‹skemik önkoflullama, tek veya tekrarlayan k›sa sü-reli iskemi periyotlar›n›n, daha sonraki uzun süsü-reli is-kemi s›ras›nda, hücreyi infarkt ve nekroz oluflumuna karfl› koruyan adaptif bir mekanizmad›r.[1]
‹skemik ön-koflullaman›n bafll›ca etkileri, infarkt ölçüsünün azal-t›lmas›, endotelyal fonksiyonun korunmas› ve
miyo-kardiyumdaki inflamatuvar yan›t›n hafifletilmesi ola-rak say›labilir.[2]
‹skemik önkoflullaman›n farkl› hay-van türlerinde infarkt boyutunu azaltt›¤› kapsaml› fle-kilde gösterilmifl olmas›na ra¤men, programlanm›fl hücre ölümü (apoptosis) üzerindeki etkisi hakk›nda bi-linen azd›r.[3]
Background: One of the approaches developed to prevent or reduce ischemic cell damage is ischemic precondition-ing. In this rat model, we investigated the effect of ischemic preconditioning on myocardial apoptosis. Methods: Thirty male Wistar rats were used. Following a left thoracotomy, the heart was exposed and isolated in all the rats. Ten control rats remained untreated. In 10 rats (ischemia group), the left main coronary artery was occluded for 30 min and reperfused for 120 min. The remaining 10 rats (preconditioning group) underwent 5 min of occlusion and 5 min of reperfusion before 30 min occlusion and 120 min reperfusion. At the end of the experiments, the hearts were removed and assayed for immunohistochemical staining for bcl-2 expression. Results: By immunohistochemical staining for bcl-2, the percentage of apoptotic cells was found as 40±4.27% in the preconditioning group, 65±4.11% in the ischemia group without preconditioning, and 2±0.66% in the con-trol group. Compared to the ischemia group, the number of apoptotic cells was significantly lower in the precondi-tioning group (p<0.001). The lowest number of apoptotic cells was found in the control group (p<0.001).
Conclusion: Our results show that ischemic precondition-ing reduces myocardial apoptosis.
Key words: Apoptosis; ischemic preconditioning, myocardial; myocardial reperfusion injury; rats.
S›çan iskemi-reperfüzyon modelinde iskemik önkoflullaman›n
miyokardiyal apoptoza etkisi
The effect of ischemic preconditioning on myocardial apoptosis: a rat ischemia-reperfusion model
Gaziantep Üniversitesi T›p Fakültesi, 1
Kalp ve Damar Cerrahisi Anabilim Dal›, 2
Fizyoloji Anabilim Dal›,
3
Patoloji Anabilim Dal›, Gaziantep
Amaç: ‹skemik hücresel hasarlanmay› önlemek veya azaltmak için gelifltirilen yaklafl›mlardan biri iskemik ön-koflullamad›r. Bu s›çan modelinde iskemik önkoflullama-n›n miyokardiyal apoptoz üzerine etkisi araflt›r›ld›. Çal›flma plan›: Çal›flmada 30 adet Wistar cinsi erkek s›çan kullan›ld›. S›çanlara sol torakotomi yap›ld›ktan sonra kalp serbestlefltirildi. Kontrol grubundaki 10 s›çana ek bir ifllem uygulanmad›. ‹skemi grubundaki 10 s›çana sol ana koro-ner arterde 30 dakika oklüzyon (iskemi), arkas›ndan 120 dakika reperfüzyon uyguland›. Önkoflullama grubundaki 10 s›çana ise bu ifllemler öncesinde 5 dakika iskemi, 5 da-kika reperfüzyon uyguland›. Deneyler sonras›nda kalpler ç›kar›larak, haz›rlanan kesitlerde bcl-2 immünhistokimya-sal boyama yöntemiyle bcl-2 indeksi belirlendi.
Bulgular: bcl-2 immünhistokimyasal boyama yöntemiyle, infarkt alan›ndaki apoptotik hücre oran› iskemik önkoflul-lama yap›lan grupta %40±4.27, önkoflulönkoflul-lama olmaks›z›n sadece iskemi ve reperfüzyon yap›lan grupta %65±4.11, kontrol grubunda %2±0.66 bulundu. Önkoflullama yap›lan grupta, yap›lmayan gruba göre apoptotik hücre say›s› an-laml› derecede azd› (p<0.001). En az say›da apoptotik hüc-re kontrol grubunda saptand› (p<0.001).
Sonuç: Bulgular›m›z iskemik önkoflullaman›n miyokardi-yal apoptoz oluflumunu azaltt›¤›n› göstermektedir.
Anahtar sözcükler: Programlanm›fl hücre ölümü; iskemik önkoflul-lama, miyokardiyal; miyokard reperfüzyon hasar›; s›çan.
Gelifl tarihi: 13 Kas›m 2006 Kabul tarihi: 9 Aral›k 2006
Yaz›flma adresi: Dr. Mehmet Adnan Celkan. Gaziantep Üniversitesi T›p Fakültesi, Kalp ve Damar Cerrahisi Anabilim Dal›, 27070 Gaziantep. Tel: 0342 - 360 25 13 e-posta: celkan@superonline.com
‹skemik önkoflullama yoluyla apoptozun azalt›lma-s›nda yer alan olas› mekanizmalar›n anlafl›lmas›, miyo-sit kayb›n›n en aza indirilmesine ve bu flekilde hem nek-rotik hem de apoptotik dokulardan oluflabilen toplam infarkt boyutunun düflürülmesine yard›mc› olabilir.[4] Bu çal›flmada, 30 dakikal›k koroner oklüzyondan sonra, 120 dakikal›k reperfüzyona maruz kalm›fl s›çanlarda, 5 dakika iskemi, 5 dakika reperfüzyon fleklindeki iskemik önkoflullaman›n, miyokardiyal apoptotik hücre ölümü-nü nas›l etkiledi¤i araflt›r›ld›.
GEREÇ VE YÖNTEM
Çal›flmada, a¤›rl›klar› 260-360 gr aras›nda de¤iflen, 30 adet Wistar cinsi erkek s›çan kullan›ld›. S›çanlar T›p Fakültesi Deney Hayvanlar› Ünitesi’nden sa¤land› ve 20-22 °C oda s›cakl›¤›nda, 12 saat ayd›nl›k-12 saat ka-ranl›k ortamda bak›ld›, standart özel s›çan yemi ve mus-luk suyu ile beslendi. Çal›flma için Gaziantep Üniversite-si etik kurul onay› al›nd› ve çal›flman›n tüm aflamalar›n-da “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals” (NIH Publication 86-23, 1985) kurallar›na uyuldu.
Deneye haz›rl›k. Sodyum pentotal (50 mg/kg) ile intraperitoneal anestezi verilen s›çanlarda, önce tra-keotomi yap›ld› ve trakea yapay solunum için kanüle edildi. Hemen arkas›ndan ventilasyon cihaz›yla (SAR-830 Ventilator) 1.5 ml/100 gr hacimde ve 60 atm/dk h›zda oda havas› verildi (fiekil 1). Arteriyel kan bas›nc› ölçümü için sol karotis arter kanüle edile-rek transdüser ile kan bas›nc› kaydedildi. Kanül, he-parin içeren serum fizyolojik ile dolduruldu. Gö¤sün sol taraf›na, sternumun 2 mm solundan, dördüncü in-terkostal aral›ktan sol torakotomi yap›ld›. Perikard s›yr›l›p kalp serbestlefltirildi. Gö¤sün sa¤ taraf› des-teklenip kalp d›flar› al›nd› ve 10 mm yuvarlak i¤neli 6/0 ipek dikifl sol ana koroner arterin alt›ndan miyo-kard dokusunu hafifçe geçecek flekilde geçirildi. Bu ifllemin ard›ndan kalp gö¤üs kafesine tekrar yerleflti-rildi. Koroner oklüzyonu sa¤lamak için kalbe konul-mufl dikifl ipli¤i 1 mm çap ve 1 cm boyunda plastik tüp içinden geçirildi. Bu iplik klemple s›k›flt›r›larak iskemi, gevfletilerek reperfüzyon uyguland›. Kalbin yeni duruma uyumu için 20 dakika beklendi.
Lambeth Conventions’da belirlenen de¤erlendirme ölçütleri[5]
göz önüne al›narak, bu ifllemlere ba¤l› herhan-gi bir aritmi görülmesi ya da ortalama kan bas›nc›n›n ok-lüzyon öncesinde 70 mmHg’nin alt›na düflmesi halinde denek çal›flma d›fl› b›rak›ld›. Stabilizasyon sa¤land›ktan sonra damar oklüde edilerek iskemi sa¤land›.
Koroner oklüzyon, reperfüzyon öncesi ve sonras›n-da elektrokardiyografi (EKG) ve kan bas›nc› dijital ka-y›t sisteminde (Power Lab., ADI Instruments, Avustral-ya) kaydedildi. S›çanlar›n vücut ›s›lar› deney boyunca takip edilerek 37 °C rektal vücut ›s›s› korundu.
Deney protokolü. Çal›flma üç grupta planland›. Grup 1’de (kontrol grubu, n=10), sadece gö¤üs bofl-lu¤u aç›l›p, baflka hiçbir ifllem yap›lmadan kalp tekrar yerine konuldu. Deney süresi (iskemi kontrol grubuna göre 170 dakika) boyunca kan bas›nc› ve EKG kay›tla-r› al›nd›. Grup 2’de (önkoflullama-preconditioning gru-bu, n=10), stabilizasyon dönemini takiben kalp 5 ka iskemi ve 5 dakika reperfüzyon, sonras›nda 30 daki-ka iskemi ve ard›ndan da 120 dakidaki-ka reperfüzyonda tu-tuldu. Grup 3’te ise (iskemi kontrol grubu, n=10) stabi-lizasyon dönemini takiben 30 dakika iskemi ve 120 da-kika reperfüzyon uyguland›.
Yüz yirmi dakikal›k reperfüzyon sürelerinin sonun-da tüm gruplara ait s›çanlarsonun-dan al›nan intrakardiyak kan, heparinli tüplerde 5 dakika 3000 devirde santrifüj edilip serumlar› ayr›ld› ve eksi 70 °C’de dondurucuda muhafaza edildi. Bu ifllemden sonra ç›kar›lan kalpler %10’luk formaldehit çözeltisindeki tüplere kondu.
Doku haz›rlanmas›. Kalpler %10 formalin solüsyo-nunda 24 saat fikse edildi. Ç›plak gözle soluk alanlar fleklinde gözlenen miyokardiyal iskemik sahalardan 6-7 mm kal›nl›¤›nda kesitler al›nd›. Kesitler otomatik takip makinesine al›narak alkol, ksilol ve parafin içerisinden geçirildi. Daha sonra kesitler parafin blok içerisine gö-müldü. Parafin bloktan mikrotomla (Leica RM 2145) 5 mikron kal›nl›¤›nda kesitler al›narak hematoksilen ve eozin ile boyand›.
Boyas›z kesitler ve deparafinizasyon: ‹lk olarak hema-toksilen-eozin boyal› preparatlar incelenerek uygun blok seçimi yap›ld› ve mikrotomla 4 mikron kal›nl›¤›nda boya-s›z kesit elde edildi. Tüm boyaboya-s›z kesitler “polysine” kap-l› adezivli lamlara akap-l›nd›ktan sonra 65 °C’de 15 dakika etüvde bekletilerek dokular›n lamlara yap›flmas› sa¤land›. Daha sonra lamlar ksilolde yaklafl›k 10 dakika bekletile-rek deparafinizasyon ifllemi gerçeklefltirildi.
‹mmünhistokimyasal boyama: Primer antikor olarak bcl-2, Ab-1 (Cat: MS-123-P; Neomarker, Fremont, CA, ABD), boyama kiti olarak LSAB-2 HRP (Dako, Japon-ya), kromojen olarak DAB kullan›ld›.
Skorlama: bcl-2 skorlamas›nda nükleer boyanma esas al›nd›. Nükleer boyanma olmaks›z›n nonspesifik sitoplazmik boyanma negatif olarak de¤erlendirildi. Ifl›k mikroskobu ile 400 büyütme alt›nda her olgu için boyanman›n en yo¤un oldu¤u üç ayr› saha seçildi ve pozitif hücrelerin total hücrelere oran› yüzde (%) olarak ifade edilerek bcl-2 indeksi belirlendi.
‹statistiksel analiz. ‹statistiksel analiz için SPSS Windows 10.0 program› kullan›ld›. Gruplardaki ortala-malar aras›ndaki fark›n karfl›laflt›r›lmas›nda tek yönlü varyans analizi kullan›ld›. Gruplar›n birbirleriyle olan anlaml›l›klar›nda ise Tukey testi kullan›ld›. P<0.05 olan de¤erler anlaml› kabul edildi.
BULGULAR
bcl-2 immünhistokimyasal boyama yöntemiyle, in-farkt alan›ndaki apoptotik hücre oran› iskemik önko-flullama yap›lan grup 2’de %40±4.27 (fiekil 2a), ön-koflullama yap›lmayan, yani sadece iskemi ve reper-füzyon yap›lan grup 3’te %65±4.11 (fiekil 2b), kont-rol grubunda %2±0.66 bulundu (fiekil 2c). Önkoflul-lama yap›lan grupta, yap›lmayan gruba göre apopto-tik hücre aç›s›ndan anlaml› bir azalma oldu¤u görül-dü (p<0.001). Kontrol grubu ile di¤er iki grup aras›n-da aras›n-da apoptotik hücre aç›s›naras›n-dan anlaml› farkl›l›k var-d› (p<0.001).
TARTIfiMA
Miyokard›n iskemik önkoflullamas› ilk kez 1986 y›-l›nda Murry ve ark.[6]
taraf›ndan tan›mlanm›flt›r. Bu ça-l›flmada 40 dakikal›k koroner oklüzyon öncesinde, her biri befler dakikal›k reperfüzyonlarla ayr›lm›fl koroner iskemik periyotlar›n nekroz geliflimini %75 oran›nda azaltt›¤› gösterilmifltir.
Önkoflullama, nekrozun geliflmesi için gerekli süreyi uzatarak reperfüzyon ile daha fazla miyokard›n kurtar›l-mas›n› sa¤lar. Önkoflullaman›n fizyolojik temellerini oluflturan mekanizmalar, adenozin sal›n›m›,[7]
KATP ka-nallar›n›n aç›lmas›[8]
ve protein kinaz-C aktivasyonu[8] olarak belirlenmifltir. Adenozin, adenozin A1 ve A3 re-septörleri üzerinden kompleks bir sinyal zinciri ile önko-flullamay› bafllat›rken, pek çok substrat proteinini fosfo-rilleyerek aktifleyebilen protein kinaz-C’nin etki meka-nizmas› ise tam olarak bilinmemektedir. KATP kanal aç›-c›lar› ve protein kinaz-C aktivatörleri kullan›larak da far-makolojik mekanizmalar taklit edilmeye çal›fl›lm›flt›r.[9] Bu koruyucu mekanizman›n, miyokardiyal nekroz oluflu-munu s›n›rlamadaki etkinli¤i yan›nda, apoptozda da inhi-bisyon sa¤lad›¤› bilinmektedir.[4]
‹skemik
önkoflullama-n›n koruyucu etkisi koroner oklüzyon süresi uzarsa veya reperfüzyon geliflmezse ortadan kalkar.
‹skemik önkoflullaman›n farkl› hayvan türlerinde in-farkt boyutunu azaltt›¤› kapsaml› bir flekilde gösterilmifl olmas›na ra¤men, programl› hücre ölümü, yani apoptoz üzerindeki etkisi hakk›nda bilgilerimiz s›n›rl›d›r.[3]
Bu
fiekil 2. Her bir gruptaki birer dene¤e ait histopatolojik görüntü-ler: (a) Önkoflullama yap›lan grup, (b) önkoflullamas›z, sadece is-kemi ve reperfüzyon yap›lan grup, (c) kontrol grubu.
(a)
(b)
çal›flmada, in vivo uygulad›¤›m›z deneysel protokolde, bcl-2 immünhistokimyasal boyama yöntemiyle, önko-flullama yap›lan grupta apoptotik hücre ortalamas›nda anlaml› bir azalma oldu¤unu gördük.
Miyokardiyal iskeminin, çeflitli hayvan modellerin-de ve insanda apoptoza nemodellerin-den oldu¤u ortaya konmufl ol-mas›na ra¤men,[10]
artan kan›tlar apoptoz ekspresyonu-nun öncelikle reperfüzyon s›ras›nda meydana geldi¤ini iflaret etmektedir.[4]
Ancak, apoptozun iskemi s›ras›nda m›, yoksa reperfüzyon s›ras›nda m› tetiklendi¤i hala tar-t›flmal›d›r.[4]
Piot ve ark.[3]
in vivo s›çanda iskemi ve reperfüzyon sonras›nda, önkoflullama yap›lan kalplerde hem inter-nükleozomal DNA parçalanmas›n›n hem de infarktüs boyutunun önemli ölçüde azald›¤›n› göstermifllerdir. Wang ve ark.[11]
5 dakika iskemi, 5 dakika reperfüzyon ile önkoflullamadan sonra, 30 dakika iskemi ve 3 saatlik reperfüzyon sonras›nda köpeklerde miyokardiyal apop-tozun inhibe edildi¤ini göstermifllerdir. Bizim bulgula-r›m›z da bu çal›flmalarla uyumludur.
Genifl bir anti-apoptotik proteinler grubundan olu-flan bcl-2 familyas›n›n (bcl-2, bcl-xl, bcl-w, Bag-1 ve BI-1) ekspresyonu apoptozu önler ve genifl bir pro-apoptotik protein grubunun (Bax, Bak, Bad, Bid ve Bim) ekspresyonunu azalt›r.[12]
‹skemik önkoflullaman›n anti- ve pro-apoptotik protein ekspresyonu dengesini de¤ifltirerek apoptozda azalma sa¤lad›¤› gösterilmifl-tir.[4]
Misao ve ark.[13]
bcl-2 proteininin akut infarktüslü insan kalplerinin kurtar›lm›fl miyositlerinde salg›land›-¤›n› bildirmifllerdir; bu durum, baz› kalp hücrelerinin infarktüsün erken döneminde bcl-2 ekspresyonu saye-sinde korunabilece¤ini düflündürmektedir. ‹nfarktüslü dokular› çevreleyen kurtar›lm›fl miyositlerde bcl-2 pro-tein ekspresyonu görülmesine karfl›n, infarktüslü bölge-de Bax pro-apoptotik proteinin salg›lanmas›nda belirgin art›fl oldu¤u bildirilmifltir.[4]
Schmitt ve ark.[14]
aç›k kalp cerrahisi sonras› erken dönemde miyokardiyal apoptozisde belirgin art›fl, kar-diyak kontraktilitede azalma meydana geldi¤ini bildir-mifllerdir. Ayr›ca, apoptozisin ameliyat sonras› miyo-kardiyal stunning’de önemli bir mekanizma olabilece-¤ini ve antiapoptotik ajanlar›n kardiyoplejik solüsyon-larla beraber kullan›lmas›n›n miyokardiyal korumada ek yarar sa¤layabilece¤ini ileri sürmüfllerdir. Jenkins ve ark.[15]
ise, koroner bypass cerrahisi yap›lan hastalarda iskemik önkoflullaman›n troponin T seviyelerini azaltt›-¤›n› ve ATP depolar›n› korudu¤unu göstermifllerdir. Wu ve ark.[16]
ise aç›k kalp ameliyat› boyunca kardiyoplejik miyokardiyal iskeminin, kardiyomiyosit apoptozunda art›fla yol açt›¤›n› bildirmifllerdir. Bununla birlikte, iske-mik önkoflullaman›n ameliyat öncesi ve sonras›ndaki miyokardiyal apoptoz üzerinde anlaml› etkisi bulunma-m›fl; ayr›ca, iskemik önkoflullama ile ameliyat
sonras›n-da sonras›n-daha düflük dereceli kardiyak disfonksiyon görülme-si apoptozdan ba¤›ms›z bulunmufltur.
‹skemik önkoflullaman›n miyokardiyal aksiyon potansiyeli ve refraktör periyot sürelerindeki hetero-jeniteyi azaltarak veya ileti zamanlar›n› de¤ifltirerek re-entran aritmilerin geliflmesini önledi¤i düflünül-mektedir.[17]
Bu antiaritmik etkinin mekanizmas› tam olarak anlafl›lamamas›na ra¤men, ATP ba¤›ml› K+
ve Na+
kanallar›n›n eksitabilitesindeki de¤iflimlerin anti-aritmik etkinin hücresel temelini oluflturdu¤u tahmin edilmektedir.[18]
Sonuç olarak, iskemik önkoflullama yoluyla apop-tozun azalt›lmas›nda yer alan mekanizmalar›n anlafl›l-mas›, miyosit kayb›n›n en aza indirilmesine ve bu fle-kilde hem nekrotik hem de apoptotik dokulardan olu-flabilen toplam infarkt boyutunun düflürülmesine, ay-r›ca ventriküler aritmi s›kl›¤›n›n azalt›lmas›na yar-d›mc› olabilir.
KAYNAKLAR
1. Nakano A, Cohen MV, Downey JM. Ischemic precondition-ing: from basic mechanisms to clinical applications. Pharmacol Ther 2000;86:263-75.
2. Tomai F, Crea F, Chiariello L, Gioffre PA. Ischemic precon-ditioning in humans: models, mediators, and clinical rele-vance. Circulation 1999;100:559-63.
3. Piot CA, Padmanaban D, Ursell PC, Sievers RE, Wolfe CL. Ischemic preconditioning decreases apoptosis in rat hearts in vivo. Circulation 1997;96:1598-604.
4. Zhao ZQ, Vinten-Johansen J. Myocardial apoptosis and ischemic preconditioning. Cardiovasc Res 2002;55:438-55. 5. Walker MJ, Curtis MJ, Hearse DJ, Campbell RW, Janse MJ,
Yellon DM, et al. The Lambeth Conventions: guidelines for the study of arrhythmias in ischaemia infarction, and reper-fusion. Cardiovasc Res 1988;22:447-55.
6. Murry CE, Jennings RB, Reimer KA. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardi-um. Circulation 1986;74:1124-36.
7. Seiler C, Billinger M. Adenosine-induced preconditioning of human myocardium? Circulation 1998;98:824-5.
8. Downey JM, Cohen MV. Preconditioning: what it is and how it works. Dialogues 1997;2:179-97.
9. Fryer RM, Eells JT, Hsu AK, Henry MM, Gross GJ. Ischemic preconditioning in rats: role of mitochondrial K(ATP) channel in preservation of mitochondrial function. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2000;278:H305-12. 10. Vakeva AP, Agah A, Rollins SA, Matis LA, Li L, Stahl GL.
Myocardial infarction and apoptosis after myocardial ischemia and reperfusion: role of the terminal complement components and inhibition by anti-C5 therapy. Circulation 1998;97:2259-67.
11. Wang NP, Bufkin BL, Nakamura M, Zhao ZQ, Wilcox JN, Hewan-Lowe KO, et al. Ischemic preconditioning reduces neutrophil accumulation and myocardial apoptosis. Ann Thorac Surg 1999;67:1689-95.
13. Misao J, Hayakawa Y, Ohno M, Kato S, Fujiwara T, Fujiwara H. Expression of bcl-2 protein, an inhibitor of apoptosis, and Bax, an accelerator of apoptosis, in ventricular myocytes of human hearts with myocardial infarction. Circulation 1996; 94:1506-12.
14. Schmitt JP, Schroder J, Schunkert H, Birnbaum DE, Aebert H. Role of apoptosis in myocardial stunning after open heart surgery. Ann Thorac Surg 2002;73:1229-35.
15. Jenkins DP, Pugsley WB, Alkhulaifi AM, Kemp M, Hooper J, Yellon DM. Ischaemic preconditioning reduces troponin T release in patients undergoing coronary artery bypass surgery.
Heart 1997;77:314-8.
16. Wu ZK, Laurikka J, Saraste A, Kyto V, Pehkonen EJ, Savunen T, et al. Cardiomyocyte apoptosis and ischemic pre-conditioning in open heart operations. Ann Thorac Surg 2003; 76:528-34.
17. Okishige K, Yamashita K, Yoshinaga H, Azegami K, Satoh T, Goseki Y, et al. Electrophysiologic effects of ischemic precon-ditioning on QT dispersion during coronary angioplasty. J Am Coll Cardiol 1996;28:70-3.
