Anadolu’da bulunan Aspicilia sp.’nin bu ekolojiye ait karakteristikleri ile kendi başına bir grup oluşturduğu söylenebilir.

Aspicilia cinsinin moleküler belirteçler ve ITS dizi analizi incelenmesini içeren bu çalışma bilgilerimiz dahilinde bir ilkdir. Çalışmada kullanılan türlere ait örneklerde, genetik mesafelerin hesaplanması ve ayrıca genotiplerin belirlenmesi üzerinde yoğunlaşılmıştır. ITS dizi analizi ve RAPD belirteçleri ile elde edilen bilgiler Aspicilia cinsinin, özellikle manna grubu likenlerin, taksonomisine katkıda bulunmaktadır.

(3)

ABSTRACT

In this project seven different species of Aspicilia which five of them regarded as manna lichens were studied with RAPD analysis and 16 specimens from Aspicilia genus were investigated by sequence analysis of rDNA ITS (internal transcribed spacer) region. DNA was isolated with mycobiont isolation. For DNA isolation from mycobiont cultures a previously improved protocol for molecular marker studies, was used (Cordeiro ve ark., 2004; Yamamoto ve ark., 1985;

Ahmadijan, 1974).

The manna group of lichens used in RAPD analysis ; Aspicilia esculenta, A. aspera, A. fruticulosa, A. hispida, A. desertorum collected from various parts of Anatolia were included into the study.

Samples of A. contorta subsp. hoffmanniana and A. calcarea which were regarded as related groups to manna lichens, were also used in the examinations.

In the second part of the studies in order to obtain more comprehensive and more detailed data ITS sequence analysis were conducted. Including 7 species used in RAPD analysis 16 Aspicilia specimens were included to sequence analysis studies. Results obtained from RAPD analysis supported the data from ITS region sequence analysis. According to ITS region sequence analysis data it could be interpreted that Aspicilia sp. found in Anatolia forms a group of its own with the characteristics unique to that ecology.

This is the first study with molecular markers and ITS sequence analysis on Aspicilia genus to our knowledge and focused on revealing the genetic distances and also defining genotypes of the specimens of the species used in the study. The information obtained by ITS sequencing and RAPD analysis constitutes a contribution to the taxonomy of Aspicilia genus, especially within manna group of lichens.

(4)

II. Amaç ve Kapsam

Likenlerde ki sistematik çalışmalar, bitki gruplarında olduğu gibi klasik olarak daha çok morfolojik karakterlere dayalı tanımlamaya dayanmaktadır. Morfolojik karakterlerin yanında, kemotaksonomik yöntemler de kullanılmaktadır. Bunlar arasında kortekse uygulanan bazı reaktiflerin renk reaksiyonları ya da ince tabaka kromatografisidir. Son yıllarda bu amaçla moleküler taksonomik yöntemler de kullanılmasına rağmen konusu likenler açısından ülkemiz için yeni bir çalışmadır.

Aspicilia Manna grubu (besin değeri olan, insanlar ve hayvanlar tarafından yenilebilir özellikte olan) birbirine morfolojik olarak çok benzeyen türleri içermektedir. Bu nedenle bu proje ile morfolojik yöntemlerle bile çok zor ayrılan bu grubu moleküler biyolojik yöntemlerle sınıflandırılması amaçlanmıştır.

Aspicilia liken cinslerinin manna grubu olarak adlandırılan Aspicilia hispida, Aspicilia desertorum, Aspicilia esculentum, Aspicilia fruticulosa türleri ile Aspicilia calcarea ve A. contorta subp.

hoffmannii taksonlarına ait örnekler RAPD analizi ile incelenmiş ayrıca çalışmayı daha kapsamlı ve ileri boyutlara götüreceği düşünülerek manna grubu likenleri de içeren 16 Aspicilia cinsi örneklerinde rDNA ITS bölgesi dizi analizi çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmalarla Aspicilia cinsine ait bir çok türün liken sistematiğindeki konumlarına bir başka boyut getirilmiştir.

III. MATERYAL VE YÖNTEM:

Liken Materyali (RAPD Analizi)

Projenin konusunu oluşturan liken cinslerine ait türler daha önce araziden farklı lokalitelerden ve farklı substratlardan, liken toplama kurallarına uygun biçimde toplanmıştır ve laboratuvara getirilerek oda sıcaklığında kurutulmuştur. Mevcut bu örneklerden yeteri kadarı laboratuvar çalışmaları için alınarak ve birer dublet ANK Herbaryum ve Anadolu Üniversitesi herbaryumunda, herbaryum materyali haline getirilerek koruma altına alınmıştır. İstasyon bilgileri Tablo 1’de verilmiştir. Şekil 1-5’de liken örneklerine ait resimler gösterilmektedir.

(5)

Tablo 1: RAPD analizi için Aspicilia liken örneklerinin toplandığı bölgeler.

Türler Toplama Bölgeleri

Aspicilia contorta subp hoffmanniana Malatya, Hekimhan, Midemuşağı (Mollaibrahim) köyü, kuzey yamaçlar, 23.07.2004, 1205 m, 38º43'20.5 N- 38º04'22.4 E (toplayan M. Candan) ANES 10200

Aspicilia calcarea Adıyaman, Kahta, Karakuş Tümülünün güneyi, kalkerli kayalıklar, 28.07.2004, 830m, 37º52'34.6 N- 38º35'35 E (toplayan M. Candan) ANES 10203 Aspicilia desertorum Elazığ, Harput, Serince köyünün kuzeyi, 04.08.2004,

1580 m, 38º43'56 N- 39º17'18 E (toplayan M.

Candan) ANES 10207

Aspicilia aspera Malatya, Tokluca köyünün kuzeyi, 24.08.2003, 1104 m, 38º17'38.6 N- 38º3'04 E (toplayan M. Candan) ANES 10208

Aspicilia hispida Malatya, Darende, Zengibar kalesinin güneyi, 24.07.2004, 1105 m, 38º33'59.9 N- 37º30'07 E (toplayan M. Candan) ANES 10209

Aspicilia fruticulosa Sivas, Kangal, Hekimhan-Sivas 46. km, 23.07.2004, 1530 m, 39º04'01.2 N- 37º41'43.4 E (toplayan M.

Candan) ANES 10210

Aspicilia esculenta Malatya, Darende, Kepez Dağı, 28.08.2003, 1820- 1890 m, 38º20'29 N- 37º37'55 E (toplayan M.

Candan) ANES 10211

Şekil 1. Aspicilia hispida Mereschk. Şekil 2. Aspicilia desertorum (Krempelh.) Mereschk.

(6)

Şekil 3. Aspicilia esculenta (Pallas) Flagey Şekil 4. Aspicilia fruticulosa (Eversmann) Flagey

Şekil 5. Aspicilia calcarea (L.) Mudd.

Mantar İzolasyonu

Materyalden DNA izolasyonuna geçmeden önce likeni oluşturan alg ve mantarı birbirinden ayırmak gereklidir. RAPD çalışmalarında primerler spesifik olmayıp tüm genomu çoğaltıldığı için likenlerden DNA izolayonu yapabilmek için once mantar kısmının izolasyonu için doku kültürü yapılmıştır. Bu işlem için Ahmadijan (1974) ve (Yamamoto ve ark., 1985)’nın kullandığı yöntem uygulanmıştır.

Mantar kültürleri askosporlardan (Ahmadijan, 1974) ve tallus parçalarından (Yamamoto ve ark., 1985) sağlanmıştır (Aspicilia’nın 6 türünde A. esculenta, A. fruticulosa, A. calcarea, A. desertorum, A. contorta subsp. hoffmaniana’da askosporlardan, A. hispida’da da ise tallusun alg içermeyen kısmından mantar kültürü elde edilmiştir.

DNA İzolasyonu ve RAPD Analizi

İzole edilecek DNA mantar kültürlerinden eşit oranda (yaklaşık 5 mg) olacak şekilde alınmıştır. Bu işlem için GFX PCR ve Promega Jel bant purifikasyon kiti kullanılmıştır. Öncelikle örnekler önceden soğutulmuş içinde sıvı nitrojen olan 1.5 ml PCR tüpü içerisine konulmuştur. Bunun üzerine 100 µl tampon solusyonu eklenmiştir ve örnekler 60 °C’de 10 dakika inkübe edilmiştir.

(7)

Diğer tüm devam eden aşamalar üretici firmanın yönlendirdiği şekilde izlenmiştir. Sonuçta DNA örnekleri üzerine 50 µl; pH’ı 8 olan 10mM’lık Tris tamponu eklenerek sulandırılmıştır. Bu aşamadan sonar DNA örnekleri NanoDrop-1000 ile miktarı ölçülmüştür. 100 bp DNA ladder (Promega) kullanılarak ethidyum bromürlü agaroz jelde koşturulmuştur (Şekil 6).

1 2 3 4 5 6 7

Şekil 6. Aspicilia genusuna ait örneklere ait DNA bantlarının agaroz jelde gösterimi

1- Aspicilia contorta subsp. hoffmanniana, 2- A. calcarea, 3-Aspicilia esculenta, 4- A. desertorum, 5- A. aspera, 6- A. fruticulosa, 7- A. hispida

RAPD analizi için 32 primer kullanılmıştır. Fakat bunlardan sadece 16’sı temiz ve tekrarlanabilir bant vermiştir. PCR ise son hacmi 25 µl olacak şekilde aşağıdaki miktarlarda hazırlanmıştır.

200 ng DNA

2.5 µl 10x reaksiyon tamponu 3.5 µl 2.5 mM MgCl2

2 µl 2.5 mM dNTPs 200 ng primer

0.5 unite Taq Polimeraz (Promega)

PCR için Biometra Isı döngü cihazı kullanılmıştır. PCR programıda;

94^oC 3 dk

94 ôC 30 sn-36 ôC 1 dk-72 ôC 1dk.45 sn 35 döngü Uzama evresi de 72 ôC’de 8 dk yapılmıştır.

Çoğaltılmış örnekler % 1.2’lik agoroz jele (%50 agoroz %50 Nusive GTC agaroz ) yüklenmiş ve 4 saat 100 V’da yürütülmüştür. Herhangi bir kontaminasyon olup olmadığını belirlemek için kalıp DNA olmaksızın PCR karışımı negatif kontrol olarak konulmuştur. Kullanılan 16 primerin dizileri Tablo 2’de verilmiştir ve PCR sonuçları Şekil 7’de verilmiştir.

(8)

Tablo 2. Çalışmada kullanılan primerlerin dizisi.

Primer Sequence (5’-3’)

OPB16 TTTGCCCGGA

OPC10 TGTCTGGGTG

TubeC 01 TTCGAGCCAG

TubeA 02 TGCCGAGCTG

P232 CCGCTTGTTG

OPO 04 AAGTCCGCTC

OPO 07 CAGCACTGAC

OPA 1 CAGGCCGTTC

OPB 14 TCCGCTCTGG

TubeA 01 CAGGCCCTTC

B 389 CGCCCGCAGT

OPB 02 TGATCCCTGG

OPB 08 GTCCACACGG

OPO 10 TCAGAGCGCC

P 437 CGGATCGACA

TubeA 03 AGTCAGCCAC

1 2 3 4 5 6 7 8 M 1 2 3 4 5 6 7

Şekil 7. Çalışmada kullanılan Aspicilia türlerinin PCR ürünlerinin agaroz jelde görünümü.

1- A. fruticulosa, 2- A. hispida 3- Aspicilia esculenta, 4- A. desertorum, 5- A. aspera, 6- Aspicilia contorta subsp. hoffmanniana, 7- A. calcarea.

(9)

İstatistik Analiz:

Çalışmada kullanılan her bir primer 2 kere tekrarlanmıştır ve sadece temiz ve çoğaltılmış bantlar değerlendirilmeye alınmıştır. RAPD belirteçlerin cluster analizi NTSYS-pc (Rohlf, 2000)’e göre yapılmıştır. Benzerlikleri bantların var (1) ya da yok (0) hesabına göre yapılmıştır. RAPD veri matriksi; NTSYS-pc programında Simple Matching Coefficient’ a gore örneklerin genetic uzaklıklarına göre oluşturulmuştur.

Çalışmanın daha kapsamlı ilerleyebilmesi için 2. aşama olarak rDNA ITS bölgeleri incelenmiştir.

ITS BÖLGESİ ANALİZLERİ

rDNA ITS bölgesini ve ayrıca 5.8 S rDNA bölgesini içine alacak şekilde oluşturulmuş primerlerden mantara özgü ITS-1F ve evrensel ITS-4 primerleri kullanılarak bu bölgenin amplifikasyonu gerçekleştirilmiştir. Elde edilen PCR ürünleri MspI, Hinf I, Pvu II, Alu I, Eco RI BamHI,, ScaI, PdmI, XceI enzimleri (Fermentas) ile üretici firmanın yönlendirmeleri doğrultusunda kesilmiştir. Yaklaşık 680 kb’lık bantların elde edilmesine karşın kullanılan restriksiyon enzimlerinin bazılarının sadece birkaç örnekte kesim bölgesi yakalayabildiği gözlenmiştir.

Restriksiyon enzim kesimlemeleri sonucunda polimorfik bir patternin ortaya çıkmaması nedeniyle bu örnekler resimlendirilmemiş ve değerlendirilmeye alınmamıştır. Ancak 680 bç lik bir bölge de enzimlerin bir kısmının farklı kesim noktaları bulabilmesi, bu bölgenin dizi analizi yapıldığında farlılıkların ortaya çıkabileceğini işaret ediyor olması ve dünya literatüründe çalışmaların yoğunlukla bu yönde yapıldığı göz önünde bulundurularak bu bölgeler proje kapsamında olmamasına karşın diğer bir projeden (Biyoteknoloji Enstitüsi Proje No:171) sağlanan destek ile de dizi analizine tabii tutulmuştur.

Dizi Analizi

Liken materyali

RAPD analizlerinde incelenmiş olan 7 türde dahil olmak üzere değişik lokalitelerden toplanmış 16 Aspicilia türünde (tablo 3) dizi analizi çalışmaları yapılmıştır. Bazı liken örnekleri Anadolu Üniversitesi Herbaryumunda bulunan daha önceden toplanmış materyalden temin edilmiştir.

(10)

DNA ekstraksiyonu ve PCR amplifikasyonu

DNA ekstraksiyonu daha önce laboratuvarımızda belirlenen yöntemlere göre gerçekleştirilmiştir (Aras ve Cansaran, 2007). rDNA genine ait ITS bölgesi mantara özgü ITS1F (Gardes and Bruns, 1993) ve evrensel ITS4 (White et al., 1990) primerleri kullanılmıştır. PCR amplifikasyonları daha önce belirlenmiş metotlara göre yapılmıştır.

DNA Dizi Analizi

PCR ürünleri dye terminator cycle sequencing kit ve OpenGeneÒ automated DNA sequencing system (Visible Genetics, Canada) (Amersham Pharmacia, USA) ile üretici tarafından belirlenmiş protocol doğrultusunda gerçekleştirilmiştir.

ITSF1 and ITS4 primerleri ile çoğaltılmış ve küçük alt ünitenin 3’ son bölgesi, ITS 1, ITS 2 ve büyük alt ünitenin 5’ terminal bölgesini içeren fragmanlar dizi analizine tabii tutulmuştur. Okuma hatalarından kaynaklanan kararsızlıklar Clustal W 1.83 programı ile komplementer dizilerle kıyaslamak suretiyle çözülmüştür. Diziler ayrıca aynı program kullanılarak sıralanmış (alignment) ve görsel ayarlama yapılmıştır. Kararsızlık yaratan sıralanmış bölgeler çıkartılmış ve kayıp veri olarak değerlendirilmiştir. Aspicilia cinsine ait 16 örnek, Gen Bankasından çıkartılmış olan Leconora cinsine ait 11 örnek, 1 Pertusaria türü,1 Megaspora türü, 1 Lecidea and 2 Aspicilia (Tablo 4) çoklu sıralamalara dahil edilmiştir (Fig 1). 684 nukleotid posizyonunda olan dizi matriksi incelenmiş (korunmuş, 38; değişken, 627) ve 528 parsimoni bilgilendirici bölge tayin edilmiştir.

Tüm veriler MEGA 3 (Kumar et al., 2004) istatistik analiz programı ile incelenmiş ve bootstrap’li (saç topla testi) dendogram elde edilmiştir.

(11)

Tablo 3 ITS bölgesi dizi analizi çalışmalarında kullanılan liken örneklerinin toplanma bölgeleri

Tür Toplanma alanı

Aspicilia contorta subp hoffmanniana (Eastern Anatolia) Malatya, Hekimhan, Midemuşağı (Mollaibrahim) village, northern slopes, 23.07.2004, 1205 m, 38º43'20.5 N- 38º04'22.4 E (leg. M. Candan) ANES 10200

Aspicilia contorta subp hoffmanniana (Eastern Anatolia) Elazığ, Harput, North of Serince village, calcareous rocks, 04.08.2004, 1580 m, 38º43'56 N- 39º17'18 E (leg. M. Candan) ANES 10201(Eastern Anatolia)

Aspicilia contorta subp hoffmanniana (Eastern Anatolia) Adıyaman, Varlık village, South of Yoğurtul Mezra, 30.07.2004, 1160 m, 37º54'05 N- 38º17'47 E (leg. M. Candan) ANES 10202

Aspicilia contorta subp contorta (Middle Anatolia) Kütahya, North of Dumlupınar, 03.07.2001 (leg. et det. V. John) ANES 7391

Aspicilia calcarea (Eastern Anatolia) Adıyaman, Kahta, Southeast of Karakuş Tümülü, Calcareous rocks, 28.07.2004, 830m, 37º52'34.6 N- 38º35'35 E (leg. M. Candan) ANES 10203

Aspicilia calcarea (Eastern Anatolia) Adıyaman, Besni, Southwest of Çilboğazı village, 27.07.2004, 900 m, 37º44'08 N- 37º48'06.3 E (leg. M. Candan) ANES 10204

Aspicilia calcarea (Middle Anatolia) Sivas, Kangal, Hekimhan-Sivas 46. km, 23.07.2004, 1530 m, 39º04'01.2 N- 37º41'43.4 E (leg. M. Candan) ANES 10205

Aspicilia calcarea (Eastern Anatolia) Malatya, Doğanşehir, West of Kurucuova village, 30.07.2004, 1410 m, 37º59'26 N- 38º03'42.4 E (leg. M. Candan) ANES 10206

Aspicilia desertorum (Eastern Anatolia)Elazığ, Harput, North of Serince village, 04.08.2004, 1580 m, 38º43'56 N- 39º17'18 E (leg. M. Candan) ANES 10207

Aspicilia aspera (Eastern Anatolia) Malatya, North of Tokluca village, 24.08.2003, 1104 m, 38º17'38.6 N- 38º3'04 E (leg.

M. Candan) ANES 10208

Aspicilia hispida (Eastern Anatolia) Malatya, Darende, Southeast of Zengibar Castle, 24.07.2004, 1105 m, 38º33'59.9 N- 37º30'07 E (leg. M. Candan) ANES 10209

Aspicilia fruticulosa (Middle Anatolia) Sivas, Kangal, Hekimhan-Sivas 46. km, 23.07.2004, 1530 m, 39º04'01.2 N- 37º41'43.4 E (leg. M. Candan) ANES 10210

Aspicilia esculenta (Eastern Anatolia) Malatya, Darende, Kepez Mountain, 28.08.2003, 1820-1890 m, 38º20'29 N- 37º37'55 E (leg. M. Candan) ANES 10211

Aspicilia esculenta (Southeastern Anatolia) Diyarbakır, Ergani, Makam Mountain, 15.06.2002, 1520 m (leg. Ş.N. Karabulut) ANES 5935

Aspicilia esculenta (Middle Anatolia) Sivas, Kangal, Hekimhan-Sivas 46. km, 23.07.2004, 1530 m, 39º04'01.2 N- 37º41'43.4 E (leg. M. Candan) ANES 10212

(12)

Tablo 4. DNA dizi analizi sonucu sıralanan türler, lokaliteleri, GenBank ulaşım numaraları

Tür GenBank ulaşım No. Orijin

Aspicilia aspera DQ401569 Turkey-Malatya

Aspicilia calcarea DQ401563 Turkey-Malatya

Aspicilia calcarea DQ401562 Turkey-Sivas

Aspicilia calcarea DQ401561 Turkey-Adıyaman2

Aspicilia calcarea DQ401560 Turkey-Adıyaman1

Aspicilia cinerea ACI458278 France

Aspicilia contorta subp

contorta DQ401559 Turkey-Afyon

hoffmanniana DQ401558 Turkey-Adıyaman

hoffmanniana DQ401557 Turkey-Elazıg

hoffmanniana DQ401556 Turkey-Malatya

Aspicilia desertorum DQ401568 Turkey-Elazıg 2

Aspicilia desertorum DQ401567 Turkey-Elazig1

Aspicilia esculenta DQ401566 Turkey-Sivas

Aspicilia esculenta DQ401565 Turkey-Diyarbakır

Aspicilia esculenta DQ401564 Turkey-Malatya

Aspicilia fruticulosa DQ401570 Turkey-Sivas

Aspicilia hispida DQ401571 Turkey-Malatya

Aspicilia simoensis AF332115 Russia

Lecanora achariana A. L. Sm. AF070019 Sweden

Lecanora albella AY541241 Austria

Lecanora carpinea AY39871 Austria

Lecanora campestris AF159930 Sweden

Lecanora garovaglii (Kölber)

Zahlbr AF189718 Austria

Lecanora intricata AF070022 Austria

Lecanora novomexicana H.

Magn., U 363 AF159945 Arizona

Lecanora polytropa AF070017 Austria

Lecanora pruinosa Chaub. AF070018 Italy

Lecanora reuteri Schaer AF070026 Austria

Lecanora swartziii subsp.

Nylanderi AY541273 Australia

Lecidea cancriformis AY667582 Antarctica

Megaspora verrucosa AF332122 Russia

Perusaria erubescens DQ219303 Antartica

Protoparmaliopsis muralis

(Schreb.) Rabenh. AF159922 Austria

(13)

IV. Analiz ve Bulgular RAPD Analizi

Aspicilia genusuna ait olan iki tür ve manna grubuna ait olan beş türün tümü analiz edilmiştir. Test edilen 32 primerden temiz ve çoğalabilen bant ürünü veren 16’sı reaksiyonlar için seçilmiştir.

RAPD analizinden toplam 181 bant elde edilmiştir ve bu bantlardan 32’si polimorfik olarak belirlenmiştir. Çoğaltılmış parçalar 150 bp ile 1000 bp arasındadır ve her bir primer için bantların sayısı 10 ila 20 arasındadır. Var (1) yok (0) skorlaması ile elde edilen veri matriksi SAHN (Rohlf, 2000) yöntemi ile UPGMA dendogramı kullanılarak elde edilmiştir (Şekil 8).

Şekil 8. RAPD analizlerine göre çalışılan türlere ait dendogram

Principle Component Analiz (PCA) ile incelenen verilerde RAPD çalışmalarından elde edilen bantlara gore üç ayrı grup oluşmuştur (Şekil 8).

UPGMA dendogramına göre liken örnekleri iki ana daldan oluşmuştur, ana dalda 2 ayrı alt daldan oluşmuştur. Dendogramda ilk ana dal içinde A. hispida, A. aspera, A. esculanta ve A. fruticulosa ayrı bir dal oluşturmuştur. Diğer taraftan A. desertorum da manna grubuna ait bir liken örneği olsada diğer ana grup olarak ayrılan A. calcarea ve A. contorta subsp. hoffmanniana ‘nın daha

(14)

yakınında yer almıştır. En yüksek genetik benzerlik A. hispida ve A. aspera’da gözlenmiştir ve aynı benzerlik morfolojik görünümlerinde de gözlemlenmiştir.

Dizi Analizi

Çalışmanın dizi analizi bölümünde Manna grubuna ait toplam sekiz tür ve Aspicilia cinsinden benzer türler kullanılmıştır. Aspicilia örneklerinde elde edilen dizi bilgileri Gen Bankası’na verilmiştir. (Tablo 4). ITS bölgeleri için elde edilen veriler GenBank’dan alınan örneklerdeki verilerle sıralanmıştır. PCR amplifikasyonu ile elde edilen hedef diziler iki yönlü dizi analizine tabii tutulmuştur. Aspicilia türlerinde dizi analizi reaksiyonları sonucunda sıralanabilir 684 nükleotid uzunluğunda diziler elde edilmiştir. Bu diziler içerisinde 38 korunmuş and 627 değişken bölge olduğu ve 528 bölgenin parsimoni bilgilendirici olduğu gözlenmiştir.

En fazla dokuz parsimonous ağaç elde edilmiş ve bunlar benzer gruplarla, özellikle Leconora ile sıralandırılmıştır. Bu ağaçlardan bir tanesi olan minimum evolusyon ile edilen ağaç şekil 9 da gösterilmektedir. Elde edilen değişik ağaçlar sadece gruplar içerisinde küçük rearajmanlar gösterip, genelde benzer topolojiler sergilemişlerdir. Maximum parsimony ve Neighbor joining analizleri ile elde edilen ağaçlar grup içi ve gruplar arası küçük değişiklikler ile çok yakın topolojiler göstermişlerdir.

(15)

Protoparmeliopsis muralis Austria Lecanora achariana Sweden Lecanora garovaglii Austria Lecanora novomexicana Arizona Lecanora pruinosa Italy

Lecanora reuteri Austria Lecanora intricata Austria Lecanora polytropa Austria

Lecanora compestris Sweden Lecanora swartzi Australia Lecanora carpinea

Lecidea cancriformis Antarctica Lecanora albella Austria Aspicilia cinerea France

Aspicilia simoensis Russia Megaspora verrucosa Russia

Pertusaria erubescens Antarctica

Aspicilia esculenta Turkey-Sivas Aspicilia esculenta Turkey-Diyarbakir

Aspicilia esculenta Turkey-Malatya

Aspicilia contorta contorta Turkey-Afyon Aspicilia contorta hoffmanniana Turkey-Adiyaman

Aspicilia contorta hoffmanniana Turkey-Elazig Aspicilia contorta hoffmanniana Turkey-Malatya Aspicilia desertorum Turkey-Elazig

Aspicilia desertorum Turkey-Elazig Aspicilia calcarea Turkey-Adiyaman Aspicilia calcarea Turkey-Adiyaman

Aspicilia calcarea Turkey-Sivas Aspicilia calcarea Turkey-Malatya

Aspicilia aspera Turkey-Malatya Aspicilia hispida Turkey-Malatya

Aspicilia fruticulosa Turkey-Sivas

Şekil 9. Anodolu’dan toplanan Aspicilia türlerinin ve diğer Aspicilia, Leconora, Pertusaria, Megaspora and Lecidea species.filogenetik ilişkileri. Minimum evolüsyon analizi ile elde edilen dokuz eşit parsimonus ağaçlardan bir tanesi gösterilmektedir. Nod’larda bulunan rakamlar %50’nin üzerinde bootstrap frekanslarıdır.

Austria

(16)

Aspicilia calcarea Turkey-Malatya Aspicilia calcarea Turkey-Sivas

Aspicilia calcarea Turkey-Adiyaman Aspicilia calcarea Turkey-Adiyaman Aspicilia desertorum Turkey-Elazig

Aspicilia desertorum Turkey-Elazig Aspicilia hispida Turkey-Malatya

Aspicilia fruticulosa Turkey-Sivas Aspicilia aspera Turkey-Malatya Aspicilia esculenta Turkey-Sivas Aspicilia esculanta Turkey-Diyarbakir

Aspicilia esculenta Turkey-Malatya

Aspicilia contorta contorta Turkey-Afyon Aspicilia contorta hoffmanniana Turkey-Malatya Aspicilia contorta hoffmanniana Turkey-Adiyaman Aspicilia contorta hoffmanniana Turkey-Elazig

Şekil 10. Sadece Anadolu’ya ait Aspicilia örneklerinde ITS dizi bilgilerine göre Neighbor joining analizi

V. Sonuç ve Öneriler:

Proje kapsamında çalışılan Aspicilia cinsi moleküler belirteçler ve ITS dizi analizi uygulanarak yapılan ilk çalışmadır. RAPD tekniği ile Anadolu’dan toplanan Aspicilia cinsi manna grubu ile arasındaki filogenetik ayrımı gösterilmiştir. Bu çalışma ile özellikle likenlerdeki manna grubuna odaklanılmıştır. Bu sayede Aspicilia cinsi içinde manna grubu ayrı bir alt grup oluşturduğu gözlemlenmiştir.

ITS dizi analizi verileri daha kapsamlı ve detaylı bir çalışma olduğu için araştırmalarımız bu yönde devam etmiştir. RAPD verileri dizi analizi verilerini destekler nitelilkde olup ITS bölgesi dizi analizi verilerine göre Anadolu’da bulunan Aspicilia sp.’nin bu ekolojiye ait karakteristikleri ile kendi başına bir grup oluşturduğu söylenebilir (Şekil 9). Sadece Anadolu’dan toplanmış Aspicilia türleri incelendiği zaman Manna grubuna ait örneklerin ağaç içerisinde bir grup oluşturduğu gözlenmektedir (Şekil 10). Anadolu’da bulunan Aspicilia türleri daha uzun dal uzunlukları ile genetik çeşitliliğin fazla olduğunu ifade etmişlerdir (Şekil 9). Yani, benzer cinslerde gözlenen monofiletik yapı ve düşük genetik çeşitliliğin tersine Aspicilia polifiletik bir yapı göstermiştir.

Manna group

(17)

VI. Kaynaklar

ARAS S, CANSARAN D. 2006. Isolation of DNA for sequence analysis from Herbarium material of some lichen specimens. Turkish Journal of Botany,; 30:449-453.

AHMADIJAN V. 1974. The Lichens. In: Methods of isolating and culturing lichen symbionts and thalli. (Eds. Ahmadjian V. and Hale M.E.). pp. 653-659. Academic Pres, New York.

CANSARAN D, ARAS S, KANDEMIR İ, HALICI MG, 2006. Phylogenetic Relations of Rhizoplaca Zopf. From Anatolia Inferred from ITS Sequence Data. Zeitschrift für

Naturforschung, 61c, 405-412.

CORDEIRO LMC, IACOMINI M and WORGOTTER SE. 2004. Culture studies and secondary compounds of six Ramalina species. Mycol. Res. 108 (5): 489-497.

GARDES M, BRUNS TD. 1993. ITS primers with enhanced specifity for basidiomycetes- application to the identification of mycorrhizae and rusts. Mol. Ecol. 2, 113-118.

KUMAR S, TAMURA K, NEI, M, 2004. MEGA 3. Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment. Briefings in Bioinformatics 5, 150-163.

WHITE TJ, BRUNS, T.D., LEE, S., TAYLOR J., 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J., White, T.J. (Eds.), PCR Protocols. Academic Press, San Diego, pp. 315-322.

(18)

YAMAMOTO Y, MIZUGUCHI R and YAMADA Y. 1985. Tissue cultures of Usnea rubescens and Ramalina yasudae and production of usnic acid in their cultures. Plant Cell Physiology 28: 1421-1426.

VII. Ekler

a) Mali Bilanço ve Açıklamaları Proje Bütçesi: 20.000.000 TL (2.8.2004)

19.4.2005 Saat 16:30 da yapılmış olan ihale sonucunda proje kapsamında istenmiş olan sarf malzemesinin tamamı temin edilmiştir.

Proje kapsamında herhangi bir cihaz (demirbaş) talep edilmemiş ve alınmamıştır.

b) Makina ve Teçhizatın Konumu ve İlerideki Kullanımına Dair Açıklamalar (BAP Demirbaş numaraları dahil)

Proje kapsamında herhangi bir makina ve teçhizat (demirbaş) talep edilmemiş ve alınmamıştır.

c) Tenik ve Bilimsel Ayrıntılar (varsa Kesim III de yer almayan analiz ayrıntıları) Tüm analizler ve ayrıntılar rapor içerisinde sunulmuştur.

d) Sunumlar (bildiriler ve teknik raporlar) Aras, S., Cansaran D.

Resolving Genetic Relationships in Manna Group of Lichen from Genus Aspicillia Massal. and Related Allies (Leconoraceae and Hymenyleceae). XV FESBP

Congress 17-21 Temmuz 2006. Lyon-FRANCE.

16 adet Aspicilia türüne ait dizi verileri GenBank (www.ncbi.nilm.nih.gov) veri bankasına verilmiştir.

DQ401569 Aras, S., Turk, A., Kandemir, İ. And Cansaran, D. (7.3.2006)

Aspicilia aspera clone Malatya internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8 S ribosomal RNA gene, complete sequence; and internal transcribed spacer 2, partial sequence. Direct Submission.

Aspicilia calcerea clone Malatya internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8 S ribosomal RNA gene, complete sequence; and internal transcribed spacer 2, partial sequence. Direct Submission.

Aspicilia calcerea clone Sivas internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8 S ribosomal RNA gene, complete sequence; and internal transcribed spacer 2, partial sequence. Direct Submission.

Aspicilia calcerea clone Adıyaman2 internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8 S ribosomal RNA gene, complete sequence; and internal transcribed spacer 2, partial sequence. Direct Submission.

(19)

Aspicilia calcerea clone Adıyaman internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8 S ribosomal RNA gene, complete sequence; and internal transcribed spacer 2, partial sequence. Direct Submission.

Aspicilia contorta subsp. contorta clone Afyon internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8 S ribosomal RNA gene, complete sequence; and internal transcribed spacer 2, partial sequence. Direct Submission.

Aspicilia contorta subsp. hoffmanniana clone Adıyaman internal transcribed spacer 1, partial sequence;

5.8 S ribosomal RNA gene, complete sequence; and internal transcribed spacer 2, partial sequence.

Direct Submission.

Aspicilia contorta subsp. hofmanniana clone Elazığ internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8 S ribosomal RNA gene, complete sequence; and internal transcribed spacer 2, partial sequence. Direct Submission.

Aspicilia contorta subsp. hoffmanniana clone Malatya internal transcribed spacer 1, partial sequence;

5.8 S ribosomal RNA gene, complete sequence; and internal transcribed spacer 2, partial sequence.

Direct Submission.

Aspicilia desertorum clone Elazığ 2 internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8 S ribosomal RNA gene, complete sequence; and internal transcribed spacer 2, partial sequence. Direct Submission.

Aspicilia desertorum clone Elazığ 1 internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8 S ribosomal RNA gene, complete sequence; and internal transcribed spacer 2, partial sequence. Direct Submission.

Aspicilia esculenta clone Sivas internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8 S ribosomal RNA gene, complete sequence; and internal transcribed spacer 2, partial sequence. Direct Submission.

Aspicilia esculenta clone Diyarbakır internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8 S ribosomal RNA gene, complete sequence; and internal transcribed spacer 2, partial sequence. Direct Submission.

Aspicilia esculenta clone Malatya internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8 S ribosomal RNA gene, complete sequence; and internal transcribed spacer 2, partial sequence. Direct Submission.

Aspicilia fruticulosa clone Sivas internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8 S ribosomal RNA gene, complete sequence; and internal transcribed spacer 2, partial sequence. Direct Submission.

Aspicilia hispida clone Malatya internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8 S ribosomal RNA gene, complete sequence; and internal transcribed spacer 2, partial sequence. Direct Submission.

e) Yayınlar

1. Demet Cansaran Duman, Sümer Aras, İrfan Kandemir and Mehmet Candan.

‘Genetic Variation of Manna group of Aspicilia A. Massal Species in Anatolia Investigated by RAPDs' by. Acta Biologica Cracoviensia (SCI) dergisine değerlendirilmesi için sunulmuştur (2007).

(20)

2. Aras S., Cansaran D., Özdemir-Türk A., Kandemir İ., Candan M. 2007.

Resolving genetic relationships in manna group of lichens from genus Aspicilia. African Journal of Biotechnology (SCI), 6 (9); 1154-1160.

3. Aras, S., Cansaran, D. 2006.

Isolation of DNA for sequence analysis from herbarium material of some lichen specimens.

Turkish Journal of Botany (Uluslararası hakemli dergi), 30: 449-453.

4. Cansaran, D. Aras, S., Kandemir, İ., Halıcı, M.G. 2006.

Phylogenetic Relations of Rhizoplaca Zopf. From Anatolia Inferred from ITS Sequence Data.

Zeitschrift für Naturforschung (SCI) 61c: 405-412.