Sakaryada yetişen iki farklı kabak çekirdeğinden (cucurbita maxima ve moschata) katalaz enziminin karakterizasyonu

SAKARYA’DA YETĐŞEN ĐKĐ FARKLI KABAK

ÇEKĐRDEĞĐNDEN (Cucurbita maxima ve moschata)

KATALAZ ENZĐMĐNĐN KARAKTERĐZASYONU

YÜKSEK LĐSANS TEZĐ

Kimyager Dilek KARA

Enstitü Anabilim Dalı : KĐMYA

Tez Danışmanı : Yrd. Doç. Dr. Gülnur ARABACI

Mayıs 2008

ii

TEŞEKKÜR

Çalışmalarım sırasında bana her türlü olanağı sağlayan danışman hocam Yrd. Doç.

Dr. Gülnur ARABACI’ ya, çalışmalarım esnasında her türlü olanağı sağlayan Sakarya Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü Başkanı Sayın Prof. Dr. Ali Osman AYDIN’ a sonsuz teşekkürlerimi sunarım.

Deneylerim sırasında gösterdikleri anlayış ve yardımlarından dolayı kimya bölümü araştırma görevlilerine, tüm bölüm çalışanlarına ve ekip arkadaşlarıma teşekkürlerimi sunarım.

Yüksek lisans çalışmam boyunca her türlü labratuvar aletleri ve kimyasallarını bizimle paylaşan Doç. Dr. Mehmet KANDAZ, Yrd. Doç. Dr. Esra ALTINTIĞ, Murat TUNA ve Doç. Dr. Salih Zeki YILDIZ’ a teşekkürlerimi sunarım.

Hayatımın her aşamasında yanımda olan ve hiçbir zaman desteğini esirgemeyen AĐLEME sonsuz teşekkürlerimi sunarım.

DĐLEK KARA

MAYIS 2008

iii

ĐÇĐNDEKĐLER

TEŞEKKÜR... ii

ĐÇĐNDEKĐLER... iii

SĐMGELER VE KISALTMALAR LĐSTESĐ... vi

ŞEKĐLLER LĐSTESĐ... vii

TABLOLAR LĐSTESĐ... ix

ÖZET... x

SUMMARY... xi

BÖLÜM 1……….. GĐRĐŞ... 1

1.2. Kaynak Özetleri………...…………. 4

BÖLÜM 2……….. ENZĐMLER…………... 7

2.1. Enzimler Hakkında Genel Bilgi………... 7

2.2. Enzimlere Etki Eden Faktörler………. 9

2.2.1. Enzim konsantrasyonunun etkisi………. 9

2.2.2. Substrat konsantrasyonunun etkisi……….. 9

2.2.3. Sıcaklığın etkisi………... 10

2.2.4. pH etkisi……… 11

2.2.5. Zamanın etkisi………... 11

2.2.6. Reaksiyon ürünlerinin etkisi……… 11

2.3. Enzim Đnhibisyonu……… 11

2.3.1. Yarışmalı inhibisyon (Kompetitif inhibisyon)……… 12

2.3.2. Yarışmasız inhibisyon (Nonkompetitif inhibisyon)………… 14

2.3.3. Yarı yarışmalı inhibisyon (Ankompetitif inhibisyon)………. 15

iv

Hakkındanda Genel Bilgi……….. 20

BÖLÜM 3. ……… MATERYAL VE YÖNTEM………. 22

3.1. Kullanılan Materyal ve Maddeler………. 22

3.1.1. Çalışmada kullanılan kimyasal maddeler……… 22

3.1.2. Kullanılan alet ve cihazlar………... 22

3.1.3. Kullanılan tampon çözeltilerin hazırlanması………... 23

3.1.3.1. 0,1 M Sitrat tamponunun hazırlanması………... 23

3.1.3.2 0,2 M Fosfat tamponunun hazırlanması………... 23

3.1.3.3 0,05 M Tris tamponunun hazırlanması ……… 24

3.2. Katalaz Enzimi Đle Đlgili Yapılan Çalışmalar………... 25

3.2.1. Katalaz enzimi için homojenat hazırlanması………... 25

3.2.2. Katalaz enzimi için aktivite tayini……… 25

3.2.3. Katalaz enzimi için amonyum sülfat çöktürmesi ve diyaliz…... 28

3.2.4. Katalaz enzimi için optimum pH çalışması………... 30

3.2.5. Katalaz enzimi üzerine sıcaklığın etkisinin incelenmesi……….... 30

3.2.6. Katalaz enzimi için K_m ve Vmax değerlerinin bulunması ile ilgili çalışmalar………..………... 30

3.2.7. Katalaz enziminin depolanma kararlılığının belirlenmesi…... 31

3.2.8. Katalaz enziminin bozunma hızının belirlenmesi…………... 31

3.2.9. Katalaz enzimi üzerine inhibitorlerin etkisi , I50 değerleri ve KI sabitlerinin bulunması ile ilgili çalışmalar……….. 31

3.3. Katalaz Enzimi Đçin Saflaştırma Teknikleri………. 32

3.3.1. Jel filtrasyon kromotografisi ………... 32

3.3.2. Elektroforez yöntemi ile katalazın molekül ağırlık tayini…... 33

3.3.2.1. .Jelin hazırlanışı……….. 34

3.3.2.2. Örneklerin hazırlanışı ve jele uygulanışı……… 35

3.3.2.3. Jelin boyanması……….. 35

3.3.2.4. Commasie brillant mavisi ile boyama……… 35

v

BÖLÜM 4………

ARAŞTIRMA BULGULARI………. 41

4.1. Katalaz Enziminin Karakterizasyonu………...… 41

4.1.1. Enzim homojenatı……….... 41

4.1.2. Kabak çekirdeklerinin aktivite ölçümleri………...…………. 41 4.1.3. Katalaz enziminin % 30 amonyum sülfat ile çöktürülmesi

ve diyaliz sonucu saflaştırma sonuçları………... 43 4.1.4. Katalaz enzimi üzerine pH etkisi………...…………... 43 4.1.5. Katalaz enzimi üzerine sıcaklığın etkisi……… 44 4.1.6. Katalaz enzimi için K_m ve V_max değerlerinin hesaplanması… 45 4.1.7. Katalaz enziminin depolanma stabilizitesinin belirlenmesi… 47 4.1.8. Katalaz enziminin oda sıcaklığındaki bozunma hızı………... 48 4.1.9. Katalaz enzimi için inhibitörlerin etkisinin incelenmesi……. 49 4.1.10. Katalaz enziminin KI değerinin hesaplanması……….. 54 4.2. Katalaz Enzimi Đçin Saflaştırma Metotları………... 59 4.2.1. Katalaz enzimi için jel kolon kromotografisi sonuçları…….. 59 4.2.2. Katalaz enzimi için elektroforez sonuçları ve moleül ağırlığı 60 4.2.3. Bradfort yöntemi ile protein tayini sonuçları……….. 61

62 BÖLÜM 5………..

TARTIŞMA VE ÖNERĐLER………... 62

KAYNAKLAR……….. 66

ÖZGEÇMĐŞ……….……….. 71

vi

SĐMGELER VE KISALTMALAR LĐSTESĐ

a.a : Amino Asit

APS : Amonyum Persülfat

BSA : Serum Albümin

CAT : Katalaz

E.C : Enzim Kod Numarası [E] : Enzim Konsantrasyonu

EDTA : Etilen Diamin Tetra Asetik Asit

EÜ : Enzim Ünitesi

GOD : Glukozoksidaz GSH-Px : Glutatyon Peroksidaz [I] : Đnhibitör Konsantrasyonu LPO : Lipit Peroksidasyon

PAGE : Poliakrilamid Jel Elektroforez Prot. : Protein

PVP : Polivinil Prolidin

POD : Peroksidaz

PFO : Polifenil Oksidaz

[S] : Substrat Konsantrasyonu SDS : Sodyum Dodesil Sülfat

SDS-PAGE : SDS Poliakrilamid Jel Elektroforez SOD : Süperoksit Dismutaz

TEMED : Tetra Etil Metilen Diamin UV : Ultraviyolet

V : Enzimatik Reaksiyon Hızı

vii

ŞEKĐLLER LĐSTESĐ

Şekil 2.1. [E] - reaksiyon hızı grafiği ... 9

Şekil 2.2. [S] – reaksiyon hızı grafiği ... 10

Şekil 2.3. Sıcaklık – reaksiyon hızı grafiği………..….. 10

Şekil 2.4 Kompetitif (yarışmalı) enzim inhibisyonu………... 13

Şekil 2.5. Kompetitif (yarışmalı) enzim inhibisyonu için Linewear-Burk grafiği………... 13 Şekil 2.6. Nonkompetitif (yarışmasız) enzim inhibisyonu………. 14

Şekil 2.7. Nonkompetitif (yarışmasız) enzim inhibisyonu için Linewear- Burk grafiği……… 15 Şekil 2.8. Ankompetitif(yarı yarışmalı) enzim inhibisyonu ……….. 16

Şekil 2.9. Ankompetitif (yarı yarışmalı) enzim inhibisyonu için Linewear- Burk grafiği……….... 16 Şekil 2.10. Katalaz enziminin hem b ve hem d grupları…...……… 18

Şekil 2.11. Katalazın etki mekanizması……….……….. 19

Şekil 2.12. Bal kabağı çekirdeği (Cucurbita maxima) ve kabak çekirdeği (Cucurbita moschata)………. 20 Şekil 2.13. Bal kabağı çekirdeğinin (Cucurbita maxima) içeriği……..……... 21

Şekil 3.1. Reaksiyon hızı – [S] (Michaelis- Menten) grafiği………... 26

Şekil 3.2. 1/V – 1/ [S] (Lineweaver-Burk grafiği)grafiği……….. 27

Şekil 3.3. Bradfort yöntemi………. 40

Şekil 4.1. Bal kabağı çekirdeği (Cucurbita maxima) için 1/V -1/[S] grafiği.. 41

Şekil 4.2. Kabak çekirdeği (Cucurbita moschata) için 1/V – 1/[S] grafiği… 42

Şekil 4.3. Bal kabağı çekirdeği (Cucurbita maxima) için pH grafiği……... 43

Şekil 4.4. Kabak çekirdeği (Cucurbita moschata) için pH grafiği………... 44

Şekil 4.5. Kabak çekirdeğine (Cucurbita moschata) sıcaklığın etkisi……… 44

Şekil 4.6. Bal Kabağı çekirdeğine (Cucurbita maxima) sıcaklığın etkisi... 45

viii

Şekil 4.7. Bal Kabağı çekirdeği (Cucurbita maxima) için 1/V -1/ [S] grafiği 46 Şekil 4.8. Kabak çekirdeği (Cucurbita moschata) için 1/V -1/ [S] grafiği…. 46 Şekil 4.9 Kabak çekirdeği (Cucurbita moschata) katalazı için depolanma

kararlılığı……….... 47

Şekil 4.10. Bal kabağı çekirdeği (Cucurbita maxima) katalazı için depolanma kararlılığı……….. 48 Şekil 4.11. Bal kabağı çekirdeği (Cucurbita maxima) katalazı için bozunma

hızı……….. 48

Şekil 4.12. Kabak çekirdeği (Cucurbita moschata) için bozunma hızı……… 49 Şekil 4.13. Katalaz enzimi üzerine tiyoürenin etkisi………..…….. 50 Şekil 4.14. Katalaz Enzimi üzerine sodyum azitin etkisi………. 50 Şekil 4.15. Katalaz enzimi üzerine EDTA’nın etkisi………..…. 51 Şekil 4.16. Bal kabağı çekirdeği (Cucurbita maxima) üzerine a.a etkisi……. 51 Şekil 4.17 Kabak çekirdeği (Cucurbita moschata) Üzerine a.a etkisi……… 52 Şekil 4.18. Kabak çekirdeği (Cucurbita moschata) katalazı üzerine KCN

etkisi ve KI değeri………...……… 54 Şekil 4.19. Bal kabağı çekirdeği (Cucurbita maxima) katalazı üzerine KCN

etkisi ve KI değeri ………... 55 Şekil 4.20 Bal kabağı çekirdeği (Cucurbita maxima) katalazı üzerine

tiyoüre etkisi ve KI değeri ………. 55 Şekil 4.21. Kabak çekirdeği (Cucurbita moschata) katalazı üzerine tiyoüre

etkisi ve KI değeri………..…. 56 Şekil 4.22. Bal kabağı çekirdeği (Cucurbita maxima) katalazı üzerine

sodyum azitin etkisi ve KI değeri ……….…. 56 Şekil 4.23. Kabak çekirdeği (Cucurbita moschata) katalazı üzerine sodyum

azitin etkisi ve K_I değeri………. 57 Şekil 4.24. Bal kabağı çekirdeği (Cucurbita maxima) katalazı üzerine FeCl₃

etkisi ve K_I değeri ……… 57

Şekil 4.25. Kabak çekirdeği (Cucurbita moschata) katalazı üzerine FeCl₃ etkisi ve K_I değeri………...… 58 Şekil 4.26. SDS-PAGE jeli………... 60 Şekil 4.27 BSA standart grafiği………..………. 61

ix

TABLOLAR LĐSTESĐ

Tablo 1.1. Hücre içi antioksidanlar ………. 3 Tablo 1.2. Membran antioksidanlar ... 3 Tablo 3.1. 0,1 M Sitrat tamponu çözeltilerinin hazırlanması………...…… 23 Tablo 3.2. 0,2 M Sodyum fosfat tampon çözeltisinin hazırlanması…...….. 24 Tablo 3.3. 0,05 M Tris tamponunun hazırlanması……..…………...…….. 24 Tablo 3.4. % 10’luk Ayırma jelinin içeriği….………...…….. 38 Tablo 3.5. % 5’lik Yoğunlaştırma jelinim içeriği……….………...………. 38 Tablo 3.6. Standart eğrinin çizimi için gerekli olan numune

miktarları………... 39

Tablo 4.1. Katalaz enzimi için % 30 amonyum sülfat çöktürmesi, diyaliz

ve saflaştırma sonuçları………..……….. 43 Tablo 4.2. Bal kabağı çekirdeği (Cucurbita maxima) için K_m ve V_max

değerleri………... 45

Tablo 4.3. Kabak çekirdeği (Cucurbita moschata) için K_m ve V_max

değerleri………... 47

Tablo 4.4. Bal kabağı çekirdeği (Cucurbita maxima ) ve kabak çekirdeği (Cucurbita moschata) katalazı üzerine bazı bileşiklerin etkisi

ve I50 değerleri………. 52 Tablo 4.5. Bal kabağı çekirdeği (Cucurbita maxima) ve kabak çekirdeği

(Cucurbita moschata) katalazı üzerine metallerin etkisi……... 53 Tablo 4.6. Bal kabağı çekirdeği (Cucurbita maxima) ve kabak çekirdeği

(cucurbita moschata) katalazı üzerine bazı bileşiklerin etkisi

ve KI değerleri………..………...… 58 Tablo 4.7. Katalaz enzimi için bağıl aktivite değerleri………. 59

x

ÖZET

Anahtar kelimeler: Kabak çekirdeği, Cucurbita maxima, Cucurbita moscahata, antioksidant enzimler, katalaz, antioksidan sistemler, hidrojen peroksit

Katalaz (Hidrojen Peroksit Oksiredüktaz, E.C: 1.11.1.6), hidrojen peroksitin suya dönüşmesini sağlar ve prostetik grup olarak hem grubu içerir. Ayrıca katalaz omurgalı ve omurgasız hayvanlarda, bitkilerde ve mikroorganizmalarda mevcut olup yüksek bir turnover sayısına (4x 10⁷ s^-1) sahiptir. Katalaz önemli bir antioksidan savunma sistemi bileşeni olup, hidrojen peroksitin suya dekornposizyonunu katalizler.

Bu çalışmada katalaz enzimi Sakarya’da yetiştirilen iki farklı kabak çekirdeğinden (Cucurbita maxima ve Cucurbita moschata) saflaştırılarak kinetik özellikleri incelenmiştir. Öncelikle enzim homojenatı uygun tampon çözeltileri kullanılarak elde edilimiş ve ardından amonyum sülfat çöktürmesi ve diyaliz işlemleri uygulanmıştır.

Diyalizden elde edilen protein sephadex G-100 kolon kromotogrofisi kullanılarak saflaştırılmıştır. Enzimin molekül ağırlığını belirlemek amacıyla SDS-PAGE elektroforez uygulanmıştır. Kabak çekirdeklerinden elde edilen katalaz enzimleri için hidrojen peroksit substratı kullanılarak 240 nm’de UV–Vis spektrofotometre cihazında absorbans azalmasının takibi ile K_m ve V_max değerleri elde edilmiştir. Cucurbita maxima için K_m= 17,68 mM, V_max

= 81,300 EÜ / mL; Cucurbita moschata için Km = 20,029 mM, Vmax = 58,139 EÜ / mL olarak hesaplanmıştır. Enzim için optimum pH, optimum sıcaklık değerleri sırasıyla 6,8- 7,0 ve 25 °C olarak bulunmuştur. Enzimlerin molekül ağırlıkları elektroforez kullanılarak hesaplanmıştır. Her iki kabak çekirdeği katalazı için 60 kDa ile 8 kDa arasında üç bant gözlemlenmiştir. Ayrıca siyanür ve azid gibi hem inhibitörlerinin enzim aktivitesini inhibe ettiği tespit edilmiş ve inhibitörlerin K_I değerleri hesaplanmıştır. Her iki çekirdek içinde azit KI = 0,66 ± 0,04 ; siyanür KI = 2,42± 0,01 olarak hesaplanmştır.

xi

CAHARACTERIZATION OF CATALASE FROM TWO

DIFFERENT CUCURBITA SEEDS (Cucurbita maxima and

moschata) GROWN IN SAKARYA

SUMMARY

Key words: Catalase, antioxidant activity, Cucurbita maxima, Cucurbita moscahata, hydrogen peroxide , antioxidant system.

Catalase (Hydrojen Peroxide Oxidoreductase, E.C: 1.11.1.6), converts hydrogen peroxide to water and contains heme as prostethic groups. In addition, catalase exist, in vertebrates, in vertebrates animals, plants and microorganisms with a high turnover number (4x 10⁷ s^-1). Catalase is a major primary antioxidant defense component that primarily works to catalase the decomposition of Hydrogen Peroxide to water.

In this study, catalase was purified from cucurbita seeds (Cucurbita maxima and Cucurbita moschata) and some kinetic properties were studied. The purification was performed at three steps: Preparation of homogenate , ammonium sulphate fractionation and after dialysis, the enzymes were applied to G-100 sephadex column chromatography system. SDS - PAGE electrophoresis was applied for the determination of the enzymes molecular weights. They were found in three bands from 60 to 8 kDa in the electrophoresis for both seeds. Optimum pH, optimum temperature of the enzymes were found to be 6,8 – 7,0 and 25 °C. Km and Vmax

values were calculated. Cucurbita maxima Km=17,68 mM Vmax=81,300 EÜ/mL ; Cucurbita moschata K_m=20,029 mM, V_max=58,139 EÜ/mL. In addition to that, Heme catalase inhibitors, such as azide and cyanide, inhibited the enzyme activity markedly and KI values were calculated. For Cucurbita maxima and moschata azide KI = 0,66 ± 0,04 ; cyanide KI = 2,42± 0,01.

BÖLÜM 1. GĐRĐŞ

Canlı sistemlerde meydana gelen bütün fizyolojik olaylar; enzim, hormon ve iz elementleri gibi farklı ajanlar tarafından yönetilen oksidasyon ve indirgenme reaksiyonlarının kompleks kombinasyonlarını içerir. Canlı sistemlerde bulunan redoks dengesindeki herhangi bir değişiklik, hücrelerin ve dolayısıyla dokuların fonksiyonlarının bozulmasına sebep olur ve bu durum zamanla ölümle sonuçlanabilir. Farklı oksidasyon reaksiyonlarını düzenleyen ve dokularda doğal bir şekilde bulunan antioksidant bileşikler, uzun ömürlü determinantların potansiyel bir sınıfı olarak değerlendirilmektedir.

Antioksidant bileşiklerde veya antioksidant telafi (kompensatör) sistemlerinde bulunan bazı komponentlerin endojen sentezindeki herhangi bir yetersizlik, farklı hastalıkları meydana getirebilir. Hücrelerde çok sayıda koruma ve savunma mekanizmaları bulunur.

Organizmaların kendilerini oksijen metabolizmasının toksik etkilerine karşı korumaları için bu savunma mekanizmaları gereklidir. Bu bakımdan biyolojik sistemlerde antioksidan savunma mekanizmasının araştırılması ile ilgili çalışmalar son zamanlarda büyük bir önem kazanmıştır. Günümüzde en çok araştırılan biyolojik proseslerden biri olan yaşlanma dahil, birçok hastalığın oksidatif hasardan kaynaklandığı ispatlanmıştır (Hurst ve ark.1997; Jornot ve ark.1998; Mills ve ark.1998).

Serbest radikaller hücre içi reaksiyonlara zarar veren ve toksik etki gösteren bileşenlerdir. Genellikle saldırı hedefleri somatik hücreler veya bağışıklık sistemidir.

Dış orbitallerinde bir veya daha fazla eşleşmemiş elektron içerdikleri için, bu elektronlarını paylaşabilmek için diğer moleküller ile hızlı bir şekilde reaksiyona girerler (Hurst ve ark.1997; Jornot ve ark.1998; Mills ve ark.1998).

Serbest radikaller hem normal metabolizmanın hem de toksik maddelerin etkileri sonucu yan ürün olarak oluşabilirler (Cross, 1987). Örneğin radyasyon, sigara dumanı, ekzoz gazları, deodorantlar, kimyasal maddeler , insektisit ve peptisit olarak bilinen böcek öldürücüler serbest radikal oluşumuna sebep olmaktadır (Hurst ve

ark.1997; Jornot ve ark.1998; Mills ve ark.1998). Özellikle oksijen kökenli radikaller insan hayatında çok ciddi sıkıntılar teşkil etmektedir. Canlılarda oluşan ilk ve oksijen kökenli olan temel radikal süperoksit radikalidir. Süperoksit radikali; çok iyi indirgen ve zayıf yükseltgen özellik göstermektedir. Hücresel reaksiyonlar sonucu mitokondri, kloroplast ve periksizomlarda hızlı bir şekilde oluşmaktadır. Ayrıca indirgenmiş geçiş metallerinin otooksidasyonu sonucu da süperoksit radikalleri olaşabilmektedir.

Cu ⁺² + O₂ Cu ⁺² + O₂^{. -} (1.1)

Yapısında eşleşmemiş elektron içermediği için radikalik özellik taşımayan fakat canlı metabolizması için oldukça zararlı olan bir diğer madde de hidrojen peroksit’tir.

O2 + 2e ^- + 2 H⁺ H2O2 (1.2)

O2. -

+ e ^- + 2H ⁺ H2O2 (1.3)

Hidrojen peroksit; demir, bakır gibi iyonların varlığında hidroksil radikali oluşumuna sebep olduğu için oksitleyici özellik taşımakta olduğu bilinmektedir.

Fe ⁺² + H2O2 Fe ⁺³ + OH ^- + OH^. (1.4)

Canlı metabolizması için son derece tehlikeli olan ve uyarılmış su molekülünün hemolitik yıkımı ile oluşan hidroksil radikali son derece reaktif bir radikaldir.

2H₂O H₂O * + e ^- + H₂O+

(1.5)

Ya da diğer bir deyişle hidrojen peroksitin iki elektron indirgenmesi ile su oluşur, tek elektron indirgenmesi ile ise hidroksil radikali oluşur (Hurst ve ark.1997; Jornot ve ark.1998; Mills ve ark.1998).

Serbest radikaller hücre zarında bulunan proteinleri parçalayarak hücre yapısına zarar veren; hücre çoğalmasını ve büyümesini sağlayan nükleik asit’e (DNA’ya) etki edip

yapısını bozan bileşikler oldukları için nötralize edilmeleri gerekmektedir. Reaktif oksijen türlerinin oluşumunu engellemek veya oluşan radikallerin hücreye zarar vermesini önlemek amacı ile vücutta birçok savunma sistemi (mekanizması) gelişmiştir. Antioksidan türlerine karşı vücutta oluşan bu savunma sistemlerine antioksidan savunma sistemleri denilir (Ames ve ark. 1993; Müftüoğlu, 2003).

Antioksidanlar endojen ve ekzojen kaynaklı olmak üzere iki ana gruba ayrılırlar.

Endojen kaynaklı antioksidanlar

Enzimler: katalaz, dismutaz, glutatiyon peroksidaz Enzim olmayanlar: albumin, E vitamini, B-karoten vb…

Eksojen kaynaklı antioksidanlar: ksantin oksidaz inhibitörleri, NADPH oksidaz inhibitörleri (Akkuş, 1995; Dündar ve Aslan 2000).

Tablo.1.1. Hücre içi antioksidanlar (Akkuş, 1995; Dündar ve Aslan 2000)

Superoksit Dismutaz (Cu, Zn, Mn )

Süperoksit radikalinin katalitik olarak uzaklaştırılması

Katalaz H2O2’nin uzaklaştırılmasında

Glutatyon Peroksidaz H₂O_2’nin ve lipit hidroperoksitlerinin uzaklaştırılması

Tablo.1.2.Membran antioksidanlar (Akkuş, 1995; Dündar ve Aslan 2000).

Vitamin E Yağda erir, zincir kırıcı antioksidandır. Plazmadaki lipoprotein lipitlerini de korur.

Β-Karoten Yağda erir, radikal temizleyicisidir. Singlet oksijeni ortadan kaldırır.

Koenzim-Q Temel rolü enerji metabolizmasındadır. Redükte durumda antioksidan olarak görev yapabilir.

En önemli antioksidan enzimler:

1. Süperoksit anyonunu hidrojen peroksite dönüştüren süperoksit dismutaz 2. Organik peroksitleri detoksifiye eden glutatyon peroksidaz (GSH-Px) 3. Hidrojen peroksiti suya indirgeyen katalaz (CAT) dır (Arosio ve ark. 2000).

Bu çalışmanın amacı, Sakarya’da yetişen iki farklı kabak çekirdeğinden (Cucurbita maxima ve Cucurbita moschata) katalaz enziminin saflaştırılması ve karakterize edilmesidir. Bu amaçla önce CAT enzimi, Sakarya’da yetişen kabak çekirdeklerinden elde edilmiş; daha sonra amonyum sülfat çöktürmesi yöntemiyle çöktürülen CAT enzimi, diyaliz edilerek kısmen saflaştırılmıştır. Enzimin kinetik özellikleri, optimum pH ve optimum sıcaklığı, termal kararlılığı, inhibisyon çalışmaları diyaliz sonucu elde edilen enzim ekstraktı ile yapılmıştır.

Daha sonraki saflaştırma aşamaları ise jel filtrasyon kromatografisi ve poliakrilamid jel elektroforezi sodyum dodesil sülfat (SDS-PAGE) ile yapılmıştır. Elde edilen bulgular her iki farklı kabak çekirdekleri için karşılaştırılmış ve sonuçlar tablolar ve şekiller halinde sunulmuştur.

Çalışmalarımız süresince bitkilerin yetişme ortamından, hava koşullarından ve toprak içeriklerinden etkilenileceği düşünülerek, tüm analizler süresince tek seferde alınan kabak çekirdekleri kullanılmıştır. Kabak çekirdekleri - 20 °C derin dondurucuda saklanmış ve ihtiyaç duyuldukça az miktarlarda enzim homojenatları hazırlanarak ölçümler yapılmıştır.

1.2. Kaynak Özetleri

Lokman Ö. ve ark. (2005), Maydonazdan katalaz enzimini; Amonyum sülfat çöktürmesi ve DEAE-Sephadex A-50 jelinin kullanıldığı iyon değişim kromotografisi ile saflaştırmışlardır. Enzimin spesifik aktivitesi 1126 EÜ/mg, optimum pH, stabil pH değerleri 7 ve optimum sıcaklık ise 35 °C saptanmıştır.

Malgorzata M. ve ark. (2005), Dondurulmuş soya fasülyesi filizlerindeki antioksidan enzim aktivitelerini incelemişlerdir. 1 °C ye soğutulmuş filizlerdeki CAT ve SOD aktivitelerinin 25 °C dekine göre arttığı gözlenmiştir.

Kailash P., (2004), Keten tohumundan izole edilen keten lignanı bileşiğinin hipokolesterolemik ve antiarteriosklerozik etkisini incelemiştir. Bu çalışmada keten tohumundan izole edilen enzim homojenatında katalaz enziminin kinetik aktiviteleri incelenmiş ve katalaz enziminin davranışları rapor edilmiştir.

Liangquan S. ve ark. (2004), Bu çalışmada, Cu, Zn-Süperoksit dismutaz (I ve III) tütün yapraklarından (Nicotiana Tobacum) Amonyum sülfat, etanol-kloroform ve aseton ve DEAE - 52, Sephadex G - 75 kolon kromotografisi yardımıyla saflaştırılmıştır. Cu, Zn - SOD III’ ün bazı özellikleri belirlenmiştir. Katalazın moleküler ağırlığı 22,976 kDa olarak tayin edilmiştir.

Jacques R.Vanfleteren, (1992), Đplik kurdu (Caenorhabditis Elegans) dokusundan Cu, Zn-Süperoksit Dismutaz enzimini saflaştırmışlardır. Enzim aktivitesi 2660 U/mg protein, moleküler ağırlığıda 37, 5 - 40 kDa aralığında saptanmıştır. Mitchell ve ark.

(1991), Lahana iliklerinden (Trichoplusiani) katalazı; ethanol-kloroform franksiyonu ve standart kolon kromotogrofisi ile saflaştırmışlardır. Enzimin spesifik aktivitesi 2,2x10⁵ Unit, moleküler ağırlığı 247 – 259 kDa aralığında saptanmıştır.

Beaumont ve ark. (1990), Patates kökünden (Solanum Tuberosum) katalazı; AcA-34 ultrajel kolonu ile saflaştırmışlardır. Yapılan aktivite çalışmaları sonucu enzimin spesifik aktivitesini yaklaşık 3000 EÜ/mg protein değerinde saptamışlardır. Bir diğer çalışmada ise enzimin molekül ağırlığını 224 kDa bulunmuştur. Ayrıca bu araştırmada enzim için siyanid ve azid inhibitörleri kullanmışlardır.

Havir ve Mchale (1987), Tütün yapraklarından (Nicotiano Sylvestris) katalaz enzimini; Sephadex G-25 kolonu kullanarak saflaştırmışlardır (biri tipik düşük peroksidatik aktivitesi olan CAT-I ve diğeri yüksek peroksidatik aktivitesi olan CAT-III izoenzimlerini). Bunların katalitik reaksiyonda K_m değerleri CAT-I için 0,057 M ve CAT-III için 0,054 M olarak saptanmıştır.

Hirasawa ve ark. (1987), Ispanaktan (Spinacea oleracea) katalaz enzimini saflaştırmışlar ve ıspanak katalazının spektroskopik özelliklerini incelemişlerdir.

Yapılan aktivite çalışmaları sonucu enzimin spesifik aktivitesini yaklaşık 25000 EÜ/mg protein değerinde saptamışlardır. Ayrıca jel filtrasyonu yardımıyla enzimin moleküler ağırlığını da 125 kDa olarak bulmuşlardır

Köksal, E., (2003) Katalaz enziminin kara lahana bitkisinden (Brassica oleracea L.

Var. Acephala D.C.) saflaştırılması, karakterizasyonu ve bazı peptisitler ile antibiyotiklerin enzim üzerindeki etkilerini incelemişlerdir. Kara lahanadan kısmi olarak saflaştırılan katalaz enziminin kinetik özelliklerini rapor etmişlerdir.

Yücebilgiç, G., (2007) Keten tohumu (Linum Usitatissimum) ekstraktında katalaz ve süperoksit dismutaz enzim aktivitelerini incelemiş, enzimlerin tüm kinetik özelliklerini rapor etmişlerdir.

Pazıdan (Beta vulgaris var. cicla), roka (Eruca Sativa) bitkisinden, ısırgan otundan (Urtica dioica), ıspanaktan (S.oleracea cv. Gladiatör), keten tohumundan (LinumUsitatissimum), tatlı su çipurasından (Tilapia), karnabahardan (Brassica oleracea L.) ve daha birçok bitki, tohum ve meyveden karakterizasyonu ve saflaştırılması gerçekleştirilmiştir (Gülçin, Đ., 2002; Öztürk, L., 2002; Yücebilgiç, G., 2007).

BÖLÜM 2. ENZĐMLER

2.1 Enzimler Hakkında Genel Bilgi

Enzimler metabolizma reaksiyonlarının pek çoğunu hızlandıran, protein yapısındaki, biyolojik katalizörlerdir. Doğal olarak yalnız canlılar tarafından sentezlenirler. Hücre içerisinde meydana gelen binlerce tepkimenin hızını ve özgüllüğünü düzenlerler.

Çok defa hücre dışında da etkinliklerini korurlar. Hücrelerde organik maddelerin yapılması ve yıkılması, sindirim olayı, kas kasılması, hücre solunumu gibi önemli fizyolojik faaliyetler ve çeşitli metabolizma reaksiyonlarının sonucudur ve bütün bu reaksiyonların tümü enzimlerin katalitik etkisi ile mümkün olmaktadır. Bu sebeple yaşam birçok enzim reaksiyonlarının bir araya gelmesinden ibaret olan bir sistem olarak tanımlanmıştır. Enzimlerin ürüne dönüştürdükleri maddelere, substrat denir.

Enzimlerle ilgili yapılan ilk çalışmalarda, enzimin etki ettiği substrat adının sonuna – az eki getirilerek (Üreaz, lipaz, fosfataz v.b.) veya genel adlarıyla (pepsin, tripsin gibi) isimlendirilirken, günümüzde Uluslararası Biyokimya Birliği (IUB) tarafından yapılan sistematik sınıflandırmaya göre isimlendirilmektedir. Bu sınıflandırmada her enzim dört rakamlı bir kod numarası ile (E.C.) tanımlanmıştır (Lehninger, 1982;

Bingöl, 1983; Tekman ve Öner, 1986; Keha ve Küfrevioğlu, 1997).

Enzimlerin bazıları basit proteinlerdir. Bunların katalitik etki gösteren kısımları doğrudan doğruya proteinin polipeptid zinciridir. Bazı enzimlerin ise katalitik etki gösterebilmeleri için proteinden başka metal iyonuna; bazılarının protein olmayan organik bileşiğe; bazılarının da hem metal iyonuna hem de organik bileşiğe ihtiyaçları vardır. Bu iyon ve bileşiklere genel olarak kofaktör denilir (Ziyan, 1998).

Organik bileşik enzimin protein kısmı ile oldukça sıkı birleşmiş ve dissosie olmuyorsa prostetik grup adını alır. Pek sıkı birleşmemiş ve dissosie olabiliyorsa koenzim adını alır. Kofaktörlere sahip olan enzimlere de holoenzim denilmektedir (Tekman, Ş., Öner, N., 1994). Enzimlere ligand bağlarıyla farklı kuvvetlerde

tutunmuş olan gevşek bağlı koenzimler diyaliz yolu ile enzimlerden uzaklaştırılabilirler.

Apoenzim, kofaktörlü bir enzimin yalnızca protein kısmına verilen addır. Enzimin etki ettiği madde veya madde karışımına ise ‘’substrat’’ denir.Yani enzimlerin üzerinde etkili oldukları ve ürüne dönüştürebildikleri bileşikler o enzimin substratlarıdır (Tekman, Ş., Öner, N., 1994).

Koenzim veya prostetik grup enzimin etki edeceği kimyasal reaksiyonu, yani spesifisitesini tayin eder. Apoenzim ise enzimin hangi substrata etki edeceğini, diğer bir deyişle enzimin substrat spesifisitesini tayin eder. Örneğin; koenzimi NAD ⁺ olan enzimler dehidrojenasyon reaksiyonlarını kataliz ederler, fakat hidrojenin hangi substrattan ayrılacağını tayin eden enzimin apoenzim kısmıdır.

Enzimlerin en önemli özelliklerinden birisi de katalizledikleri reaksiyon tiplerine ve ürüne dönüştürdükleri substratlara karşı son derece spesifik olmalarıdır. Bundan dolayı enzimler hücre içi reaksiyonlarda hiçbir yan ürün oluşturmaksızın etkilerini gösterirler. Hücre içi reaksiyonlar enzimler sayesinde birkaç saniye gibi kısa bir süre içerisinde gerçekleşmektedir.

Birim zamanda bir mol enzimin ürüne dönüştürdüğü substratın mol sayısına turnover sayısı denir. Turnuver sayısı enzimlerin katalizleme güçlerini gösteren bir ifadedir.

Katalaz enzimi için turnover sayısı = 4 x 10⁷ s^-1’dir (Yücebilgiç, G., 2007).

Enzimlerin miktarı, aktiviteleri esas alınarak belirlenir ve enzim ünitesi (E.Ü) cinsinden verilir. Geniş bir enzim ünitesi tarifi olmamasına rağmen genelde, 25 °C’

de ve optimal şartlarda 1 mikromol substratı 1 dakikada ürüne dönüştüren enzim miktarı, 1 enzim ünitesi olarak kabul edilmiştir.

Spesifik aktivite, 1 mg protein başına düşen enzim ünitesi olarak tanımlanır ve bu da enzimin saflığının bir ölçüsüdür (Lehninger, 1982; Bingöl, 1983).

2.2. Enzimlere Etki Eden Faktörler

Enzim reaksiyonlarının hızı üzerine :

enzim ve substrat konsantrasyonlarının, sıcaklığın, ortam pH’sının, zamanın reaksiyon ürünlerinin, ışık ve de fiziksel etkenlerin etkisi vardır.

2.2.1. Enzim konsantrasyonunun etkisi

Enzim reaksiyonunu hızı, genel olarak, enzim konsantrasyonu ile orantılıdır. Substrat konsantrasyonu sabit tutulup enzim konsantrasyonu arttırılırsa substratın tamamı enzim-substrat kompleksi oluşturana kadar reaksiyon hızı artar. Substrat tükendiği anda enzim reaksiyonu sabitlenir.

Şekil 2.1. [E] - Reaksiyon hızı grafiği

2.2.2.Substrat konsantrasyonunun etkisi

Sabit enzim konsantrasyonunda, enzim reaksiyonunun hızı belirli bir noktaya kadar substrat konsantrasyonu ile artar. Bundan sonra substrat konsantrasyonunun artması ile artık reaksiyon hızı değişmez.

Enzim konsantrasyonu

Tepkime hızı

Enzim konsantrasyonu

Tepkime hızı

Şekil 2.2. [S] - reaksiyon hızı grafiği

2.2.3. Sıcaklığın etkisi

Enzim reaksiyonlarının hızı sıcaklık ile artar. Sıcaklığın her 10 °C artması ile reaksiyon hızı ortalama iki kat artar. Đnvitro enzim reaksiyonları çoğu zaman 37 - 40

°C ‘de yapılır. Bu sıcaklıkta reaksiyon hızı oda sıcaklığındakine oranla dört kat daha fazladır.

Şekil 2.3. Sıcaklık – reaksiyon hızı grafiği

Optium sıcaklık

Sıcaklık

Tepkime hızı

Optium sıcaklık

Sıcaklık

Tepkime hızıTepkime hızı

Substrat konsantrasyonu X kadar enzim varken

Tepkime hızı

Substrat konsantrasyonu X kadar enzim varken

Fakat belirli bir sıcaklık aşıldıktan sonra, enzimler denatüre olurlar ve etkilerini kaybederler. Her enzim için birim zamanda substratını en fazla değişikliğe uğrattığı belirli bir sıcaklık vardır. Bu sıcaklığa o enzimin optimum sıcaklığı denir.

2.2.4. pH etkisi

Enzimin reaksiyon hızı ortamın pH’sına bağlıdır. Belirli bir pH alanında enzimin etkisi en fazladır. Bu pH’ya enzimin optimum pH’sı denir. Optimum pH’nın aşağısında ya da yukarısında reaksiyon hızı daha azdır. Belirli bir pH’dan sonra da enzim tamamen etkisiz kalır.

2.2.5. Zamanın etkisi

Yapılan araştırmalar enzimlerin optimum sıcaklıklarının ve optimum pH’larının zamana bağlı olduğunu göstermektedir.

2.2.6. Reaksiyon ürünlerinin etkisi

In vitro enzim reaksiyonu devam ettikçe reaksiyon ürünleri enzimi inhibe ettikleri için enzim reaksiyonun hızı azalır. Bu inhibisyona sebep, reaksiyon ürünlerinin molekül yapısı bakımından substratı andırmaları ve enzime substrattan daha fazla bağlanmalarıdır. Reaksiyon ürünü, enzim proteini ile substratın birleştiği yerin dışında bir yerde birleşebilirler. Allosterik yere bağlanan madde, enzimin etkili bölgesinde biçimsel bir değişiklik gösterebilir. Bunun sonucu olarak, enzim proteininin şeklinin bozulması dolayısıyla enzimin substrat ile birleşmesi substratın yapısına, konsantrasyonuna veya diğer faktörlere bağlı olarak inhibisyona neden olur. Bu etkiye de allosterik etki denir.

2.3. Enzim inhibisyonu

Enzimlerin hem in vivo, hem de in vitro aktivitelerinin bazı bileşikler tarafından azaltılmasına veya tamamen yok edilmesine enzim inhibisyonu denir. Buna sebep olan bileşiklere de inhibitör adı verilir. Đnhibitörler genellikle düşük molekül

ağırlığına sahip bileşik veya iyonlardır. Enzimatik aktivitenin inhibisyonu biyolojik sistemlerde başlı başına bir kontrol mekanizması oluşturduğundan oldukça önemlidir. Đnhibisyon araştırmaları ile enzimatik reaksiyonların mekanizmaları, aktif merkezde rol oynayan fonksiyonel gruplar, aktif merkezin yapısı ve enzimin substrat spesifikliği açıklanabilir. Ayrıca ilaçların ve toksik maddelerin etkisi de bu yolla incelenebilir.

Đki tip inhibisyon vardır, birincisi tersinir (geri dönüşlü) inhibisyon, ikincisi tersinmez (geri dönüşsüz) inhibisyondur. Tersinmez inhibisyon’da, inhibitör aktif merkeze kovalent olarak bağlanarak enzimi inaktive eder. Tersinmez (geri dönüşümsüz) inhibisyonlara örnek olarak, aktif merkezlerinde serin bulunan enzimlerin di-izopropilflorofosfat tarafından inaktivasyonları verilebilir. Tersinir inhibisyonda ise inhibitör enzim ile veya enzim substrat kompleksi ile kovalent olmayan şekilde bağlanır. Üç çeşit tersinir inhibisyon türü vardır (Robyt and White 1990). Bunlar;

Yarışmalı inhibisyon (Kompetitif Đnhibisyon) Yarışmasız inhibisyon (Nonkompetitif Đnhibisyon) Yarı Yarışmalı inhibisyon (Ankompetitif Đnhibisyon)

2.3.1. Yarışmalı inhibisyon (Kompetitif inhibisyon)

Bu tür inhibisyon, yapı bakımından substrata benzeyen maddeler tarafından yapılır.

Đnhibitör aktif merkeze bağlanarak enzim-inhibitör kompleksini oluşturur. Bu kompleks ürüne dönüşemeyeceğinden inhibitör bağlamış olan enzim molekülleri boşa harcanmış olur. Fakat substrat konsantrasyonunu arttırmakla inhibisyon etkisi ortadan kaldırılabilir. Yani enzimin V_max değeri değişmezken, K_m değeri artar.

Kompetitif inhibitör varlığında reaksiyon şeması aşağıda verilmektedir (Ziyan,1998).

Yarışmalı enzim inhibisyonu; tersinir enzim inhibisyonunun yaygın bir tipidir.

Kompetitif inhibitör, sıklıkla yapısal olarak substrata benzeyen ve substrat gibi, enzime tersinir bağlanma özelliği gösteren bir bileşiktir ve EI kompleksi oluşturmak üzere enzim ile tersinir olarak birleşir.

Şekil 2.4. Kompetitif enzim inhibisyonu

Kompetitif enzim inhibisyonunda inhibitör enzime tersinir olarak bağlandığından yarışma, basit olarak daha fazla substrat ekleyerek substrat lehine çevrilebilir. Yeterli substrat varsa bir kompetitif inhibitörün enzime bağlanma olasılığı çok azdır.

Şekil 2.5. Kompetitif enzim inhibisyonu için Lineweaver-Burk grafiği inhibitörlü

inhibitörlü 1/ V

1 / [S] (mM) -1 - 1 /Km

1 / 1/ V

- 1 /Km

1 / V inhibitörlü

inhibitörlü 1/ V

1 / [S] (mM) -1 - 1 /Km

1 / 1/ V

- 1 /Km

1 / V

inhibitörsüz

Eğim = Km/ Vm inhibitörlü

inhibitörlü 1/ V

1 / [S] (mM) -1 - 1 /Km

1 / 1/ V

- 1 /Km

1 / V inhibitörlü

inhibitörlü 1/ V

1 / [S] (mM) -1 - 1 /Km

1 / 1/ V

- 1 /Km

1 / V

inhibitörsüz

Eğim = Km/ Vm

[ ] [ ]

max

1

1 1

1

v

S

K

I

v

K

v

m

 +





 

 +

=

Fakat kompetitif inhibitörün varlığında, yarı maksimal hızın gözlendiği noktadaki substrat konsantrasyonu olan K_m değeri artar. K_m değeri üzerine belirgin etki ve V_max değeri üzerine etkinin az veya çok oluşu, kompetitif enzim inhibisyonunun karakteristiğidir (Lineweaverand Burk, 1934). Kompetitif inhibitör, Lineweaver- Burk grafiğinin eğimini artırır. Kompetitif inhibisyon, metanol içen hastaları tedavi etmek için yararlı olarak kullanılır. Metanol, alkol dehidrojenaz enziminin etkisi vasıtasıyla formaldehite dönüştürülür; oluşan formaldehit, birçok dokuyu harap eder ki gözler özellikle duyarlı olduğundan sıklıkla körlüğe neden olur. Etanol, alkol dehidrojenaz için bir substrat olarak metanol ile etkili bir şekilde yarışır.

2.3.2. Yarışmasız (Nonkompetitif) enzim inhibisyonu

Yarışmalı olmayan enzim inhibisyonudur. Nonkompetitif enzim inhibisyonunda, nonkompetitif inhibitör, enzim üzerinde substratın bağlandığı aktif yerden ayrı bir yere tersinir olarak bağlanır.

Şekil 2.6. Nonkompetitif (yarışmasız) enzim inhibisyonu

[ ] [ ] [ ]







 +

 +







 +

=

i i

m

K I v

S K

I v

K

v 1 1 1

1 1

max max

Enzime nonkompetitif inhibitörün bağlanması substrat bağlanmasını bloke etmez, substrat bağlanması da nonkompetitif inhibitörün bağlanmasını bloke etmez.

Nonkompetitif inhibitör, kimyasal yapı yönünden substrata benzemez; serbest enzime veya ES kompleksi oluştuktan sonra enzimin substratın bağlı olduğu aktif yerden başka bir yerine tersinir bağlanarak enzimi inaktive eder. ESI kompleksi ürün vermek üzere ES kompleksinden daha yavaş parçalandığı için tepkimenin hızı yavaşlamaktadır. Bu tür inhibisyon ile, tepkimenin V_max değeri azaldığı halde K_m değeri değişmez. Nonkompetitif inhibitör, aktif enzimin konsantrasyonunu ve dolayısıyla V_max değerini belirgin olarak azaltır.

Şekil 2.7. Nonkompetitif (yarışmasız) enzim inhibisyonu Lineweaver-Burk grafiği

2.3.3. Yarı yarışmalı (Ankompetitif) enzim inhibisyonu

Ankompetitif inhibitör, nonkompetitif inhibitör gibi, enzim üzerinde substratın bağlandığı aktif yerden ayrı bir yere tersinir olarak bağlanır.

[ ] [ ]

 





 



 +

+

=

i m

K

I

v

S

v

K

v 1 1 1

1

max max

Şekil 2.8. Ankompetitif (yarı yarışmalı) enzim inhibisyonu

Fakat nonkompetitif inhibitör serbest enzime veya ES kompleksine bağlanabildiği halde ankompetitif inhibitör, yalnızca ES kompleksi oluştuktan sonra enzimin substratın bağlı olduğu aktif yerden başka bir yerine tersinir bağlanarak enzimi inaktive eder Ankompetitif inhibitör, ES konsantrasyonunu azaltır.

Şekil 2.9. Ankompetitif (yarı yarışmalı) enzim inhibisyonu Lineweaver-Burk grafiği 1/ S (mM) ^-1

1/ V (EÜ/ mL)

Đnhibitörlü Đnhibitörlü

Đnhibitörsüz

- 1/ Km

1/ Vmax

1/ S (mM) ^-1

1/ V (EÜ/ mL)

Đnhibitörlü Đnhibitörlü

Đnhibitörsüz

- 1/ Km

1/ Vmax

Ankompetitif inhibisyon sonucu hem V_max hem K_m değeri değişmektedir; V_max değeri azalırken K_m değeri küçülür.

2.4. Katalaz Enzimi

Katalaz enzimi (H₂O₂: H₂O₂ oxidoreductase E.C.1.11.1.6) Katalaz (CAT) , doğada özellikle bitkilerde bolca bulunan katalaz enzimi H₂O₂ ‘yi indirgeyen veya parçalayan, periksizomların ise yapısal bir bileşeni olan oksidaz enzimlerinden biridir (Higashi ve ark. 1974; Halliwel ve ark. 1990; Nicholls ve ark. 2000).

Aerobik mikroorganizmaların tamamında, bitkilerde, omurgalı ve omurgasız canlılarda bulunan bu enzim 4 x 10⁷s^-1gibi yüksek bir tunuver sayısına sahiptir.

Bitkisel kaynaklarda bulunan katalaz enzimi dört hem içeren alt birimlerden oluşur ve alt birimlerin molekül ağırlıkları sırası ile 54 ve 59 kDa arasındadır (Eising and Trelease 1990 ). Örneğin kabakta 55 kDa, mercimekte 54 kDa, salatalıkta 54,5 kDa ve pamukta 55 kDa’dır (Kunce and Trelease 1986 ).

CAT’ın temel fonksiyonu, moleküler oksijen mevcudiyetinde metabolizmanın bazı kademelerinde sentezlenen, hidrojen peroksitin ve ROOH gibi bir peroksidi giderek, özellikle membranlarda oluşturabilecekleri geri dönüşümsüz hasarları engellemektedir (Keha ve Küfrevioğlu 2001). Çünkü hidrojen peroksit, singlet oksijen ve hidroksil radikalinin potansiyel kaynağıdır (Huang et al. 1983).

Katalaz enzimi; reaktif oksijen türlerinden olan ve hücresel zarara neden olduğu bilinen ve toksik etkisi olan hidrojen peroksitin suya dönüştürülmesini tek yönlü olarak katalizler. CAT enzimi, substrat olarak kullandığı hidrojen peroksitten, hem elektron alıcısı hemde elektron vericisi olarak faydalanmaktadır (Lanir ve Schejter 1975; Jones ve Masters 1976; Nicholls ve ark. 2000; Robertson, 2004). Birçok dokuda oksidaz ve CAT aktivitesi beraber çalışır.

Şekil 2.10. Katalaz enziminin hem b ve hem d gruplar

2 H₂0₂ 2 H₂0 + 02 (2.1)

Birinci adımda katalazın hem demiri H₂0₂ ile etkileşerek oksijence zengin demir peroksit oluşturur.

CAT-Fe-OH + H₂02 CAT - Fe – OOH + H₂0 (2.2)

Bileşik I olarak adlandırılan demir peroksit ara ürünü, katalaz heminin spektrofotometrik özelliklerini değiştirdiği için invitro ve invivo koşullarda tayin edilebilir. Katalazın kinetik özelliklerinden dolayı invivo koşullarda bileşik - I olarak H202 konsantrasyonlarının indikatörü olarak kullanılır. Hidrojen peroksidin düşük konsantrasyonlarında bileşik-I hidrojen donörü tarafından (örneğin etanol) peroksidatik olarak indirgenebilir.

CAT-Fe-OOH + C2H5OH CAT-Fe-OH + H20 + CH3CHO (2.3)

H202 'nin yüksek konsantrasyonlarında bileşik - I ikinci H202 ile reaksiyona girerek su ve moleküler oksijen oluşturur.

Fe

N N

N N

OH O OH

O

Hem b

O O

OH

OH

O

N N

N N Fe

Hem d

O O O

Fe Fe Fe

N N

N N

OH O OH

O

Hem b

O O

OH

OH

O

N N

N N Fe

Hem d

O O O

Fe Fe

CAT-Fe-OOH + H202 CAT-Fe-OH + H20 + 02 (2.4)

Şekil 2.11. Katalazın etki mekanizması

Yukarıda da anlatıldığı ve şekilde de görüldüğü gibi katalitik reaksiyonda iki basamak yer alır:

Đlk basamakta katalazın Ferrik (Fe³⁺) içeren hali (Porfirin Katyon Radikali) oluştururken peroksit molekülü ile tepkime verir ve burada peroksit molekülü indirgenir.

Sonrasında ikinci basamakta başka bir hidrojen peroksit molekülü yükseltgenerek bileşik doğal halini alır. Bu reaksiyonlarda hidrojen peroksit hem elektron alıcısı hem de vericisi olarak görev yapar (Kremer, 1970; Lardinois, 1995; Switala ve Loewen 2002).

2H₂0₂ 2H₂0+0₂ (2.5) o

o o

Fe^III Fe^IV

HOOH H₂O

O₂+ H₂O HOOH

.+

o

o o

Fe^III Fe^IV

HOOH H₂O

O₂+ H₂O HOOH

.+

2.5. Kabak Çekirdeği

Kabaklar, salatalık, karpuz, acur ve kavunla birlikte kabakgiller (Cucurbitaceae familyası) familyası oluştururlar. Sakız kabağı, helvacı kabağı, balkabağı gibi çeşitleri bulunur. Kabaklar bir yandan meyve gurubuna girer, bir yandan da sebze gurubuna. Bal kabağı yemek yapıldığı zaman sebze olarak, kabak tatlısı yapıldığı zaman da meyve olarak nitelendirilir.

Şekil 2.12. Kullanılan kabak çekirdeği türleri ve görünümleri

Kabak çekirdeği, proteinlerin yapı taşı olan aminoasitler bakımından özellikle de insan vücudunda yapılmayan esansiyel (fenilalanin, triptofan, metionin, gibi) aminoasitler açısından çok zengindir. Kabak çekirdeği içerisinde yüksek oranda bulunan K vitamini kanın pıhtılaşması için gerekli olan protrombinin yapımında görevlidir. Ayrıca kemiklerin sağlıklı olması ve kırıkların iyileşmesi için gerekli bir vitamindir. B grubu vitaminlerinden olan folik asit (B9), DNA yapımında ve hücre yenilenmesinde görev alan çok önemli bir vitamindir. Eksikliğinde kansızlık (megaloblastik), hamilelik sırasında ise fetusta çok ciddi problemlere neden olur.

Kabak çekirdeği çok önemli folik asit kaynağıdır Kabak çekirdeğinde önemli miktarda bulunan potasyum sinir sistemi ve kasların duyarlılığında spesifik etkiye sahiptir. Potasyum ayrıca intrasellüler basınçtan sorumludur, sinir ve kasların

duyarlılığında spesifik etkiye sahiptir ve sodyumla birlikte hücrelerin asit-baz dengesini gerçekleştirmektedir. Kabak çekirdeği özellikle, prostat büyümesinden kaynaklanan idrar zorluğuna karşı kullanılmaktadır. Kabak çekirdeği yapısında, vücut içerisinde testesteronun, kendisinin çok daha güçlü bir formu olan dehidrotestesteron hormonuna dönüşmesini engelleyen kimyasal bir maddeyi bulundurmaktadır. Bu bileşiğin miktarı türe ve çeşide bağı olarak % 0,5 ile % 2 arasında değişmektedir. Dehidretestesteron olmaksızın vücudun testesteron hücrelerini artırması zorlaşmakta, dolayısıyla prostat büyümesi bu sayede engellemiş olmaktadır. Kabak çekirdeğinde yüksek miktarda bulunan magnezyum, kas ve sinir fonksiyonlarının yürütülmesi, kemiklerin güçlendirilmesi, kalp ritminin düzeninin sağlanmasında önemli bir görev üstlenmektedir. Kemik ve dişlerin yapısında kalsiyum ve fosforla birlikte bulunur. Birçok enzimin çalışması için gerekli bir mineraldir. Kan basıncının düzenlenmesine yardımcıdır. Fitosteroller (Phytosteroller) , kolestrole çok benzeyen kimyasal yapıya sahip, bitkilerde bulunan bileşiklerdir.

Şekil 2.13.Bal kabağı çekirdeği (Cucurbita maxima ) içeriği

0 10 20 30 40 50 60

% değer kalori

çinko bakır triptofan mangan magnezyum

demir

Vitamin K

protein

0 10 20 30 40 50 60

% değer kalori

çinko bakır triptofan mangan magnezyum

demir

Vitamin K

protein

BÖLÜM 3. MATERYAL VE YÖNTEM

3.1. Kullanılan Materyal ve Maddeler

Bu çalışmada Sakarya bölgesinde yetişen iki farklı kabak çekirdeğinden (Cucurbita maxima ve Cucurbita moschata) elde edilen Katalaz enzimi (H2O2: H2O2

oxidoreductase E.C.1.11.1.6) kullanılmıştır.

3.1.1. Çalışmada kullanılan kimyasal maddeler

Çalışmalarımız boyunca hidrojen peroksit, amonyum sülfat, sodyum hidroksit, NaH2PO4, Na2HPO4, sitrik asit, hidroklorik asit, Tris – HCl, EDTA, sodyum azid, triton – X100, KCN, tiyoüre, PVP, diyaliz torbaları, sephadex kolonu, L - sistein, triptofan, L - tirozin, tiyoüre, sodyum azid, demir (III) klorür, potasyum siyanür, bakır sülfat, çinko sülfat, civa sülfat, kalsiyum klorür, lityum klorür, magnezyum klorür, kobalt, trizma baz, serum albümin, bradford çözeltisi, comessie blue, HCl, sodyum dedosil sülfat, TEMED, amonyum persülfat, 2 - merkaptoetanol, metanol, izopropil alkol, amonyum sülfat kullanılmıştır.

3.1.2. Kullanılan alet ve cihazlar

UV spektrofotometre (SHIMADZU UV - 2401Pe), soğutmalı santrifüj (nüfe NF 800R), derin dondurucu, pH metre (HANNA ınstrument pH 211) , otomatik pipetler (Mikrolit), hassas terazi (OHAUS analytıcal standart), Mağnetik karıştırıcı, Kronometre, Blender, Elektroforez cihazı (büyük boy elektroforez E-C 250 - 90 Apporation Comparation) .

3.1.3. Kullanılan tampon çözeltilerin hazırlanması

Araştırmada kullanılan tampon çözeltilerinin hazırlanmaları aşağıdaki gibi yapılmıştır.

3.1.3.1. 0,1 M sitrat tamponunun hazırlanması

0,1 M Sitrat tamponu, pH 4,2 ve 4,4’deki çözeltilerin hazırlanması için kullanılmıştır.

10,51 gram sitrik asit saf su ile 500 mL’ye tamamlanır (A çözeltisi). 14,705 gram sodyum sitrat saf su ile 500 mL’ya tamamlanır (B çözeltisi). A ve B çözeltileri Tablo.3.1’de belirtilen miktarlarda karıştırılarak saf su ile 100 mL’ye tamamlanmış ve istenilen pH’ta tampon çözeltiler elde edilmiştir.

Tablo.3.1. 0,1 M Sitrat tamponu hazırlanması

3.1.3.2 0,2 M fosfat tamponunun hazırlanması

pH’ları 5,7 - 7,2 arasındaki çözeltileri hazırlamak için kullanılmıştır. 24 gram (0,2 mol) NaH₂PO₄ saf suda çözülerek 1000 mL’ye tamamlanır (A çözeltisi) 28,4 gram (10,2 mol) Na₂HPO₄ suda çözülerek 1000 mL’ye tamamlanır (B çözeltisi) A ve B çözeltilerinin Tablo 3.2’de verilen miktarlarda karıştırılması ile istenilen pH’larda tampon çözeltiler hazırlanmıştır.

pH A (mL) B (mL)

4,2 35 15

4,4 28 22

Tablo.3.2. 0,2 M fosfat tamponunun hazırlanması

pH A (mL) B (mL)

5,7 467,5 6,5

6,4 367,5 132,5

6,7 282,5 217,5

7,0 195 305

7,2 140 360

3.1.3.3 0.05 M tris tamponunun hazırlanması

pH’ları 7,4 - 9,0 arasındaki çözeltileri hazırlamak için kullanılmıştır. 0,05 M Tris tamponu, Trizma-HCI ve Trizma-Baz’dan Tablo.3.3’de verilen miktarlarda alınıp saf su ile 1000 mL’ye tamamlanarak hazırlanmıştır.

Tablo.3.3. 0,05 M Tris tamponunun hazırlanması

pH A(g) B (g)

7,4 3,303 0,485

7,8 2,66 0,985

8,0 2,22 1,325

8,5 1,105 2,18

9,0 0,038 2,735

3.2. Katalaz Enzimi Đle Đlgili Yapılan Çalışmalar

3.2.1. Katalaz enzimi için homojenatın hazırlanması

Homojenat hazırlanmasında -20 °C'de dondurularak saklanan 5 gram bal kabağı çekirdeği (Cucurbita maxima) ve diğer kabak çekirdeği (Cucurbitta moschata) % 0,5 PVP içeren 50 mM'lık, pH'sı 7,0 olan 25 mL fosfat tamponunda blender da öğütülerek homojenize edilmiştir. Homojenat çift kat süzgeç kağıdından süzülmüştür. Soğutmalı santrifüjde 14.000 rpm’de 20 dakika boyunca santrifüj edilmiş ve süpernatant çökelekten ayrılmıştır. Elde edilen süpernatant kullanılıncaya kadar 4 °C'de muhafaza edilmiştir.

3.2.2. Katalaz enziminin aktivite tayini

Katalaz enziminin aktivite tayininde spektrofotometrik metot kullanılmıştır. Havir ve McHale'nin (1987), Lück'e (1963) dayandırdığı prosedüre göre yapılmıştır.

Absorbans ölçümleri 240 nm'de gerçekleştirilmiştir. Kullanılan metodun esası;

aktivite ölçüm ortamında bulunan katalazın, ortamda bulunan hidrojen peroksit ile etkileşimi sonucu meydana gelen absorbans azalmasının 240 nm'de izlenmesine dayanmaktadır. Aktivite ölçümü için 40-35-30-27-25-22-20-17-15-12-10-7-5 ve 2,5 mM lık hidrojen peroksit miktarları hesaplanmış ve aktivite ölçümü için UV- Vis spektrofotometre cihazı ve 3 mL’lik kuartz küvetler kullanılmıştır. 3 mL’lik kuartz küvete 1,475 mL fosfat tamponu (pH 7,0) ve 1,5 mL substrat 40 mM'lık H2O2

çözeltisi ilave edildikten sonra inkübasyon ortamına 50 µL enzim homojenatı ilave edilmiştir. Küvet içindeki numune karıştırılmış ve fosfat tamponu (pH 7,0) ve substrat ihtiva eden köre karşı 240 nm’deki absorbans ölçümleri yapılmıştır.

Ortamdaki H₂O₂’nin H₂O ve O₂’ye dönüşümünü sağlarken meydana gelen azalma enzimin aktivitesini göstermektedir. 180 saniye boyunca 240 nm'de meydana gelen absorbans azalışı köre karşı kaydedilmiş, aynı işlemler 2,5-40 mM’lık hidrojen peroksit içerecek şekilde hazırlanan küvetler için de yapılmıştır. Ölçümlerde lineer olarak absorbans azalması olan aralıktan, dakika başına absorbans azalması hesaplanmıştır. Ayrıca elde edilen sonuçların grafiklerinin eğimleri hesaplanarak çizilen [S] - V grafiğinden 1/[S] - 1/V grafiğine geçilerek K_m ve V_max değerleri hesaplanmıştır.

Sonuçlar EÜ/mL olarak verilmiştir. Aktivite ölçüm yöntemi, bütün kinetik

çalışmalarda benzer şekilde yapılmıştır. Ölçümlerde lineer absorbans azalması olan aralıktan, dakika başına absorbans azalması hesaplanmıştır. Işık yolu (b): 10 mm , ekstinksiyon katsayısı: 0,0394 mmol^-1 x mm^-2 alınarak A= ε. b.c formülünden 240 nm’de 180 saniyede hidrojen peroksitin harcanmasını sağlayan enzim miktarı belirlenmiş, formül pratik olarak; EÜ = (180 x A / 0,0394 x enzim miktarı ) şeklinde düzenlenmiştir.

k1 k3

E+S ES E + Ü (3.1) k2

Enzim, substratı ürüne dönüştürürken önce onunla bir enzim-substrat kompleksi oluşturur, daha sonra da bu kompleks ürün ve enzime dönüşür. Burada ES kompleksi, E ve S’dan k1 hızı ile oluşur; ES’nin ayrışması ise k2 hızındaki geri reaksiyonla tekrar substrat oluşumu şeklinde yürüyebilir. Ancak asıl reaksiyon k₃ reaksiyon hızı ile ilerleyen ürün oluşumu reaksiyonudur. Reaksiyon kararlı duruma ulaşınca (steady-state) ES’nin oluşması ayrışmasına eşit olur, yani sıcaklık aynı kaldığı sürece konsantrasyonda değişme olmaz.

Şekil 3.1. Reaksiyon hızı- [S] (Michaelis- Menten) grafiği V = Vmax

Vmax

Vmax 2

Km

[S]

V = Vmax Vmax

Vmax 2

Km

[S]

Enzim reaksiyonları ile ilgili ilk geniş kinetik çalışmalar 1913 yılında Michaelis- Menten tarafından yapılmıştır. Michaelis-Menten kinetiğine göre başlangıç enzim derişimi sabit alınıp reaksiyon hızının substrat derişimine bağlılığı incelenir. Sonuçta hiperbolik bir bir eğri elde edilir. Vmax, hiperbolün y eksenini kestiği noktadır ve maksimum hız olarak belirtilir. Maksimum hızın yarısına (Vmax/2) karşılık gelen substrat derişimi Km (Michaelis- Menten sabiti) olarak belirtilir. Vmax ve Km, bir enzimin aktivitesini belirleyen önemli sabitlerdir. Michaelis-Menten grafiği 3 bölgeden oluşmaktadır. Birinci bölgede substrat konsantrasyonu düşüktür ([S] <<

Km) ve substrat derişimi arttıkça hız 1. dereceden enzim kinetiğine göre artmaktadır.

Đkinci bölgede ise substrat konsantrasyonu ve hız arasındaki reaksiyon karışık dereceden yürür. Üçüncü bölgede [S] >> Km’dir ve substrat konsantrasyonu artsa da artık hızda bir değişme olmaz, sıfırıncı dereceden bir enzim kinetiği gözlenir (V = Vmax) Michaelis-Menten grafiği ile bir hiperbol elde edildiğinden, uygulamalarda kolaylık sağlamak amacı ile bunun bir doğru denklemi haline getirilmesi gerekmektedir. Bu amaçla eksen ölçekleri uygun şekilde değiştirilerek, değişik yollardan doğru denklemine dönüştürülebilir.

Şekil 3.2. 1/V – 1/ [S] (Lineweaver-Burk grafiği) V

1 V

1

1 / [S]

1 /

1 V_max

1 Km

Eğim = K_m/ V_max V

1 V

1

1 / [S]

1 /

1 V_max

1 Km

Eğim = K_m/ V_max

3.2.3. Katalaz enzimi için amonyum sülfat çöktürmesi ve diyaliz

Protein moleküllerinin dışında onları çevreleyen ve çözünür halde kalmalarını sağlayan su molekülleri vardır. Yüksek su konsantrasyonlarında, proteini çevreleyen su molekülleri, tuzdaki Na⁺ ve Cl ^- iyonları tarafından çekilir ve bu sayede proteinler çöker. Her proteinin çökmesi için gerekli olan tuz konsantrasyonları farklıdır. Dolayısıyla farklı tuz konsantrasyonlarında farklı proteinler çöker.

Yaptığımız çalışmada kabak çekirdeklerinde bulunan katalaz enziminin homojenatları sırasıyla % 0-10, % 10-20, % 20-30, % 30-40, % 40-50, aralıklarında amonyum sülfat çöktürmeleri yapılmıştır. Çöktürme işlemleri için hazırlanan enzim homojenatları 14.000 rpm’de 20 dakika boyunca santrifüj edilmiştir. Her santrifüj sonrası amonyum çöktürmeleri yapılmıştır. Her defasında çökelekte ve süpematantta enzim aktivitesine bakılmış ve.

katalaz enziminin aktif olduğu aralıklar tespit edilmiştir. Tüm bu işlemler + 4 °C ‘de gerçekleştirilmiştir. Amonyum sülfat çöktürmesi sırasında homojenata katı (NH4)2 SO4 yavaş yavaş ilave edilmiş ve her defasında daha önce kalan (NH4)2 SO4’ün çözünmüş olmasına dikkat edilmiştir. Amonyum sülfatın homojenatta çözünme işlemi buz banyosunda manyetik karıştırıcı ile yapılmıştır. Çöktürme işlemleri sırasında kullanılan katı (NH4)2 SO4 miktarları şu formüle göre hesaplanmıştır.

M[(NH4)2SO4] = [1,77 x V x (S2-S1)] / [(3,54 - S2 ) M= katı amonyum sülfat miktarı (g)

V= çözeltinin hacmi (mL)

S1= 1’in kesri şeklinde mevcut amonyum sülfat doygunluğu S2= 1’in kesri şeklinde istenilen amonyum sülfat doygunluğu

Ham enzim ekstraktı hızlı bir şekilde süzgeç kağıdından süzüldükten sonra, süzüntü soğutmalı ultra santrifüjde 4 °C de 14.000 rpm de 25 dk süresince santrifüjlenmiştir. Elde edilen süpernatant, doygun amonyum sülfat çözeltisi kullanılarak % 30 doygunluğa getirilmiş ve 4 °C de 14.000 rpm de 25 dk süresince santrifüjlenmiştir. Santrifüjleme işleminden sonra çökelek uygun miktarda pH 7,0 tamponunda çözülerek diyaliz torbalarına doldurulmuştur. Biyolojik moleküllerin ayrımında kullanılan en eski yöntemlerden biri diyalizdir. Bu teknik seyreltik bir çözeltideki moleküllerin