Antalya Eğitim ve Araştırma Hastanesinde
Kronik Hepatit C Hastalarının
Genotip Dağılımının Araştırılması
Investigation of Hepatitis C Virus Genotype Distribution in
Patients with Chronic Hepatitis C Infections in
Antalya Training and Research Hospital, Turkey
Yeşim ÇEKİN1, Nilgün GÜR1, Ayhan Hilmi ÇEKİN2, İmre ALTUĞLU3, Rüçhan YAZAN SERTÖZ3 1 Antalya Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Bölümü, Antalya.
1 Antalya Training and Research Hospital, Department of Medical Microbiology, Antalya, Turkey. 2 Antalya Eğitim ve Araştırma Hastanesi, İç Hastalıkları Bölümü, Antalya.
2 Antalya Training and Research Hospital, Department of Internal Medicine, Antalya, Turkey. 3 Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İzmir.
3 Ege University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Izmir, Turkey.
ÖZET
Hepatit C virusu (HCV), yüksek kronikleşme oranı, ciddi karaciğer hastalıklarına neden olması, kesin bir tedavi ve etkin bir aşısının olmaması gibi nedenlerden dolayı tüm dünyada ciddi bir sağlık sorunudur. HCV genomu yüksek derecede değişkenlik göstermekte olup, filogenetik olarak HCV’nin en az altı majör genotipi ve birçok alt tipinin bulunduğu bilinmektedir. HCV genotip dağılımı coğrafi ve epidemiyolo-jik farklılık göstermektedir. Doz ve tedavi süresi farklı genotipler için değişken olabileceğinden, tedavi öncesinde genotiplerin belirlenmesi klinik açıdan önemlidir. Bu çalışmada, hastanemizde izlenen kronik hepatit C’li hastalarda HCV genotiplerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışmaya, Antalya Eğitim ve Araştırma Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuvarına, 01 Ocak 2011-30 Haziran 2013 tarihleri arasında, farklı servislerden gönderilen anti-HCV ve HCV-RNA pozitif toplam 148 kronik hepatit C’li hasta (67 kadın, 81 erkek; yaş ortalaması: 50.5 ± 10.8, yaş aralığı: 17-73 yıl) dahil edilmiştir. Hastaların epidemiyolojik verileri ve HCV genotip çalışmaları retrospektif olarak değerlendirilmiştir. Viral genotipler gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (Rt-PCR) yöntemiyle (Abbott Molecular Diagnostic, ABD) belirlenmiştir. Bu yöntemle her örnek, 6 genotip (Gt) ve alt tip 1a ve 1b için test edilmiştir. Hastaların 119 (%80.4)’unda Gt-1 saptanmış; bunların %15.9 (19/119)’u 1a, %75.6 (90/119)’sı 1b olarak tiplendirilmiştir. Gt-2, -3 ve -4 prevalans oranları sırasıyla %3.4 (n= 5), %11.5 (n= 17) ve %2 (n= 3) olarak bulunmuş; Gt-6’ya ise rastlanmamıştır. Rt-PCR yöntemiyle çalışılan hastaların 4 (%2.7)’ünde karışık tip tespit edilmiş; bu
Geliş Tarihi (Received): 06.11.2013 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 02.04.2014
örnekler RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ve dizi analizi yöntemiyle çalışıldığında üçü Gt-1, biri ise Gt-2 olarak tiplendirilmiştir. Çalışmamızda saptanan yüksek Gt-3 prevalansının (%11.5), yabancı uyruklu 13 hastanın yedisinde saptanan Gt-3 pozitifliğinden kaynaklanmış olabileceği düşünülmüştür. Bu çalışmada kullanılan Rt-PCR yöntemi, kullanıcıdan bağımsız, standart otomatize ve hızlı sonuç veren güvenilir bir yöntemdir; ancak karışık tip saptanan örneklerin başka bir yöntemle doğrulanması gerekmektedir. Sonuç olarak, hastanemizde izlenen kronik hepatit C’li hastalar arasında en yaygın genotipin Gt-1b olduğu, Gt-3’ün ise şimdiye kadar bildirilmiş en yüksek oran olduğu söylenebilir.
Anahtar sözcükler: Hepatit C virusu; genotip; kronik hepatit. ABSTRACT
Hepatitis C virus (HCV) infection is a major global health problem due to high chronicity rates, occur-rence of severe hepatic diseases, and absence of an accurate therapy and effective vaccine. It is well known that viral genome is highly variable and HCV has at least six genotypes, each of them containing a series of subtypes. HCV genotypes exhibit geographical and epidemiological distribution. Genotype identification is clinically important to decide the dosage and duration of treatment since different geno-types exhibit variable response to treatment. The aim of this study was to determine the HCV genogeno-types in chronic HCV patients who were followed-up in Antalya Research and Training Hospital, Turkey. Anti-HCV and Anti-HCV-RNA positive blood samples obtained from 148 chronic hepatitis C patients (67 female, 81 male; mean age: 50.5 ± 10.8, age range: 17-73 years) who were admitted to Antalya Research and Training Hospital Microbiology Laboratory during January 2011-June 2013, were included in the study. Epidemiological data of the patients and HCV genotype results were evaluated retrospectively. Viral genotypes were determined by real-time (Rt) PCR assay (Abbott Molecular Diagnostic, USA). HCV genotype (Gt)-1 was detected in 119 (80.4%) of the patients, of them 15.9% (19/119) were identified as subtype 1a and 75.6% (90/119) were subtype 1b. The prevalence rates of Gt-2, -3, and -4 were found as 3.4% (n= 5), 11.5% (n= 17), and 2% (n= 3), respectively. Gt-6 was not detected in our patients. Mixed infection with HCV types was detected in four patients (2.7%) by Rt-PCR; of these three were detected as Gt-1 and one was Gt-2 by RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) and sequenc-ing. The high prevalence of Gt-3 (11.5%) obtained in this study was attributed to the determination of Gt-3 in seven of 13 foreign national subjects. Rt-PCR method used in this study is user independent, standardized, automated, rapid and reliable method, however in case of detection of mixed types, the samples should be confirmed by other methods. In conclusion, we reported that the majority of the chronic hepatitis C infected patients had Gt-1b, and Gt-3 exhibited the highest rate ever reported by other studies from Turkey.
Key words: Hepatitis C virus; genotypes; chronic hepatitis.
GİRİŞ
çalışmada, kronik HCV enfeksiyonu olan hastaların HCV-RNA pozitif kan örneklerinde HCV genotiplerinin belirlenmesi amaçlanmıştır.
GEREÇ ve YÖNTEM
Çalışmaya, Antalya Eğitim ve Araştırma Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuvarına 01 Ocak 2011-30 Haziran 2013 tarihleri arasında, farklı servislerden gönderilen, anti-HCV ve HCV-RNA pozitif saptanan 148 kronik hepatit C’li hasta dahil edildi. Hastaların epidemiyolojik verileri ve HCV genotip çalışmaları retrospektif olarak değerlendirildi. Çalışmayla ilgili etik kurul onayı (Karar no: 2014-047) ve kan verme işlemi sırasında hasta onamı alındı.
HCV genotiplendirmesi, gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (Rt-PCR) ile yapıldı. Her örnek için 500 μl serum kullanılarak, otomatize Abbott m2000sp (Abbott Molecular Diagnostic, ABD) cihazı ile ekstraksiyon uygulandı. Gerek ekstraksiyon gerekse PCR sırasında RNA’nın stabilitesini kontrol etmek amacıyla internal kontroller eklendi. Elde edilen RNA örnekleri, “master mix” A, B ve C ile üç farklı test kuyucuğunda karıştırıldı, her örnek için üç PCR reaksiyonu yürütüldü. RNA’dan cDNA eldesi, amplifikasyon ve genotiplendirme, Rt-PCR yöntemiyle Abbott m2000r (Abbott Molecular Diagnostic, ABD) sisteminde firma önerileri doğrultusunda çalışıldı. NS5B ve 5’UTR bölgeleri (alt tip 1a ve 1b) ve internal kontrol için dört primer grubu kullanıldı. Amplifikasyon ürünleri gerçek zamanlı Minor Groove Binder (MGB) prob kullanılarak tespit edildi. Her örnek, 6 genotip ve alt tip 1a ve 1b için test edildi. Bu yöntemle birden çok genotip saptanan örnekler, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) yöntemi ve dizi analizi ile tekrar çalışıldı. PCR pozitif örnekler, RFLP yöntemi ile BsuR1-Rsa1 ve Mva1-Hinf1 (Fermentas, Kanada) enzimleri kullanılarak analiz edildi8. Ters transkripsiyon (RT Thermo cDNA Fermentas, Kanada) ile cDNA elde edildikten sonra 5’UTR bölgesine yönelik nt 45-60/nt 321-349 dış primerleri ve nt 286-313 ile nt 63-82 iç primerleri kullanılarak “nested” PCR uygulandı. İki ürün DNA alikotu, Bsu R1-Rsa1 ve Mva1-Hinf1 enzim çift-leri ile daha önce tarif edildiği gibi işlem gördü8 . Elde edilen DNA fragmanları agaroz jelde yürütüldü ve 5’UTR’nin farklı kesilme paternleri McOmish ve arkadaşlarının9 tarif ettiği skalaya göre değerlendirildi. Dizi analizi daha önce tarif edildiği gibi10 Big Dye Terminator DNA Sequencing Kiti (Applied Biosystems, ABD) kullanılarak ABI Prism 3500 Genetic Analyzer (Perkin Elmer, USA) cihazında gerçekleştirildi. Genotipleri temsil eden diziler, Avrupa HCV veri tabanından elde edildi ve diziler Cluster W yöntemiyle değer-lendirildi10,11.
İstatistiksel analizler SPSS 13 (Chicago, ABD) programında gerçekleştirildi.
BULGULAR
Çalışmaya alınan 148 örneğin 67 (%45.3)’si kadın, 81 (%54.7)’i erkek hastalara ait olup, hastaların yaş ortalaması 50.5 ± 10.8 yıl (aralık: 17-73) olarak belirlenmiştir. Hastaların 13’ü yabancı uyruklu olgulardır.
yönte-miyle 4 (%2.7) örnekte birden çok genotip (Gt-1b + Gt-2) saptanmış; bu örnekler RFLP ve dizi analizi yöntemiyle çalışıldığında 3’ü Gt-1, biri ise Gt-2 olarak tanımlanmıştır. Çalışmamızda elde edilen genotip dağılımları Tablo I’de gösterilmiştir.
TARTIŞMA
HCV genotip (Gt) tayini, kronik hepatit C’li hastalarda tedavinin seçimi, tedavi süresi ve tedaviye yanıtın takibinde önemli yer tutmaktadır. HCV Gt-1 ve -4 ile enfekte olgu-larda interferon tedavisine yanıt, Gt-2 ve -3’ten daha düşük ve tedavi süresi daha uzun-dur2,3. Aynı zamanda Gt-1b olgularında hepatoselüler karsinoma gelişme riskinin daha yüksek olduğu bildirilmiştir12. Bu nedenle HCV genotiplerinin belirlenmesi, tedavinin şekillenmesinin yanında hastaların prognozları konusunda da bilgi sağlamaktadır.
Sunulan bu çalışmada, Antalya ilinde bir üçüncü basamak hastanede HCV genotip dağılımları değerlendirilmiş; HCV Gt-1b prevalansı %60.8 (90/148) olarak tespit edil-miştir. Türkiye’de yapılan benzer çalışmalarda HCV Gt-1b en yaygın genotip olarak karşımıza çıkmaktadır6,7,13-23 (Tablo II). Tüm dünyada kronik HCV’li hastalar içinde Gt-1, %40-80 arasında değişen oranlar ile en sık görülen tiptir. Ancak yıllar içinde bölgelerdeki genotip dağılımlarının değiştiği de bildirilmektedir. Noorali ve arkadaşlarının4 çalışma-sında, farklı HCV genotiplerinin dünyada değişik coğrafi bölgelere seyahat yoluyla yayı-labileceği bildirilmiştir.
Ülkemizde 1995 yılından itibaren değişik bölgelerden bildirilen HCV genotip verileri değerlendirildiğinde son yıllarda 1b dışındaki genotiplerin giderek yaygınlaştığı görülmek-tedir (Tablo II). Ancak bu verileri, çalışmaların farklı sayıda hasta grubunda ve farklı yön-temlerle gerçekleştirilmiş olması nedeniyle karşılaştırmak mümkün değildir. Çalışmamızda saptadığımız %11.5 oranında (n= 17) Gt-3 şimdiye kadar ülkemizden bildirilen en yüksek orandır. Gt-3, ulaşabildiğimiz kadarıyla 2007 yılına kadar ülkemizden hiç bildirilmemiştir (Tablo II). Küçüköztaş ve arkadaşlarının17 çalışmasında, HCV Gt-3 %9.5 ile şimdiye kadar bildirilen en yüksek orandır. Antalya ili Akdeniz bölgesinde, gelir kaynaklarının başında turizm gelen ve son yıllarda Türk Cumhuriyetleri ve Rusya’dan göç alan bir il olma özel-liğindedir. Bu nedenle HCV genotip dağılımında ülkemizin diğer illerinden farklılık gös-termesi beklenebilir. Çalışmamızda, yabancı uyruklu 13 hastamızın 7 (%53.8)’sinde Gt-3 bulunmuş olup, bu durumun saptanan yüksek Gt-3 oranını açıklayabileceği düşünülmüş-tür (Tablo I). Yabancı uyruklu hastaları dışarıda bıraktığımız koşulda, Gt-3 %7.4 (n= 10)
Tablo I. HCV Genotip ve Alt Tiplerinin Dağılımı Genotip 1
Uyruk 1 1a 1b Genotip 2 Genotip 3 Genotip 4 Hasta sayısı
Yerli, n (%) 13 (9.6) 19 (14.1) 85 (63) 5 (3.7) 10 (7.4) 3 (2.2) 135
Yabancı, n (%) - - 5 (38.5) 1 (7.7) 7 (53.8) - 13
Tablo II. Ülkemizde Değişik Bölgelerde Yapılan HCV Genotiplendirme Çalışmaları Genotipler Bölge Yıl Örnek sayısı Yöntem 1 1a 1b 2 2a 3 3a 4 4a Diğer Araştırıcı Mersin 2013 236 LiP A 3.8 1.7 84.7 2.1 -4.2 -0.8 0.4 a, 2.1 b Tezcan ve ark. 25 Kayseri 2012 375 RT 2.4 2.4 57.6 3.2 -1.1 -32 -1.3 b Kayman ve ark. 24 Gaziantep 2011 51 DA -9.8 78.4 -7.8 -2.0 -Karslıgil ve ark. 23 Zonguldak 2010 39 LiP A -2.6 97.4 -Aktaş ve ark. 22 Afyon 2010 30 DA 20 63.3 13.3 3.3 c Kalaycı ve ark. 21 Sivas 2010 178 LiP A -9.0 88.2 -1.1 1.7 -Çelik ve ark. 20 Istanbul 2010 52 LiP A 1.9 76.9 3.8 9.6 1.9 Küçüköztaş ve ark 19 Manisa 2009 100 DA -2.0 90 -2.0 -5 -Şanlıdağ ve ark. 18 Diyarbakır 2009 74 LiP A 4.1 87.8 2.7 2.7 2.7 Özbek ve ark. 17 GD Anadolu 2007 30 DA -22.7 72.8 -4.5 -Çil ve ark. 16 Konya 2007 80 DA -100 -Ural ve ark. 15 İzmir 2008 345 RFLP/DA -10 87 0.9 -1.4 -0.6 -Altuğlu ve ark. 10 İç Anadolu 2004 365 RFLP -11 84 3 -1.0 -1 -Bozdayı ve ark. 7 İzmir 1995 89 RFLP 19.1 75.3 3.4 2.2 Abacıoğlu ve ark. 6 GD: Güneydoğu; LiP
A: Line probe assay; RT
: Real-time; DA: Dizi analizi; RFLP: Restriction fragment lengt
oranına gerilemektedir. Antalya ilinden bildirilmiş önceki yıllara ait genotip sonucu olma-ması nedeniyle kesin bir sonuca varmak mümkün olmamakla birlikte, diğer bölgelerle karşılaştırıldığında bölgemizde Gt-3’ün yaygınlaşmakta olduğu söylenebilir. HCV Gt-3’ün tedaviye yanıtı Gt-1’e göre iyi olmasına rağmen, karaciğer yağlanmasıyla ilişkili olması ve kronik hastalık durumunda karaciğer fibrozunu hızlandırması nedeniyle klinik öneme sahiptir ve erken tedaviye başlanması prognostik önem taşımaktadır24.
HCV genotiplendirmesinde kullanılan çeşitli yöntemler mevcuttur. Altın standart olarak kabul edilen yöntem, genomun E1 ya da NS5b ve 5´-UTR bölgelerinin dizi analizidir2,25.Sunulan bu çalışmada, PCR temelli otomatize bir yöntem kullanılmıştır. Otomatize olması ve kısa sürede sonuç vermesi gibi avantajları bulunan bu yöntemin; yapılan karşılaştırmalı çalışmalarda, 5’UTR ve kor bölgesinin ters hibridizasyonu ve RFLP yöntemleriyle uyum gösterdiği bildirilmiştir26,27.Kullanılan Rt-PCR yönteminin kullanıcı-dan bağımsız, standart ve otomatik olması, hızlı sonuç vermesi gibi avantajlarının olma-sına rağmen, bizim çalışmamızda dört örnekte Gt-1b ve Gt-2’yi ayıramamıştır. Sonuç olarak, hastanemizde izlenen kronik hepatit C’li hastalar arasında en yaygın genotipin Gt-1b olduğu, Gt-3’ün ise şimdiye kadar bildirilmiş en yüksek oran olduğu söylenebilir.
KAYNAKLAR
1. Aman W, Mousa S, Shiha G, Mousa SA. Current status and future directions in the management of chronic hepatitis C. Virol J 2012; 9: 57.
2. Zein NN. Clinical significance of hepatitis C virus genotypes. Clin Microbiol Rev 2000; 13(2): 223-35. 3. Lee CM, Hung CH, Lu SN, Changchien CS. Hepatitis C virus genotypes: clinical relevance and therapeutic
implications. Chang Gung Med J 2008; 31(1): 16-25.
4. Noorali S, Pace DG, Bagasra O. Of lives and livers: emerging responses to the hepatitis C virus. J Infect Dev Ctries 2011; 5(1): 1-17.
5. Pol S, Vallet-Pichard A, Corouge M, Mallet VO. Hepatitis C: epidemiology, diagnosis, natural history and therapy. Contrib Nephrol 2012; 176(1): 1-9.
6. Abacioglu YH, Davidson F, Tuncer S, et al. The distribution of hepatitis C virus genotypes in Turkish patients. J Viral Hepat 1995; 2(6): 297-301.
7. Bozdayi AM, Aslan N, Bozdayi G, et al. Molecular epidemiology of hepatitis B, C and D viruses in Turkish patients. Arch Virol 2004; 149(11): 2115-29.
8. McOmish F, Chan SW, Dow BC, et al. Detection of three types of hepatitis C virus in blood donors: investiga-tion of type-specific differences in serological reactivity and rate of alanine aminotransferase abnormalities. Transfusion 1993; 33(1): 7-13.
9. McOmish F, Yap P, Dow BC, et al. Geographical distribution of hepatitis C virus genotypes in blood donors: an international collaborative survey. J Clin Microbiol 1994; 32(4): 884-92.
10. Altuglu I , Soyler I, Ozacar T, Erensoy S. Distribution of hepatitis C virus genotypes in patients with chronic hepatitis C infection in Western Turkey. Int J Infect Dis 2008; 12(3): 239-44.
11. Combet C, Garnier N, Charavay C, et al. euHCVdb: the European hepatitis C virus database. Nucleic Acids Res 2007; 35(Database issue): D363-6.
13. Ural O, Arslan U, Findik D. Konya bölgesinde hepatit C virusu genotip dağılımı. Turkish J Infect 2007; 21(4): 175-81.
14. Çil T, Özekinci T, Göral V, Altıntaş A. Güneydoğu Anadolu Bölgesi’nde hepatit C virusu genotipleri. Turkiye Klinikleri J Med Sci 2007; 27(4): 496-500.
15. Ozbek E, Ozekinci T, Mese S, Atmaca S. Hepatitis C virus genotypes are changing in the Southeast of Turkey. Biotechnol Biotechnol Eq 2009; 23(4): 1521-3.
16. Şanlıdağ T, Akcali S, Ozbakkaloğlu B, Ertekin D, Akduman E. Distribution of hepatitis C virus genotypes in Manisa region, Turkey. Mikrobiyol Bul 2009; 43(4): 613-8.
17. Küçüköztaş MF, Ozgünes N, Yazici S. Investigation of the relationship between hepatitis C virus (HCV) genotypes with HCV-RNA and alanine aminotransferase levels in chronic hepatitis C patients. Mikrobiyol Bul 2010; 44(1): 111-5.
18. Çelik C, Bakıcı MZ, Kaygusuz R, Ertürk R. Sivas yöresindeki HCV genotip dağılımlarının araştırılması. Viral Hepatit Derg 2010; 16(3): 106-10.
19. Kalayci R, Altindiş M, Gülamber G, Demirtürk N, Akcan Y, Demirdal T. Genotype distribution of chronic hep-atitis B and hephep-atitis C patients and investigation of the resistance patterns in hephep-atitis B cases. Mikrobiyol Bul 2010; 44(2): 237-43.
20. Aktaş E, Ogedey ED, Külah C, Beğendik Cömert F. Hepatitis C virus genotypes in a province of Western Black-Sea region, Turkey. Mikrobiyol Bul 2010; 44(4):647-50.
21. Karslıgil T, Savaş E, Savaş MC. Genotype distribution and 5’ UTR nucleotide changes in hepatitis C virus. Balkan Med J 2011; 28(3): 232-6.
22. Kayman T, Karakükçü C, Karaman A, Gözütok F. Kayseri bölgesinde hepatit C virus enfeksiyonunun genotip dağılımı. Türk Mikrobiyol Cem Derg 2012; 42(1): 21-6.
23. Tezcan S, Ulger M, Aslan G, et al. Determination of hepatitis C virus genotype distribution in Mersin prov-ince, Turkey. Mikrobiyol Bul 2013; 47(2): 332-8.
24. Rubbia-Branth L, Quadri R, Abid K, et al. Hepatocyte steatosis is a cytopathic effect of hepatitis C virus gen-otype 3. J Hepatol 2000; 33(1): 106-15.
25. Özen Karataylı SC, Bozdayı MA. Hepatit C virüsü virolojisi, genotipleri ve subtipleri tanısı. Turkiye Klinikleri J Gastroenterohepatol-Special Topics 2010; 3(1): 70-6.
26. Ciotti M, Marcuccilli F, Guenci T, et al. A multicenter evaluation of the Abbott RealTime HCV Genotype II assay. J Virol Methods 2010; 167(2): 205-7.
