T.C.
ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ
KESİN RAPORU
ASPİRİN DUYARLI ASTIMLI OLGULARIN PERİFERİK KAN ÖRNEKLERİNİN ÇEŞİTLİ COX-1 VE COX-2 İNHİBİTÖRLERİ İLE UYARIMI SONRASI SİSTEİNİL LÖKOTRİEN SALINIMI, BU SALINIM ÜZERİNDE PGE2’NİN ETKİSİ VE BUNDAN
SORUMLU RESEPTÖRLERİN ARAŞTIRILMASI
Proje Yürütücüsü: Prof. Dr. Zeynep Mısırlıgil Yardımcı araştırmacılar:
Doç.Dr. Gülfem Çelik Dr. Nalan Çiçek Özdöl Prof. Dr.Mehmet Melli Proje No:2001-08-09-046 Başlama Tarihi:1 Nisan 2001
Bitiş Tarihi:1 Nisan 2003 Rapor Tarihi:4 Nisan 2003
Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara 2003
KISALTMALAR
AA Araşidonik asit
BAL Bronkoalveolar lavaj COX Siklooksijenaz
5-HPETE 5-hidroperoksieikosotetraenoik asit
IL İnterlökin
L-ASA Lisin-aspirin
LO Lipooksijenaz
LT Lökotrien
NSAİİ Nonsteroidal anti-inflamatuar ilaç
PG Prostoglandin
PLA2 Fosfolipaz A2 sLT Sisteinil lökotrien
Tx Tromboksan
AIA Aspirin ile indüklenen astım
ASPİRİN DUYARLI ASTIMLI OLGULARIN PERİFERİK KAN ÖRNEKLERİNİN ÇEŞİTLİ COX-1 VE COX-2 İNHİBİTÖRLERİ İLE UYARIMI SONRASI SİSTEİNİL LÖKOTRİEN SALINIMI, BU SALINIM ÜZERİNDE PGE2’NİN ETKİSİ VE BUNDAN
SORUMLU RESEPTÖRLERİN ARAŞTIRILMASI ÖZET
Aspirinle indüklenen astımın mekanizması halen kesin olarak bilinmemekte ve pek çok araştırmanın güncel ilgi alanını oluşturmaktadır. Son yıllarda sLT’ler AIA’da major mediator olarak ortaya çıkmıştır.
Bu çalışmada in vitro olarak AIA’lı olgular ile sağlıklı kontrol grubunda bazal ve çeşitli COX enzim inhibitörü ilaçlar olan aspirin ve SC560 (selektif COX-1 inhibitörü) ile uyarım sonrası periferik kan lökositlerinden sLT salınımının ve PGE2 düzeyinin değerlendirilmesi ve bu uyarım üzerinde PGE2’nin etkisinin araştırılması hedeflenmiştir.
Çalışma grubu aspirin duyarlılığı olan astımlı olguları (n=12), ve kontrol grubu olarak sağlıklı gönüllü bireyleri (n=13) içermiştir. Araştırmanın ilk fazında sLT ve PGE2’nin bazal ve aspirin (lysine-aspirin) ve SC560’ın 10-5, 10-6, 10-7 M konsantrasyonları ile uyarılmış düzeyleri Enzim Immün Assay yöntemi ile ölçüldü. Bu işlemler sonrası 2.
aşamada 1. aşamadaki uyaranlara 10-5, 10-6, 10-7 M PGE2 ilavesi sonrası sLT düzeyleri değerlendirildi.
Bazal sLT düzeyi AIA'da ile kontrol grubuna göre artmış olarak ölçüldü (80.6±4 pg/ml vs 12.2±3.5 pg/ml, p=0.049). Bazal PGE2 düzeyi her 2 grupta benzerdi (AIA:
2.3±0.4 pg/ml, kontrol grubu: 1.3±0.9 pg/ml, p>0.05).
2. çalışmada bazal sLT düzeyi AIA’lı grupta kontrol grubundan yüksek olarak ölçüldü (107.3±59.9 pg/ml vs 28.5±14.2 pg/ml, p<0.05). AIA’lı grup ve kontrol grubunda, aspirin ile uyarım sonrasında sLT düzeyi sırası ile 155.3±91.5 pg/ml ve 20.5±6.1 pg/ml olarak bulundu. AIA’lı grupta aspirin ile uyarım sonrası elde edilen değer bazal değerinden yüksekti (p=0.043). SC560 ile uyarım sonrasında sLT düzeyi AIA’lı grupta 90.2±61.5 pg/ml, kontrol grubunda ise 19.3±7.1 pg/ml olarak ölçüldü. Her iki değer de bazal değerlerinden farksızdı (p>0.05).
AIA’lı grupta hastaların aspirin ile uyarılmış örneklerine PGE2 eklendiğinde sLT düzeyleri PGE2 10-5 M, 10-6 M, ve 10-7 M konsantrasyonunda sırası ile 74.7±49.4 pg/ml, 90.7±47.7 pg/ml ve 107.6±57.3 pg/ml olarak ölçüldü . Bu değerler aspirin ile uyarım sonrası elde edilen sLT düzeyinden daha düşük bulundu (p=0.043).
Sonuç olarak, bu çalışmada aspirin duyarlı astımda bazal sLT düzeyinin kontrol grubuna göre yüksek bulunmuştur. Bazal PGE2 düzeyleri her iki grupta benzerdir. Aspirin ile uyarım sonrasında sLT düzeyi aspirin duyarlılığı olan astımlı hastalarda artmakta ve PGE2'nin değişik konsantrasyonları aspirin ile uyarılmış sLT salınımı üzerine inhibitör etki göstermektedir. Bu sonuçlar doğrultusunda AIA patogenezinde PGE2’nin azalmasının sLT artışında önemli bir rol oynadığı söylenebilir.
RELEASE OF CYSTEINYL LEUKOTRIENS FROM PERIPHERAL BLOOD LEUKOCYTES AFTER STIMULATION WITH SEVERAL COX-1 AND C0X-2 INHIBITORS AND EFFECT OF PGE2 ON THIS RELEASE AND THE RESPONSIBLE RECEPTORS FOR THIS EFFECT IN PATIENTS WITH ASPIRIN SENSITIVE ASTMA
SUMMARY
The mechanism of aspirin-induced asthma still remains unknown and has been a current topic of interest of many researches. Over the last years, cysteinyl leukotrienes (Cys-LTs) have emerged as major mediators in the pathogenesis of aspirin induced asthma (AIA).
In this study, we aimed to investigate the in vitro release of Cys-LT and to determine the effect of prostaglandin (PG) E2 on Cys-LT release from blood leukocytes after stimulation by ASA in patients with AIA, and in healthy controls.
The study group consisted of asthma patients with aspirin sensitivity (n=12) and healthy volunteers as controls (n=13). In the first phase, baseline and inducted levels of cys-LT and PGE2 after stimulation with 10-5, 10-6 and 10-7 molar concentrations of aspirin and SC560 were measured by Enzyme Immune Assay. In the second phase, the effect of addition of PGE2 at 10-5, 10-6 and 10-7 molar concentrations to the first phase stimulants were analyzed.
Baseline cys-LT levels in patients with AIA were higher than controls (80.65±43 pg/ml vs 12.2±3.5 pg/ml, p=0.049). Baseline PGE2 levels were similar in both groups (AIA:2,3±0,4 pg/ml; Controls:1,3±0,9 pg/ml, p>0.05).
In the second phase of the study, baseline cys-LT levels in patients with AIA were also higher than controls (107,3±59,9 pg/ml vs 28,5±14,2 pg/ml, p<0.05). A significant increase in cys-LT levels after stimulation with aspirin was observed only in patients with AIA (AIA:155,3±91,5 pg/ml vs 107.3±59,9 pg/ml p=0.043, controls: 28,5±14,2 pg/ml vs 20,5±6,1 pg/ml, p>0.05). Levels of cys-LT were comparable to baseline after stimulation with SC560 in both groups (AIA:90,2±47,7 pg/ml vs 107.3±59,9 pg/ml, p>0.05 and controls:19,3±7,1 pg/ml vs 20,5±6,1 pg/ml, p>0.05). Cys-LT levels after
107,6±57,3 pg/ml, respectively which were significantly lower compared with the baseline levels (p=0.043).
In conclusion, in this study, baseline sLT levels were found to be higher in patients with AIA than in controls. Baseline PGE2 levels were similar in both groups.
There is an increase in sLT levels after stimulation with aspirin in patients with AIA compared to controls and different concentrations of PGE2 showed an inhibitory effect on aspirin stimulated sLT levels. According to these results, decrease in PGE2 level is suggested to have an important role of increase in sLT levels in the pathogenesis of AIA.
AMAÇ VE KAPSAM:
Aspirinin astımlı hastalarda bronkospazmı artırdığı ilk kez Smater ve Beers tarafından 1968’de tanımlanmıştır (1). Aspirin duyarlılığı, astımlı çocuklarda seyrek, erişkin astımlılarda ise %5-20 arasında görülen bir tablodur (2-4). Sıklıkla kliniğin ortaya çıkışı 20-40 yaş arasında gerçekleşir. Kadın olgularda daha fazla görülür. Genelde ilk klinik tablo şiddetli bir rinitdir. Aylar boyunca devam eden kronik nazal konjesyon bunu takiben burun akıntısı ve burun tıkanıklığı başlar. Astım genelde rinit tablosu yerleştikten sonra ortaya çıkar. Önceleri sigara dumanı, kokular, toz, duman, nem, viral enfeksiyonlar varlığında tetiklenen astma atakları daha sonra triadın yerleşmesi ile birlikte aspirin ve/veya NSAİİ alımı ile de oluşmaya başlar. Aspirin duyarlı astımlı olgularda tipik olarak aspirin alımını takiben ilk saatlarde değişen derecelerde astım atağı ortaya çıkmaktadır.
Bu, doz bağımlı bir reaksiyon olup yüksek dozlarda çok ciddi reaksiyonlar oluşabilmektedir. Genelde çok ciddi reaksiyonlar ilk 1 saatte ortaya çıkmaktadır (2-4).
Bu olgularda astım, aspirin almasalar bile genelde zor kontrol altında tutulan, ciddi şiddettedir (5,6). Olguların yaklaşık %50'sinde sistemik steroid ile astım kontrol altında tutulabilmektedir (2-4).
Bu olgularda sadece aspirin değil, COX enzimini inhibe etme oranında diğer NSAİİ'lar da astmatik yanıta neden olabilmektedirler (2-4). Bu ilaçlar arasında dipiron grubu, indometazin, fenamik asit, ibuprofen, naproksen, piroksikam, diklofenak başlıcalılarıdır (7-9). Bu ilaçların reaksiyona yol açma oranları kişinin duyarlılığına, ilacın COX enzimini inhibe etme oranına ve ilacın dozuna bağlı olarak değişmektedir.
Bu hastalığın astımlı olgular içinde özel bir durum sergilemesi ve bu olguların astımlarının ağır seyretmesi bu hastalığın patogenezine dikkatleri yoğunlaştırmıştır. Son yıllarda yapılan yoğun çalışmalarla AIA patogenezi aydınlatılmaya çalışılmakla birlikte hala pek çok nokta bilinmemektedir. Çeşitli faktörlerin birlikte rol aldığı düşünülmektedir.
İmmünolojik bir mekanizmanın patogenezdeki rolü net bilinmemektedir.
Aspirin ve diğer NSAİİ’lar etkilerini COX yolunu inhibe ederek gösterirler (7-10).
Membran fosfolipidleri, AA üzerinden 5-LO ve COX olmak üzere iki ayrı yola
girmektedirler. 5-LO yolu üzerinden LTB4 ve sLT olarak bilinen LTC4, LTD4, LTE4
oluşurken, COX yolu üzerinden PG’ler ve Tx oluşur (Şekil 1).
Aspirin duyarlı astımın mekanizması kesin olarak bilinmemekle birlikte, bugün için en kabul gören yaklaşım belirgin bronkokonstriktör etkileri olduğu bilinen sLT salınımının artmasıdır (11-16). Önceleri patogenezde COX enziminin inhibisyonu sonrasında AA yolunun 5-LO üzerine kayması ile sLT artışının rol aldığı düşünülürken, bu artışın COX ürünlerindeki azalma ile korele olmaması ve aspirin duyarlı astımlı olgularda inhale PGE2
verilmesi ile aspirine karşı bronkokonstriktör yanıtın korunması ve yanısıra idrar LTE4
düzeyinde artma olmaması, PGE2'nin sLT'ler üzerine direkt inhibitör etkisi olabileceği düşüncesini gündeme getirmiştir (17,18). Bu yeni hipoteze göre aspirin alımı ile COX inhibisyonu olduğu, bu yolun önemli bir ürünü olan PGE2'nin azaldığı, ve PGE2'nin azalmasına bağlı olarak sLT üzerindeki inhibitör etkinin kalktığı ve sLT düzeylerinde artış olduğu öne sürülmektedir.
Aspirin duyarlı astımın patogenezinde sLT'lerin artışının önemli rol oynadığı ve in vivo aspirin provokasyonu sonrasında idrar, nazal lavajda ve bronş lavajı örneklerinde sLT'lerin arttığı bildirilmiştir ( 19-27).
Bu konuyu in vitro olarak araştıran kısıtlı sayıda araştırma bulunmaktadır. Bu doğrultuda daha önce Ankara Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından desteklenen bir diğer çalışmamızda aspirin duyarlı astımlı olgularda in vitro aspirin uyarımı sonrası sLTdüzeyinin arttığı gözlenmiştir (proje no:98-09-00-06) (28).
Bu çalışmada in vitro ortamda AIA’lı olgular ile sağlıklı kontrol grubunda bazal ve çeşitli COX enzim inhibitörü ilaçlar olan aspirin ve SC560 (selektif COX-1 inhibitörü) ile uyarım sonrası periferik kan lökositlerinden sLT salınımının ve PGE2 düzeyinin değerlendirilmesi ve bu uyarım üzerinde PGE2’nin etkisinin araştırılması hedeflenmiştir.
Şekil 1. Membran fosfolipdlerinin AA yolu üzerinden metabolizasyonu izlenmektedir.
Hücre membranı
Fosfolipaz A2
Araşidonik Asit
5-Lipooksijenaz (5-LO)
5-HPETE
LTA4
LTB4
BLT reseptörü
LTC4 , LTD4, LTE4
CysLT1 ve CysLT2 reseptörü
PGG2
PGH2
PGD2 PGF2 PGI2 PGE2 TxA2
TxB2 Siklooksijenaz (COX)
COX
III. Materyal ve Yöntem Hasta seçimi:
Çalışmaya 2 grup olgu alındı: 1. Grup: aspirin duyarlılığı olan astımlı olgular (n=12), 2. grup: aspirin duyarlılığı olmayan kontrol grubu olarak sağlıklı gönüllü bireyler (n=13; 10K/3E; oralama yaş:35.6±2.4 yıl). Aspirin duyarlılığı olan astımlı olgular arasından aspirin alımını takiben nefes darlığı gelişmiş olan ve öyküsü güvenilir olanlar çalışmaya alındı (29,30). Olgular Uluslararası ve Ulusal Astım Tanı Kılavuzu doğrult"usunda astım tanısı almış olanlar arasından seçilerek, hastalıklarının kontrol altında olduğu dönemde çalışmaya alındılar. Astımı kontrol altında olmayan ve/veya son 1 hafta içerisinde sistemik steroid, antihistaminik, aspirin ve/veya diğer bir NSAİİ alan olgular çalışma dışı bırakıldı. Bütün olgular çalışma ile ilgili olarak bilgi verildikten sonra yazılı olarak onay formu alınarak çalışmaya dahil edildi. Çalışmaya alınan olguların özellikleri Tablo 1'de verilmiştir. Kontrol grubu ile AIA’lı hasta grubu yaş ve cinsiyet dağılımı yönünden benzerdi .
Hücre hazırlama
Bu aşamada hastalardan elde edilen kan örneklerinden “lökosit” elde edilmesi jjjjjjjjjjjjjplanlandı. Bütün olgulardan sabah hafif bir kahvaltı sonrasında periferik venden EDTA içeren tüplere 5 ml kan örneği alınarak, 280 g, +4°C’da 15 dakika süre ile santrifüj edildi. Takiben supernatan atılarak atılan miktar kadar serum fizyolojik ilave edildi. Cam tüpe aktarılan örneğe 2.75 mlt (mlt başına 0.55 mlt) dekstran eklenerek etüvde 37ºC’de 20 dakika bekletildi. Süpernatan ayrı bir cam tübe aktarıldıktan sonra tekrar 280 g, +4°C’da 15 dakika süre ile santrifüj edilerek hücrelerin dibe çökmesi sağlandı. Takiben 2.5 mlt lizis A (%0.2 NaCl) ve ardından 2.5 mlt lizis B ( 3.98 gr NaCl, 500 mg sakkaroz, 250 mlt distile su), solusyonları ilave edilerek 280 g, +4°C’da 15 dakikada santrifüj edildi. Daha sonra supernatan atılarak hücreler elde edildi. Elde edilen hücrelere 3 ml tampon solüsyonu (20 mM HEPES, %0.025 HSA, 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM Mg Cl2, 0.5 mM Glukoz) konuldu. Bu karışımdan lökosit sayımı yapıldı. Bu ölçümde
ml’sinde 6 250 000 hücre olacak şekilde tampon ilave edildi. Bir ml örnek için 1.5 µl interlökin (IL)-3 (Human recombinant IL-3/Biosource International) eklendi.
Hücre stimülasyonu 1. çalışma:
Hücre stimülasyonu öncesi her hasta için 14 ayrı plate gözüne 200'er µl örnek konuldu. Araştırmanın ilk fazında uyaran olarak aspirin (lysine-aspirin) ve SC560 kullanıldı. Her uyarandan 10-5, 10-6, 10-7 M konsantrasyonlarında örnekler kullanıldı.
Uyarandan 12.5 µl miktarında ilave edildi.
Daha sonra kalan miktar tampon sıvısı ile 250 µl'ye tamamlandı. 40 dakika süre ile 37°C'de etüvde bekletildikten sonra 280 g, +4°C’da 15 dakika süre ile santrifüj edildi.
Elde edilen süpernatan plate’lere konularak analiz zamanına -80°C'de derin dondurucuda bekletildi.
2.çalışma:
Birinci çalışmadaki aşamaların hepsi tekrarlandıktan sonra bu çalışmada uyaran olarak COX-1 enzim inhibitörleri olan aspirin ve SC560 kullanıldı ve bu uyarım üzerinde ve bazal düzey üzerinde PGE2’nin 3 farklı konsantrasyonun (10-5, 10-6, 10-7 M) etkisi araştırıldı. PGE2 12.5 µl miktarında ilave edildi. Bu örneklerde sisteinil lökotrien düzeyi ölçüldü.
Sisteinil lökotrien ve prostaglandin E2 ölçümü
Örneklerdeki sLT ve PGE2 düzeylerinin ölçümü için asetilkolin esteraz işaretli solid faz EIA (Enzyme Immun Assay) yöntemi kullanıldı. EIA ile yapılan ölçümlerde SPI-Bio'dan (Cedex, Fransa) sağlanan sLT'ye özel peptido-leukotriene anti-serumu, peptido- leukotriene asetilkolin esteraz tracerı ve peptido-leukotriene standardı ile PGE2’ye özel anti-serum, asetil kolin esteraz ve standart kullanıldı. Bütün örnekler EIA tamponu (1 litre deionize su içinde 100 ml 1.0 M potasyum fosfat tamponu, 100 mg sodyum azide, 23.4 g NaCl, 370 mg tetrasodium EDTA, 1 gr bovine serum albumin) içinde sulandırılarak ölçüldü.
Microplatelere ölçüm yapılacak örnek, asetilkolin esterazla işaretli tracer ve anti-
Bağlanmayan maddelerin EIA-yıkama tamponu ile yıkanarak uzaklaştırılmasından sonra kuyucuklara 200 µl Ellman reaktifi eklendi. 60-90 dakika sonra spektrofotometrik olarak 414 nanometre dalga boyundaki adsorbans ölçüldü. sLT ölçümünde 3.9 pg/ml ve 500 pg/ml arasında, PGE2 ölçümünde ise 0.4 pg/ml ve 62.5 pg/ml arasında 8 derişim kullanılarak her plate için bir standard eğri oluşturuldu. Örneklerde sLT ve PGE2 düzeyi logit transformasyonundan uygulanmış standard eğrinin doğrusal regresyonundan elde edilen denklemden hesap edildi. Değerler pg/ml olarak cinsinden ifade edildi.
İstatistik Analiz
Bazal ve uyaranlar sonrası sLT ve PGE2 düzeylerinin farkları nonparametrik bağımlı-gruplar t-testi ile karşılaştırıldı. Bazal sLT düzeylerinin gruplararası karşılaştırmaları bağımsız gruplar t-testi analizi ile yapıldı. İstatistiki fark 0.05 ve altında olan p değerleri için anlamlı kabul edildi. Tüm sonuçlar ortalama±standart hata (SEM) olarak ifade edildi. İstatistik analizler Statistical Package for Social Sciences (SPSS) v10.0 programı ile yapıldı.
IV. Analiz ve Bulgular I. aşama:
Bazal sLT düzeyi
Bazal sLT düzeyi AIA'da 80.6±43 pg/ml, kontrol grubunda 12.2±3.5 pg/ml olarak ölçüldü. Bazal sLT düzeyleri açısından AIA’lı olgulardan elde edilen değer kontrol grubundan elde edilen değerden yüksekti (p=0.049) (Şekil 2).
Bazal PGE2 düzeyleri
Bazal PGE2 düzeyi AIA’lı olgularda 2.3±0.4 pg/ml, kontrol grubunda ise 1.3±0.9 pg/ml olarak bulundu ve her iki grupta elde edilen değer birbirinden farksız olarak bulundu (p>0.05) (Şekil 3).
II. aşama:
Bazal sLT düzeyi
Bazal sLT düzeyi AIA’lı grupta 107.3±59.9 pg/ml, kontrol grubunda 28.5±14.2 pg/ml olarak ölçüldü. Bazal sLT düzeyleri açısından AIA’lı gruptan elde edilen değer kontrol grubundan elde edilen değerden yüksekti (p<0.05) (Şekil 4).
Aspirin ve SC560 ile uyarım sonrası sLT düzeyi
AIA’lı grup ve kontrol grubunda, aspirin ile uyarım sonrasında sLT düzeyi sırası ile 155.3±91.5 pg/ml ve 20.5±6.1 pg/ml olarak bulundu. AIA’lı grupta aspirin ile uyarım sonrası elde edilen değer bazal değerinden yüksekti (p=0.043) (Şekil 4).
SC560 ile uyarım sonrasında sLT düzeyi AIA’lı grupta 90.2±61.5 pg/ml, kontro grubunda ise 19.3±7.1 pg/ml olarak ölçüldü. Her iki değer de bazal değerlerinden farksızdı (p>0.05) (Şekil 4).
PGE2 ile uyarım sonrası sLT düzeyi
AIA’lı grupta hastaların aspirin ile uyarılmış örneklerine PGE2 eklendiğinde sLT düzeyleri PGE2 10-5 M konsantrasyonunda 74.7±49.4 pg/ml, PGE2 10-6 M konsantrasyonunda 90.7±47.7 pg/ml ve PGE2 10-7 M konsantrasyonunda 107.6±57.3 pg/ml olarak ölçüldü (Şekil 5). Bu değerler aspirin ile uyarım sonrası elde edilen sLT düzeyinden daha düşük bulundu (p=0.043).
AIA’lı olgularda SC560 ile uyarılmış örneklere PGE2 eklendiğinde sLT düzeyleri PGE2 10-5 M konsantrasyonunda 100.7±56.3 pg/ml, PGE2 10-6 M konsantrasyonunda 84.0±53.3 pg/ml ve PGE2 10-7 M konsantrasyonunda 83.4±44.8 pg/ml olarak saptandı.
Her 3 konsantrasyonda elde edilen bu değerler SC560 ile uyarılmış örneklerden elde edilen değerlerden farksız bulundu (p>0.05).
Kontrol grubunda bazal örneklere aspirin ve SC560 ile uyarımı sonrası elde edilen değerler ile bunların 3 farklı konsantrasyon PGE2 ilavesi sonrası elde edilen değerler arasında fark bulunmadı (p>0.05).
Tablo 1. AIA’lı olguların demografik ve hastalık özellikleri
Özellik Parametre
n 12
Yaş (ortalama±SEM) (yıl) 42.5±2.2 yıl
K/E 10/2
Hastalık süresi (ortalama±SEM) (yıl) 18.2±2.1 yıl
Atopi oranı %58
Sigara içmiş hasta oranı %8
Şekil 2. AIA’lı olgular ve kontrol grubunda bazal sLT düzeyleri izlenmektedir. AIA’da bazal sLT düzeyi kontrol grubundan yüksek bulunmuştur.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
AIA Kontrol
sLT
sLT düzeyi (pg/ml)
*
*p=0.049
Şekil 3. AIA’lı olgular ve kontrol grubunda bazal PGE2 düzeyleri izlenmektedir. Gruplar arası fark anlamlı değildir (p>0.05).
0 0,5 1 1,5 2 2,5
AIA Kontrol
PGE2
PGE2düzeyi (pg/ml)
Şekil 4. AIA’lı olgular ve kontrol grubunda aspirin ve SC560 uyarımı sonrası sLT düzeyleri izlenmektedir. AIA’lı grupta aspirin ile uyarım sonrası sLT düzeyinde bazal değere göre artış izlenmektedir.
0 50 100 150 200
AIA Kontrol
Bazal ASA SC560
*
*p<0.05, bazal değerden yüksek
sLT düzeyi (pg/ml)
Şekil 5. AIA’lı olgular ve kontrol grubunda aspirin ile uyarılmış örneklere 3 farklı konsantrasyonda PGE2 ilave edilmesi sonrası sLT düzeyleri izlenmektedir. AIA’lı grupta artan PGE2 konsantrasyonu ile sLT daha belirgin azalmaktadır.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
ASA ASA +PGE2107 ASA +PGE210-6 ASA +PGE210-5 ASA ASA +PGE2107 ASA +PGE210-6 ASA +PGE210-5
AIA Kontrol
sLT düzeyi (pg/ml)
*
*p<0.05,
V.SONUÇ VE YORUM
Bu çalışmada aspirin duyarlı astımlı olguların periferik kan örneklerinde bazal sLT düzeylerinin kontrol grubuna göre yüksek olduğu ve aspirin uyarımı sonrasında da bu düzeyin daha da arttığı gösterilmiştir. Bu bulgumuzla uyumlu olarak aspirin duyarlı astımın patogenezinde sLT'lerin artışının önemli rol oynadığı ve gerek bazal gerekse aspirin provokasyonu sonrasında sLT'lerin arttığı bildirilmiştir (11-16). Bu çalışmaların birçoğunda analiz yöntemi olarak idrar sLT düzey ölçümü seçilmiş olup bazı araştırmalarda çeşitli vücut sıvılarında da sLT düzeyinin yükseldiği gösterilmiştir (19-27).
Aspirin ile nazal provokasyon sonrasında nazal lavajda sLT düzeyi bazal düzeye göre artmış bulunurken, intrabronşial uygulamada BAL sıvısında sLT düzeyinin arttığı saptanmıştır (25,26). Sisteinil lökotrienlerin aspirin duyarlı astım patogenezindeki rolü artan sLT'nin hava yollarında bronkokonstriksiyon, mukus sekresyonunda artışa, ödem ve hücresel göçe neden olması ile açıklanmaktadır (31,32).
In vivo aspirin provokasyonu ile yapılan çok sayıda çalışmanın yanısıra in vitro aspirin uyarımı sonrasında sLT salınımını değerlendiren çok az sayıda araştırma bulunmaktadır. Bunlardan ilkinde, aspirin ve/veya NSAII alımı ile ürtiker, Stevens- Johnson sendromu, fiks ilaç erüpsiyonu veya anaflaksi tanımlayan 25 hastada periferik kan lökositleri duyarlı oldukları ilaçlar ile stimüle ederek sLT salınımına bakılmıştır (33).
Elde edilen sonuçlar sağlıklı kontrollerden elde edilen sonuçlar ile karşılaştırıldığında hem bazal hem de uyarım sonrasında sLT salınımının artmış olduğu saptanmıştır.
Mewes ve arkadaşlarının yaptığı bir diğer çalışmada aspirin duyarlılığı olmayan nazal polipli olgular, aspirin duyarlılığı, astım ve nazal polipi olan olgular ve kontrol grubunun periferik kan lökositlerine in vitro olarak aspirin stimülasyonu yapılmıştır (34).
Her üç grubun bazal sLT düzeyleri benzer bulunurken, aspirin ile uyarım sonucu, aspirin duyarlılığı olan grupta elde edilen değerler diğer iki gruptan anlamlı olarak yüksek bulunmuştur. Tarafımızdan daha once yapılan bir diğer araştırmada da aspirin ile uyarım sonrasında ise aspirin duyarlı astımlı olgularda sLT düzeyinde anlamlı bir artış görülmüştür (28). Bu çalışmada da aspirin ile uyarım sonrası sLT artışı sadece aspirin
aspirinin bu grup hasta için spesifik bir uyaran olduğunu düşündürmektedir. Yakın zamanda yayınlanan bir diğer araştırmada da in vitro ortamda aspirin tolerant astımlı olgular ve sağlıklı kontrol grubu ile karşılaştırıldığında aspirin duyarlılığı olan astımlı olguların periferik kan lökositlerinin aspirin ile uyarımı sonrası fazla oranda sLT salınımına neden olduğu gösterilmiştir. Benzer bir şekilde bu araştırmada da aspirin ile uyarım sonrasında AIA’lı olgularda kontrol grubu ile karşılaştırıldığında sLT düzeyinin artmış olduğu bulunmuştur.
SC560 spesifik bir COX-1 enzim inhibitörüdür. Bu ilacın uygulaması ile periferik kan lökositlerinden sLT salınımında bir fark olmadığı görülmüştür. Bu uyaran ile daha önceye ait bir in vivo ya da in vitro çalışma bulunmadığından sLT düzeyinde artışa yol açmamasının ilacın kimyasal özelliklerinden kaynaklandığı düşünülebilinir.
Çalışmamızın bir diğer bulgusu ise her iki grupta bazal PGE2 düzeylerinin benzer oluşu idi. Bu konuda literatürde yapılan incelemelerde bazal düzeyi benzer bulan gruplar olduğu gibi aspirin duyarlı astımlı olgularda bazal düzeyin azaldığını öne sürenler de söz konusudur (35). Bu konuda bazal PGE2 düzeyini düşük bulanlar bu düşüklüğün bazal sLT artışının başlıca nedeni olduğunu öne sürmelerine karşın bazal PGE2 düzeyini kontrolle benzer bulanların savı ise sLT artışından sadece bazal PGE2 azalmasının sorumlu tutulamayacağı şeklindedir. Aspirin COX-1 enzimini inhibe ederek PGE2 düzeyinde azalma yapmaktadır (7-9). COX-2 izoenziminin inhibisyonunun PGE2 düzeyinde bir azalmaya yol açmadığı için bu hastalarda klinik yaratmadığı dolayısı ile COX-2 enzimini selektif olarak inhibe eden ilaçların bu olgularda güvenlikle kullanılabileceği öne sürülmektedir (36-40).
Aspirin duyarlı astımda bugün için sLT'lerin yüksekliği başlıca iki görüşle açıklanmaktadır. Ilk hipotez, COX enziminin inhibisyonu sonucu AA yolunun 5-LO üzerine kaydığını ve bunun sonucu olarak sLT'lerin arttığını savunmaktadır (shunt teorisi). Ancak yapılan incelemelerde, sLT düzeyindeki artışın COX ürünlerindeki azalma ile korele olmadığı gösterilmiş ve "shunt" teorisinden uzaklaşılmıştır.
Ikinci görüş ise COX enzim ürünlerinden olan PGE2'nin 5-LO yolu üzerinde inhibitör
üzerindeki inhibitör etkinin ortadan kalkması sonucu ile sLT'lerin arttığını öne sürmektedir. Bu hipotezi in vivo olarak doğrulayan bir çalışmada, aspirin duyarlılığı olan astımlı olgularda aspirin provokasyonu öncesinde verilen inhale PGE2'nin aspirin ile oluşan bronkospazma karşı tam bir koruyucu yanıt oluşturduğu ve idrar LTE4 düzeyinin aspirin provakasyonu sonrasında bazalden farksız olduğu gözlenmiştir (16). PGE2'nin hava yolu düz kası üzerine bronkodilatör etkisinin hafif olduğu görüşü üzerine inhale PGE2'nin sLT oluşumu üzerine inhibitör etki gösterdiği öne sürülmüştür. Buna benzer bir şekilde aspirin duyarlı olgularda oral ve nazal aspirin provokasyonu sonrasında PGE2 düzeyinde azalma ve sLT düzeyinde artma gözlenmiştir (35). Inhale PGE2'nin sadece aspirine karşı değil aynı zamanda egzersiz, sodyum metabisülfit ve allerjene karşı erken ve geç yanıtta koruyucu olduğu gösterilmiştir (41,42). PGE2'nin çeşitli mediatörleri inhibe ettiği gösterilmesine karşın aspirin uyarımı sonrasında sLT salınımı üzerine etkisini in vitro olarak araştıran bir çalışmaya rastlanmamıştır. Çalışmamızın ikinci kısmı bu amaca yönelik olarak planlanmıştır ve sonuçlar değerlendirildiğinde, aspirin duyarlı astımlı olguların in vitro olarak aspirin ile uyarılmış örneklerinde PGE2'nin her 3 dozunun sLT salınımı üzerine anlamlı olarak inhibitör etki yaptığı ve bu etkinin doz arttıkça daha belirgin olduğu gözlenmiştir. Bu etki sLT düzeyinde herhangi bir artışa neden olmayan SC560’da izlenmemiştir.
Aspirin duyarlı astımlı olgularda sLT artışından sorumlu hücrelerin araştırılması amacıyla yapılan çalışmalarda aspirine duyarlı olan ve olmayan astımlı olguların bronş mukoza biyopsilerinde 5-LO ile boyanan hücrelerin mast hücre ve eozinofil olduğu görülmüş ve sonuç olarak artmış sLT salınımının kaynağının bu hücreler olduğu düşünülmüştür (43,44). Nasser ve arkadaşlarının diğer bir araştırmasında da bu sonuçlar desteklenmektedir (45). Monositlerin sLT salınımındaki rolü incelendiğinde bu hücrenin daha çok LTB4 salgıladığı ve sLT salınımına minimal katkıda bulunduğu saptanmıştır (46).
Aspirin alan bazı kişilerde COX enzimi inhibisyonu ve PGE2 azalması olmasına rağmen klinik olarak aspirin duyarlılığı ortaya çıkmayabilmektedir. Dolayısı ile “PGE2'nin azalması hipotezi” aspirin duyarlılığının sağlıklı insanların ve/veya astımlı hastaların
kalmaktadır. Aspirin duyarlı astımlı olguların mukoza örneklerinde hem bazal hem de aspirin ile uyarım sonrası LTC4 sentetaz düzeyinin aspirin duyarlılığı olmayan olgulara ve sağlıklı kontrollere göre arttığı ve bunun başlıca hücresel kaynağının eozinofiller olduğu gösterilmiştir (47). Bu sonuçlar, aspirin duyarlı astımdaki sLT salınım kapasitesindeki artmayı ve aspirin alımı sonrası oluşan reaksiyonların kişiler arası seçiciliğini, LTC4
sentetaz enziminin ekspresyonundaki değişkenliğe bağlayarak bu farklılığın hücresel kaynaklarını ortaya koymaktadır.
LTC4 sentetaz enziminin geninin, diğer astım aday genlerine oldukça yakın bir lokalizasyonda, 5q35'de lokalize olduğu bulunmuştur (48,49). Enzimdeki polimorfizmin yanısıra aspirin duyarlı astımlı olgularda HLA-DPB1-0301 sıklığında artış olduğu gözlenmiştir (50). Bu durum aspirin duyarlı astımda genetik yapının önemini desteklemektedir. Aspirin duyarlı astım patogenezindeki son bulgular şekil 6’da izlenmektedir.
Çalışmamızın bulguları da bu şemaya ilave edildiğinde aspirin duyarlı astımlı olgularda COX-1 inhibitörü ilaçların alınmasını takiben PGEdüzeyinde bir azalma olmakta bunun sonucu olarak PGE2’nin sLT’ler üzerine olan inhibitor etkisi ortadan kalkmakta ve sLT düzeyinde bir artış olmaktadır. Neden herkeste bu patolojinin ortaya çıkmasığı ise LTC4 sentetaz enziminin genetik olarak espresyonundaki artışla açıklanmaya çalışılmaktadır. Bunun yanısıra son zamanlarda yapılan diğer araştırmalarda AIA’lı olgularda araşidonik asitin lipooksijenizasyonu ile oluşan ve antiinflamatuar özelliği bulunan lipoksinlerin oluşumunda da defekt gösterilmiştir (51). Son yıllarda yoğunlaşan bu araştırmalarda lipoksin eksikliğinin AIA patogenezinde önemli rol oynadığını destekleyen araştırma sayısında artış izlenmektedir.
Sonuç olarak bu çalışmada aspirin duyarlı astımda bazal sLT düzeyinin kontrol grubuna göre yüksek, ancak bazal PGE2 düzeylerinin her iki grupta benzer olduğu, aspirin ile uyarım sonrasında sLT düzeyinin aspirin duyarlılığı olan astımlı hastalarda arttığı, PGE2'nin değişik konsantrasyonlarda aspirin ile uyarılmış sLT salınımı üzerine inhibitör etki yaptığı, bu inhibitör etkinin doz-bağımlı olduğu ve yüksek konsantrasyonlarda daha
belirgin olduğu gözlenmiştir. Bulgularımızın AIA patogenezinde önemli noktaların tamalanmasında yardımcı bir rol üstlenerek literatürdeki yerini alacağı düşünmekteyiz.
Şekil 6. AIA’da patogenezdeki son görüşler izlenmektedir.
Nükleus
COX-1 COX-2 COX-1
COX-2
(-)
PGH
2PGE
2FLAP
5-LO
LTA
4LTB
4LTB
4LTC4 sentetaz
LTC
4LTC
4, LTD
4, LTE
4Eozinofil Mukus bezler Endotel Hava yolu (-)
ECP Histamin
(-)
KAYNAKLAR
1. Samter M, Beers FR. Intolerance to aspirin. Clinical studies and consideration of its pathogenesis. Ann Intern Med 1968;68:975-983.
2. Szczeklik A, Nizankowska E. Clinical features and diagnosis of aspirin induced asthma.Thorax 2000;55(suppl 2):s42-s44.
3. Schiavino D, Nucera E, Milani A, et al. The aspirin disease. Thorax 2000; 55(suppl 2):s66-s69.
4. Çelik G, Mungan D, Özer F, Ediger D, Bavbek S, Sin B, Demirel YS, Mısırlıgil Z. Clinical features and atopy profile in Turkish subjects with analgesic intolerance. J Asthma 2002;39:101-106.
5. Picado C, Castillo JA, Montserrat JM, August-Vidal A. Aspirin-intolerance as a precipitating factor of life-threatening attacks of asthma requiring mechanical ventilation. Eur Respir J 1989;2:127-129.
6. Marguetto CH, Saulnier F, Leroy O, et al. Long term prognosis for near-fatal asthma.
Am Rev Respir Dis 1992;146:76-81.
7. Vane J. Aspirin and other anti-inflammatory drugs. Thorax 2000; 55(suppl 2):s3-s9.
8. Vane JR. The mode of action of aspirin and similar compounds. J Allergy Clin Immunol 1976;58:691-712.
9. Stevenson DD. Aspirin and nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Immunol Allergy Clin North Am 1995;15:529-549.
10.Picado C. Aspirin-intolerant asthma:role of cyclo-oxygenase enzymes.Allergy 2002;57 (suppl 72):58-60.
11.Szczeklik A. Mechanism of aspirin-induced asthma. Allergy 1997;52:613-619.
12.Lee TH. Mechanism of bronchospasm in aspirin-sensitive asthma. Am Rev Respir Dis 1993;148:1442-1443.
13.Kowalski ML. Aspirin-sensitive rhinosinusitis/asthma syndrome - pathophysiology and management. ACI International 1996;8:49-56.
14.Lee TH. Mechanism of aspirin sensitivity. Am Rev Respir Dis 1992;145(Suppl.):34-36.
15.Christie PE, Smith C, Arm JP, Lee TH. Aspirin-sensitive asthma. Clin Exp Allergy 1992;22:171-175.
16.Szczeklik A, Stevenson DD.Aspirin-induced asthma:advances in pathogenesis and management.J Allergy Clin Immunol 1999;104:5-13.
17.Peebles RS, Sheller JR. Role of prostaglandins in asthma. Immunol Allergy Clin North Am 2002;22:827-844.
18.Sestini P, Armetti L, Gambora G, et al. Inhaled PGE2 prevents aspirin-induced bronchoconstriction and urinary LTE4 excretion in aspirin-sensitive asthma. Am J Respir Crit Care Med 1996;53:572-575.
19.Kumlin M. Measurement of leukotrienes in the urine: strategies and applications.
Allergy 1997;52:124-135.
20.Knapp HR, Sladek K, Fitzgerald GA. Increased excretion of leukotriene E4 during aspirin-induced asthma. J Lab Clin Med 1992;119:48-51.
21.Kumlin M, Dahlen B, Bjork T, et al. Urinary excretion of leukotriene E4 and 11- dehydro-thromboxane B2 in response to bronchial provocations with allergens, aspirin, leukotriene D4 and histamine in asthmatics. Am Rev Respir Dis 1992;146:96-103.
22.Oosaki R, Mizushima Y, Mita H, et al. Urinary leukotriene E4 and 11- dehydrothromboxane B2 in patients with aspirin-sensitive asthma. Allergy 1997;52:470-473.
23.Sladek K, Szczeklik A. Cysteinyl leukotrienes overproduction and mast cell activation in aspirin-provoked bronchospasm in asthma. Eur Respir J 1993;6:391-399.
24.Smith CM, Hawskworth RJ, Thien FC, et al. Urinary leukotriene E4 in bronchial asthma.
Eur Respir J 1992;5:693-699.
25.Szczeklik A, Sladek K, Dworski R, et al. Bronchial aspirin challenge causes specific eicosanoid response in aspirin-sensitive asthmatics. Am J Respir Crit Care Med 1996;154:1608-1614.
26.Picado C, Ramis I, Rosello J, et al. Release of peptide leukotriene into nasal secretions after local instillation of aspirin in aspirin-sensitive asthmatic patients. Am Rev Respir
27.Ferreri NR, Howland WC, Stevenson DD, Spielberg HL. Release of leukotrienes, prostaglandins, and histamine into nasal secretions of aspirin-sensitive asthmatics during reaction to aspirin. Am Rev Respir Dis 1988;137:847-854.
28. Çelik G, Bavbek S, Mısırlıgil Z, Melli M. Release of cysteinyl leukotrienes with aspirin stimulation and the effect of prostaglandin E2 on this release from peripheral blood leukocytes in aspirin-induced asthmatic patients. Clin Exp Allergy 2001;31:1615-1622.
29.Expert Panel Report 2. Guidelines for the diagnosis and management of asthma.
National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Publication no. 97-4051, July 1997.
30.Ulusal Astım Tanı ve Tedavi rehberi. Toraks Dergisi 2000 ; 1: ek 1.
31.Busse WW. The role of leukotrienes in asthma and allergic rhinitis. Clin Exp Allergy 1996;26:868-879.
32.Sampson AP. The leukotrienes: Mediators of chronic inflammation in asthma. Clin Exp Allergy 1996;26:995-1004.
33.Kubota Y, Imayama S, Toshitani A, et al. Sulfidoleukotriene release test (CAST) in hypersensitivity to nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Int Arch Allergy Immunol 1997;114:361-366.
34.Mewes T, Riechelmann H, Klimek L. Increased in vitro cysteinyl leukotriene release from blood leukocytes in patients with asthma, nasal polyps, and aspirin intolerance.
Allergy 1996;51:506-510.
35.Antczak A, Montuschi P, Kharitonov S, Gorski P, Barnes P. Increased exhaled cysteinyl-leukotrienes and 8-isoprostane in aspirin-induced asthma. Am J Repir Crit Care Med 2001;166:301-306.
36.Quaratino D, Romano A, Papa G, et al. Long-term tolerability of nimesulide and acetaminophen in nonsteroidal anti-inflammatory drug-intolerant patients. Ann Allergy Asthma Immunol 1997;9:47-50.
37.Bavbek S, Çelik G, Ediger D, et al. Use of Nimesulide in patients with aspirin intolerance. J Asthma 1999 36:657-663.
38.Bavbek S, Çelik G, Özer F, Mungan D, Mısırlıgil Z. Safety of selective COX-2 inhibitors in aspirin/nonsteroidal anti-inflammatory drugs-intolerant patients: comparison of nimesulide, meloxicam and rofecoxib. J Asthma (Yayına kabul edildi).
39.Karakaya G, Kalyoncu AF. Safety of nimesulide, meloxicam and rofecoxib as alternative analgesics. Allergol Immunol Pathol (Madrid). 2000;28:319-321.
40.Kosnik M, Music E, Matjaz F, Suskovic S. Relative safety of meloxicam in NSAID- intolerant patients. Allergy 1998;53:1231-1233.
41.Pavord ID, Wisnievski A, Mathur R, et al. Effect of inhaled prostoglandin E2 on bronchial reactivity to sodium metabisulfite and methacholine in patients with asthma.
Thorax 1991;46:633-637.
42.Pavord ID, Wong CS, Williams J, Tattersfield AE. Effect of inhaled PGE2 on allergen- induced asthma. Am Rev Respir Dis 1993;148:87-90.
43.Kowalski ML, Grzegorczyk J, Wojciechowska B, Poniatowska M. Intranasal challenge with aspirin induces cell influx and activation of eosinophils and mast cells in nasal secretions of ASA-sensitive patients. Clin Exp Allergy 1996;26:807-814.
44.Nasser S, Christie PE, Pfister R, et al. Effect of endobrochial aspirin challange on inflammatory cells in bronchial biopsy samples from aspirin-sensitive asthmatic subjects. Thorax 1996;51:64-70.
45.Nasser SM, Pfister R, Christie PE, et al. Inflammatory cell populations in bronchial biopsies from aspirin-sensitive asthmatic subjects. Am J Respir Crit Care Med 1996;153:90-96.
46.Juergens UR, Christansen SC, Stevenson DD, Zuraw BL. Arachidonic acid metabolism in monocytes of aspirin-sensitive asthmatic patients before and after oral aspirin challenge. J Allergy Clin Immunol 1992;90:636-645.
47.Sampson AP, Cowburn AS, Sladek K, et al. Profound overexpression of leukotriene C4
synthase in bronchial biopsies from aspirin-intolerant asthmatic patients. Int Arch Allergy Immunol 1997;113:355-357.
48.In KH, Asano K, Beier D, et al. Naturally occurring mutations in the human 5- lipoxygenase gene promoter that modify transcription factor binding and reporter gene transcription. J Clin Invest 1997;99:1130-1137.
49.Sanak M, Simon HU, Szczeklik A. Leukotriene C4 synthase promoter polymorphism and risk of aspirin-induced asthma. Lancet 1997;29:599-600.
50.Dekker JW, Nizankowska E, Schmitz-Schumann M, et al. Aspirin-induced asthma and HLA-DRB1 and HLA-DPB1 genotypes. Clin Exp Allergy 1997;27:574-577.
51.Szczeklik A, Sanak M. Molecular mechanisms in aspirin-induced asthma.ACI International 2000;12:171-175.
