ANKARA ÜNİVERSİTESİ

156  Download (0)

Tam metin

(1)

ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

β-GLUKAN İÇERİĞİNİN ARTTIRILMASI İÇİN S.cerevisiae ÜRETİLEN BİR BİYOREAKTÖRDE ÇOĞALMA KOŞULLARININ İNCELENMESİ VE pH

KONTROLU

Nur SABUNCU

KİMYA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI

ANKARA 2016

Her hakkı saklıdır

(2)

TEZ ONAYI

Nur SABUNCU tarafından hazırlanan “β-Glukan İçeriğinin Arttırılması İçin S.cerevisiae Üretilen Bir Biyoreaktörde Çoğalma Koşullarının İncelenmesi ve pH Kontrolu” adlı tez çalışması 15/07/2016 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı’nda YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak kabul edilmiştir.

Danışman : Yrd. Doç. Dr. Suna ERTUNÇ

Ankara Üniversitesi Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı

Jüri Üyeleri :

Başkan : Prof. Dr. Tülin KUTSAL

Hacettepe Üniversitesi Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı

Üye : Prof. Dr. Bülent AKAY

Ankara Üniversitesi Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı

Üye : Yrd. Doç. Dr. Suna ERTUNÇ

Ankara Üniversitesi Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı

Yukarıdaki sonucu onaylarım.

Prof. Dr. İbrahim DEMİR Enstitü Müdürü

(3)

ETİK

Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü tez yazım kurallarına uygun olarak hazırladığım bu tez içindeki bütün bilgilerin doğru ve tam olduğunu, bilgilerin üretilmesi aşamasında bilimsel etiğe uygun davrandığımı, yararlandığım bütün kaynakları atıf yaparak belirttiğimi beyan ederim.

15.07.2016

Nur SABUNCU

(4)

ÖZET Yüksek Lisans Tezi

Β-GLUKAN İÇERİĞİNİN ARTTIRILMASI İÇİN S.CEREVİSİAE ÜRETİLEN BİR BİYOREAKTÖRDE ÇOĞALMA KOŞULLARININ İNCELENMESİ VE PH KONTROLU

Nur SABUNCU Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Yrd. Doç. Dr. Suna ERTUNÇ

β-glukan, sağlık üzerindeki olumlu etkileri nedeniyle ABD'de FDA (Food Drug Administration) ve Avrupa'da EFSA (European Food Safety Administration) gibi gıda denetim kuruluşları tarafından onay almış, yan etkisi olmayan antitümör, antiviral, antibakteriyel, antifungal özellik taşıyan bir etken maddedir. Ekmek mayası olarak bilinen S.cerevisiae mayasının hücre duvarı önemli bir β-glukan kaynağıdır. Hücre duvarı yapısı ve bileşimi mayanın çoğalma koşullarına sıkı bir biçimde bağlı olduğundan tez kapsamında mayanın β- glukan içeriğini arttırmak için biyorektörde çoğalma koşulları optimize edilerek pH’ın kontrolu amaçlanmıştır.

β-glukanın hücre duvarından ekstraksiyonu için alkali-asidik yöntem, analizi için ise Antron- H2SO4 ve enzimatik yöntemler kullanılmıştır. Optimum koşulların belirlenmesi için sınırlı sayıda deneyden mümkün olduğunca çok yararlı bilgi elde etmeyi sağlayan “İstatistiksel Deney Tasarımı” metodlarından Merkezi Birleşik Tasarım (Central Composite Design) tekniği kullanılmıştır. Optimum sıcaklık 34.7oC ve pH 4.8 olarak belirlendikten sonra bu koşullarda çoğalma ortamına eklenen EDTA, CaCl2 ve sorbitol olarak belirlenen katkı maddelerinin S.cerevisiae‘nın β-glukan içeriğine etkisi incelenerek 21.65 g/mL derişiminde EDTA’nın β-glukan içeriğini arttırdığı tespit edilmiştir.

β-glukan’ın farklı derişim değerlerinde Antron-H2SO4 ve enzimatik yöntem ile analiz sonuçları değerlendirilerek iki yöntemle elde edilen sonuçlar arasında lineer bir ilişki oluşturulmuştur.

Çoğalma ortamı pH değerinin mayanın β-glukan içeriğine etkisini incelemek amacıyla küçük ölçekli pH kontol çalışmaları yapılarak çoğalma ortamı pH’ının belirlenen optimum değerinde çoğalma boyunca kontrol edildiği durumda β-glukan içeriğinin en yüksek olduğu belirlenmiştir.

Mayanın β-glukan içeriğini arttırmak üzere kontrol edilmesi gerektiği sonucuna ulaşılan pH’ın, çoğalma boyunca optimum değerinde kontrolu PID ve kendinden ayarlamalı PID kontrol algoritmaları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ayarlanabilen değişken olarak baz akış hızı seçilmiş, asit ve baz çifti olarak H3PO4 ve NaOH kullanılmıştır. Baz akış hızına verilen pozitif ve negatif basamak etkiler için proses tepki eğrisi ve sistem tanımlama ile prosesin dinamik davranışını ifade eden modeller belirlenmiştir. MATLAB programlama dilinde kodlanmış PID ve kendinden ayarlamalı PID yöntemleriyle pH kontrol benzetimiyle kontrol edicilerin performansı karşılaştırılmış, biyoreaktörde on-line pH kontrolundaki başarıları değişken set noktası takibi için sınanmıştır.

Temmuz 2016, 140 sayfa

Anahtar Kelimeler: β-glukan, optimizasyon, CCD, pH kontrol, sistem tanımlama, kendinden ayarlamalı PID, PID, S.cerevisiae

(5)

ABSTRACT

Master Thesis

INVESTIGATION OF GROWTH CONDITIONS AND PH CONTROL IN A BIOREACTOR TO INCREASE Β- GLUCAN CONTENT OF S.CEREVISIAE

Nur SABUNCU Ankara University

Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemical Engineering Supervisor: Asst. Prof. Dr. Suna ERTUNÇ

β-glucan is an active ingredient which was approved by FDA in USA (Food Drug Administration) and EFSA in Europe (European Food Safety Administration) due to its positive effects on health, which does not have any side effects when used individually or together with other drugs and which has antitumor, antiviral, antibacterial and antifungal properties. The cell wall of S.cerevisiae yeast, which is known as Baker’s yeast, is an important source of β-glucan.

In this study, the effect of growth conditions of S.cerevisiae on β-glucan yield was examined. In order to determine the optimum conditions, statistical experiment design which aims to obtain as much valuable information as possible from limited number of experiments, was applied. For this purpose a central composite design which has important statistical properties was used.

After determining optimum temperature value as T=34.7oC and pH=4.80, the effects of additives (EDTA, CaCl2 and Sorbitol) on growth environment and β-glucan content of S.cerevisiae was examined. According to marginal effects of additives it was determined that EDTA increases the content of β-glucan individually.

In this study, β-glucan was analyzed by using Antron-H2SO4 and enzymatic methods and both methods were compared. Depending on different measurement values of Antron-H2SO4 and enzymatic methods in various concentration levels, a linear relation was established between two methods.

In order to investigate the effect on β-glucan content, small scaled pH control studies were performed. As a result of the studies made, β-glucan content was found to be highest in the situation where reproduction environment is controlled at the determined optimum value of pH.

Under the scope of the control studies performed in bioreactor, H3PO4 and NaOH were used as suitable acid – base couple. pH and base flow rate were selected as controlled and manipulated variables in the bioreactor. In case of positive and negative effect, input-output relation was examined and PID control parameters were calculated. The calculated control parameters were entered to the algorithm written in Visual Basic language in order to conduct the on-line PID control studies in the bioreactor where microorganisms are reproduced.

The dynamic behavior of the system was examined and the model which best defines the process was obtained by system defining method. By using the obtained output values, model parameters were determined by recursive least square method. By using PID coded by Matlab programming language and Self-tuning PID methods, pH control simulation was realized and comparison was made in terms of performance properties.

July 2016, 140 pages Key words: β-glucan, optimization, CCD, pH control, system identification, self-tuning PID,

PID, S.cerevisiae

(6)

TEŞEKKÜR

Ankara Üniversitesi Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı’nda tamamlamış olduğum yüksek lisans eğitimim boyunca bilgi birikimi ve tecrübeleriyle çalışmalarıma yön veren, karşılaştığım her sorunda umut verici yaklaşımlarıyla yoluma ışık tutan, çalışmamın her aşamasını özveri ve titizlikle değerlendiren değerli danışman hocam Sayın Yrd. Doç. Dr. Suna ERTUNÇ’a (Ankara Üniversitesi Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı) tüm emekleri ve sabrı için sonsuz teşekkürlerimi sunarım.

Geçirdiğim süre boyunca fikirlerini aldığım ve tecrübelerinden faydalandığım hocam Sayın Prof. Dr. Bülent AKAY’a (Ankara Üniversitesi Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı) Proses Kontrol çalışmalarım boyunca karşılaştığım zorluklarda yardımlarını esirgemeyen Dr. Havva BOYACIOĞLU’na tüm katkılarından dolayı teşekkür ederim.

Deneysel çalışmalarım boyunca bilgi ve tecrübelerini benimle paylaşan Arş. Gör.

Zeynep YILMAZER HİTİT’e (Ankara Üniversitesi Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı) teşekkürlerimi sunarım.

Çalışmamın ilerleyebilmesinde deneysel cihazlarının kullanımı konusunda yardımlarını esirgemeyen Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı öğretim üyelerine ve araştırma görevlilerine teşekkür ederim.

Yoğun geçen yüksek lisans eğitimim boyunca yaşamımın her alanında olduğu gibi maddi manevi bana en büyük desteği sağlayan, varlıklarıyla umut ve güç veren çok sevgili anneme ve babama, benim en yakın arkadaşım, neşe kaynağım olan biricik kardeşime en içten duygularımla sonsuz teşekkürlerimi sunarım.

Bu günleri görmesini çok istediğim ancak çalışmalarım devam ederken aramızdan ayrılan çok sevdiğim rahmetli anneanneciğimi derin bir özlemle anarak, bu tezi kendisine ithaf ederim.

Nur SABUNCU Ankara, Temmuz 2016

(7)

İÇİNDEKİLER

TEZ ONAYI SAYFASI

ETİK ... i

ÖZET ... ii

ABSTRACT ... iii

TEŞEKKÜR ... iv

SİMGELER DİZİNİ ... viii

ŞEKİLLER DİZİNİ ... ix

ÇİZELGELER DİZİNİ ... xiii

1. GİRİŞ ... 1

2. KAYNAK ARAŞTIRMASI ... 5

2.1 S.cerevisiae Çoğalma Koşullarının β-glukan Üretimine Etkisinin İncelendiği Kaynaklar ... 5

2.2 PID ve Kendinden Ayarlamalı (Self-tuning) PID Kontrol Çalışmalarını İçeren Kaynaklar... 9

3. KURAMSAL TEMELLER ... 11

3.1 β-glukanın Yapısı ve Özellikleri... 11

3.2 β-glukan Kaynakları ... 13

3.3 β-glukan Kaynağı: S. cerevisiae (Ekmek Mayası) ... 14

3.4 β-glukanın Kullanım Alanları ve Sağlık Üzerindeki Etkileri ... 15

3.5 β-glukan Üretim Teknolojileri ... 18

3.6 Türkiye’de ve Dünyada β-glukan Üretimi ... 20

3.7 Mayadan β-glukan Üretimi ve Üretimi Etkileyen Parametreler ... 21

3.7.1 Çoğalma koşullarının etkisi ... 22

3.7.1.1 Katkı maddelerinin etkisi ... 22

3.7.1.2 Ekstraksiyon koşullarının etkisi ... 23

3.8 Mikroorganizma Aktivitesinin Belirlenmesi ... 24

3.9.1 Sistem Modelleri ... 26

3.9.2 Doğrusal Modeller ... 27

3.9.3 Model parametrelerinin hesaplanması ... 29

3.9.3.1 En küçük kareler yöntemi ... 29

3.9.3.2 Yinelemeli En Küçük Kareler Yöntemi ... 31

(8)

3.10 Girdi-Çıktı İlişkisi ... 35

3.10.1 Basamak Etki Durumunda Girdi-Çıktı İlişkisi ... 36

3.11 Cohen-Coon Yöntemi ile Kontrol Parametrelerinin Hesaplanması ... 39

3.12 β-glukan Üretimi Açısından pH Kontrolun Gerekliliği ... 40

3.13 pH Kontrol ... 40

3.13.1 PID kontrol yöntemi ... 41

3.13.2 Kendinden ayarlamalı (Self-Tuning) PID kontrol yöntemi ... 42

3.13.3 Kontrol performansının belirlenmesi ... 50

3.14 S.cerevisiae’nın Optimum Çoğalma Koşullarının Belirlenmesi ... 51

3.15 Optimizasyon ve İstatistiksel Deney Tasarımı ... 52

3.15.1 Yanıt yüzey yöntemi (Response surface methodology) ... 53

3.15.2 Merkezi bileşik tasarım (Central Composite Design) ... 54

4. MATERYAL VE YÖNTEM ... 57

4.1 Mikroorganizma Çoğaltılması ... 57

4.2 Besi Ortamları ... 57

4.2.1 Katı besi ortamı ... 58

4.2.2 Sıvı besi ortamı ... 58

4.3 S.cerevisiae Mayasından β-glukan Ekstraksiyonu ... 59

4.3.1 Antron-H2SO4 metodu ile β-glukan analizi ... 61

4.3.2 Enzimatik analiz metodu ile β-glukan analizi ... 62

4.3.2.1 Toplam glukan miktarı ölçümü (α-glukan + β-glukan)... 63

4.3.2.2 α-glukan miktarı ölçümü ... 63

4.3.2.3 β-glukan içeriğinin hesaplanması ... 64

4.3.3 β-glukan veriminin hesaplanması ... 65

4.4 Canlı Mikroorganizma Sayımı ... 66

4.5 İstatistiksel Deney Tasarımı ve Optimizasyon Çalışmaları ... 67

4.6 Deney Düzeneği ve Kullanılan Ekipmanlar ... 68

4.7 On-line pH Kontrolu ... 69

4.8 Deney Yöntemi ... 69

4.8.1 Biyoreaktörün dinamik analizi ... 69

4.8.1.1 Kalibrasyon çalışmaları ... 69

4.8.1.2 Açık-Hat biyoreaktör işletimi ... 70

(9)

4.8.1.3 Yatışkın koşulun belirlenmesi ... 70

4.8.1.4 pH kontrolu ... 70

5. ARAŞTIRMA BULGULARI ... 73

5.1 Maya Seçimi ve Maya Aktivitesinin Belirlenmesi ... 73

5.2 Antron-H2SO4 Metodu İçin Glikoz Kalibrasyon Doğrusunun Oluşturulması ... 79

5.4 β-Glukan Üretim Veriminin Arttırılması İçin S.cerevisiae Mayasının Çoğalma Koşullarının İncelenmesi ... 82

5.4.1 Optimum sıcaklık ve başlangıç pH değerlerinin belirlenmesi ... 82

5.4.2 Çoğalma ortamına eklenen katkı maddelerinin β-glukan içeriğine etkisinin incelenmesi ... 85

5.3.3 Katkı maddelerinin marjinal etkilerinin incelenmesi ... 89

5.4 pH Kontrolsüz ve pH Kontrollü Durumda Elde Edilen β-glukan İçeriğinin Karşılaştırılması ... 93

5.5 pH Kontrol Çalışmaları ... 95

5.5.1 Asit- baz çiftinin belirlenmesi ... 95

5.5.2 Kalibrasyon çalışmaları ... 100

5.5.2.1 pH metre kalibrasyonu ... 100

5.5.2.2 Asit ve baz pompası kalibrasyonları ... 101

5.5.3 Yatışkın koşulun belirlenmesi ... 102

5.5.4 Reaktörün dinamik koşulda işletimi ... 102

5.5.5 Girdi-Çıktı ilişkisi ... 104

5.5.5.1 Pozitif basamak etki durumunda girdi-çıktı ilişkisi ... 104

5.5.6 Cohen-Coon yöntemi ile PID parametrelerinin hesaplanması ... 106

5.5.7 pH’ın PID kontrolu ... 107

5.5.9 Kademeli pH kontrol deneyleri ... 111

5.5.10 S.cerevisiae çoğaltılan biyoreaktörde kademeli PID kontrol deneyleri ... 112

5.5.11 Basamak etki deneyinin yenilenmesi durumunda sistem tanımlama çalışmaları ... 119

5.5.11.1 En uygun model parametrelerinin seçimi ... 119

5.5.12 Teorik PID kontrol çalışmaları ... 123

5.5.13 Kendinden ayarlamalı (Self-Tuning) PID kontrol benzetimi ... 125

5.5.13 PID ve kendinden ayarlamalı PID benzetim sonuçlarının karşılaştırılması ... 128

(10)

5.5.14 Dinamik deney ve deneysel PID kontrol sonuçlarını karşılaştırılması ... 128

5.6 FTIR Analizleri ... 130

6. DEĞERLENDİRME ... 132

KAYNAKLAR ... 136

ÖZGEÇMİŞ ... 140

(11)

SİMGELER DİZİNİ

AGOPOD GOPOD reaktifi absorbansı

AR Reaksiyon absorbansı

AB Blank absorbansı

CX Mikroorganizma derişimi e(t) Gürültü Kc PID için oransal sabit M Molarite rpm Karıştırma hızı (devir/dk)

t Zaman ( s, dk veya st)

u (t) Ayarlanabilen değişken (Baz akış hızı, ml/s)

y (t) Çıkış değişkeni (pH)

τı PID için integral sabiti (s)

τD PID için türevsel sabit (s)

µ Özgül çoğalma hızı (st-1)

T Toplam glukan + oligomerler vb.

α α-glukan + oligomerler vb.

ε(t) Tahmin hatası

θ Ölü zaman (s) τ Zaman sabiti (s) K Proses kazancı z-1 Geriye kaydırma operatörü η β-glukan verimi

Kısaltmalar

ARMAX Auto Regressive Moving Average with Exogenous CFU Koloni oluşturabilen ünite sayısı

ISE Integral of the Squared Error ITSE Time multiplied by the Squared Error PID Proportional–Integral–Derivative Control

HPAEC High-performance Anion Exchange Chromatography CCD Central Composite Design

(12)

ŞEKİLLER DİZİNİ

Şekil 3.1 α-D-glikoz ve β-D-glikoz yapıları ... 11

Şekil 3.3 (a) β-(1→3),(1→6) ve (b) β-(1→3),(1→4) glukan yapıları ... 12

Şekil 3.4 Maya hücre duvarı yapısı ... 14

Şekil 3.5 t anında giriş değişkeni u(t), çıkış değişkeni y(t) ve gürültü e(t) içeren dinamik bir sistem ... 25

Şekil 3.6 Sistem tanımlama akış diyagramı (Ljung1987) ... 27

Şekil 3.7 Yinelemeli parametre hesaplama yönteminin şematik gösterimi (Akay 1998) ... 32

Şekil 3.8 Proses reaksiyon eğrisi üzerinden Eğri Geçirme yöntemiyle parametre belirleme……….. ... 37

Şekil 3.9 Doğrusal Regresyon ile birinci mertebeden ölü zamanlı model parametrelerinin grafiksel olarak eldesi. ... 38

Şekil 3.10 Smith (1972) tarafından önerilen yöntemle parametre hesabı …………. ... 39

Şekil 3.11 PID kontrol sisteminin blok diyagramı ... 42

Şekil 3.12 Self- tuning kontrol sisteminin blok diyagramı ... 44

Şekil 3.13 Yanıt yüzey yönteminin şematik olarak gösterimi ... 53

Şekil 4.2 β-glukan analizi için uygulanan Antron-H2SO4 Metodu ... 62

Şekil 4.3 Deney düzeneği ... 68

Şekil 4.4 Visidaq paket programı Task Designer penceresi ... 71

Şekil 4.5 Visidaq paket programı Display Designer penceresi ... 72

Şekil 5.1 Kuru maya kalibrasyon grafiği ... 74

Şekil 5.2 2011, 2012, 2013 yıllarında ve liyofilize halden yeni canlandırılan maya derişimlerinin zamanla değişimi ... 75

Şekil 5.3 2011 yılına ait mayanın özgül çoğalma hızı grafiği ... 75

Şekil 5.4 2012 yılına ait mayanın özgül çoğalma hızı grafiği ... 76

Şekil 5.5 2013 yılına ait mayanın özgül çoğalma hızı grafiği ... 76

Şekil 5.6 Liyofilize halden yeni canlandırılan mikroorganizmanın özgül çoğalma hızı grafiği...77

Şekil 5.7 2011, 2012, 2013 yıllarında canlandırılmış ve liyofilize halden yeni canlandırılan mikroorganizmaların özgül çoğalma hızlarının karşılaştırılması ... 77

Şekil 5.8 2011, 2012, 2013 yıllarında canlandırılmış ve liyofilize halden yeni canlandırılan mayanın canlı hücre sayısının zamanla değişimi... 78

Şekil 5.9 Antron-H2SO4 Metodu için glikoz derişimi-absorbans kalibrasyon grafiği ... 79

Şekil 5.10 Farklı beta-glukan içeriğine sahip örneklerin Antron-H2SO4 ve Enzimatik Analiz sonuçları arasındaki ilişki ... 82

(13)

Şekil 5.11 pH (X1) ve sıcaklığın(X2) β-glukan içeriğine etkisi ... 85

Şekil 5.12 Sorbitol (X5) kodlanmış değişkeni 0 merkez noktasında iken EDTA (X3) ve CaCl2 (X4) katkı maddelerinin β-glukan içeriğine etkisi ... 87

Şekil 5.13 EDTA (X3) kodlanmış değişkeni 0 merkez noktasında iken Sorbitol (X5) ve CaCl2 (X4) katkı maddelerinin β-glukan içeriğine etkisi ... 88

Şekil 5.14 CaCl2 (X4) kodlanmış değişkeni 0 merkez noktasında iken Sorbitol (X5) ve EDTA(X3) katkı maddelerinin β-glukan içeriğine etkisi ... 88

Şekil 5.15 β-glukan içeriğinin, EDTA’nın kodlanmış değerleri cinsinden derişimiyle değişimini veren regresyon modelinin grafiksel gösterimi ... 92

Şekil 5.16 pH’ın eklenen 3M H3PO4 hacmi ile değişimi ... 96

Şekil 5.17 pH’ın eklenen 1.5 M H3PO4 hacmi ile değişimi ... 97

Şekil 5.18 pH’ın eklenen 0.5 M H3PO4 hacmi ile değişimi ... 97

Şekil 5.19 pH’ın eklenen 0.05 M H3PO4 hacmi ile değişimi ... 98

Şekil 5.20 pH’ın eklenen 0.01M H3PO4 hacmi ile değişimi... 98

Şekil 5.21 pH’ın eklenen 0.5M H3PO4 hacmi ile değişimi ... 99

Şekil 5.22 pH’ın eklenen 0.1M H3PO4 hacmi ile değişimi ... 100

Şekil 5.23 pH metreden okunan gösterge değeri ile sinyal değerinin kalibrasyon grafiği...101

Şekil 5.24 Baz pompası için sinyal değeri ile akış hızının kalibrasyon grafiği ... 101

Şekil 5.25 Asit pompası için sinyal değeri ile akış hızının kalibrasyon grafiği ... 102

Şekil 5.26 Mikroorganizma çoğalması boyunca dinamik işletimde pH değişimi ... 103

Şekil 5.27 Mikroorganizma çoğalması boyunca dinamik işletimde mikroorganizma derişimi değişimi ... 103

Şekil 5.28 Mikroorganizma çoğalması boyunca dinamik işletimde mayanın β-glukan içeriğindeki değişim ... 104

Şekil 5.29 pH=4.8 değerinde 0.02 ml/s sabit asit akış hızında yatışkın koşulda işletilen sistemde baz akış hızına 0.009 ml/s’den 0.03 ml/s’e basamak etki verilmesi durumunda sistemin cevabı ... 104

Şekil 5.31 Doğrusal Regresyon Yönteminin grafiksel gösterimi ... 106

Şekil 5.32 (a) Eğri Geçirme (b) Doğrusal Regresyon ve (c) Smith Yöntemleri kullanılarak hesaplanan model parametrelerinden Cohen Coon Yöntemiyle belirlenen PID parametreleriyle gerçekleştirilen pH kontrol çalışmaları ... 108

Şekil 5.33 Çoğalma ortamı pH kontrolu deneme-yanılma çalışmaları (a) KC=0.15, KI=0.643 ve KD=0.525 (b) KC==1.5, KI=0.643 ve KD=0.525 ... 110

Şekil 5.34 S.cerevisiae çoğaltılan biyoreaktörde kademeli değişen set değerinde PID kontrol deneyi-1 için kontrollü ve ayar değişkeninin zamanla değişimi ... 113

Şekil 5.35 S.cerevisiae çoğaltılan biyoreaktörde kademeli değişen set değerinde PID kontrol deneyi-2 için kontrollü ve ayar değişkeninin zamanla değişimi…...114

(14)

Şekil 5.36 S.cerevisiae çoğaltılan biyoreaktörde kademeli değişen set değerinde PID kontrol deneyi-3 için kontrollü ve ayar değişkeninin zamanla değişimi ... 115 Şekil 5.37 S.cerevisiae çoğaltılan biyoreaktörde kademeli değişen set değerinde

PID kontrol deneyi-4 için kontrollü ve ayar değişkeninin zamanla değişimi ... 116 Şekil 5.38 Kademeli değişen set noktasında gerçekleştirilen PID ile pH kontrol

deneylerinde ulaşılan β-glukan verimleri ... 117 Şekil 5.39 Çoğalma ortamına 0.029 ml/s sabit akış hızında asit beslendiği durumda

baz akış hızına verilen pozitif basamak etki için pH’ın zamanla değişimi ... 117 Şekil 5.40 Mikroorganizma çoğaltılan biyoreaktörde kademeli değişen set değerinde

pH’ın PID ile kontrolü ... 119 Şekil 5.41 Kademeli değişen set değerinde pH’ın PID ile kontrolü boyunca

mikroorganizma derişimin zamanla değişimi ... 119 Şekil 5.42 Pozitif basamak etki durumunda na=2 nb=1model yapısı için sistemin

cevabı...120 Şekil 5.43 Pozitif basamak etki durumunda na=2 nb=2model yapısı için sistemin

cevabı...121 Şekil 5.44 Pozitif basamak etki durumunda na=3 nb=2model yapısı için sistemin

cevabı...122 Şekil 5.45 Kademeli set noktası değişiminde pH’ın teorik PID kontrolü sonucu pH ve

ayar değişkeninin zamanla değişimleri ... 124 Çizelge 5.24 Kademeli değişen pH set noktası takibinde PID kontrol benzetimi için

performans kriterleri ... 125 Şekil 5.46 Kademeli set noktası değişiminde pH’ın kendinden ayarlamalı PID kontrol

benzetim sonuçları ... 126 Şekil 5.47 Kendinden ayarlamalı PID benzetimi için model parametrelerinin ve kontrol

parametrelerinin değişimi ... 127 Şekil 5.48 Dinamik deney ve pH’ın kademeli değişen set noktasının PID ile kontrolü için

mikroorganizma çoğalması ... 129 Şekil 5.49 S.cerevisiae mayasının hücre duvarından ekstrakte edilen β-glukan

numunesi (kırmızı renkte) ile β-glukan (Sigma) standardının (yeşil renkte) FTIR spektrumları ... 130 Şekil 5.50 S.cerevisiae mayasının hücre duvarından ekstrakte edilen β-glukan

numunesinin (kırmızı), β-glukan (Sigma) standardının (yeşil) ve ticari bir frmadan temin edilen β-glukan hammaddesinin (siyah) FTIR spektrumları ... 131

(15)

ÇİZELGELER DİZİNİ

Çizelge 3.1 Laminarin’e ait fiziksel özellikler ... 13

Çizelge 3.2 Farklı kaynaklardan elde edilen β-glukanlar ve kimyasal yapıları ... 13

Çizelge 3.3 Saccharomyces cerevisiae’nın hücre duvarı makromolekülleri ... 14

Çizelge 3.4 β-glukan kaynakları, yapıları ve biyolojik etkileri ... 16

Çizelge 3.5 Eşitlik 3.9’a göre elde edilen değişik model yapıları ... 28

Çizelge 3.6 Performans kriterleri ... 50

Çizelge 4.1 Katı besi ortamı bileşimi ... 59

Çizelge 4.2 Sıvı besi ortamı bileşimi ... 59

Çizelge 5.1 Antron-H2PO4 metodunda kullanılan β-glukan seviyeleri ve tartılan etken madde miktarı ... 80

Çizelge 5.2 Enzimatik analiz metodunda kullanılan β-glukan seviyeleri ve tartılan etken madde miktarı ... 81

Çizelge 5.3 Farklı derişimlerde β-glukan içeren örneklerin Antron-H2SO4 Metodu ve Enzimatik Analiz Metodu ile elde edilen analiz sonuçları ... 81

Çizelge 5.4 β-glukan içeriğinin artırılması amacıyla S.cerevisiae mayasının çoğalma ortamının sıcaklık ve başlangıç pH değerleri için oluşturulan CCD Matrisi ... 83

Çizelge 5.5 Çoğalma ortamının sıcaklık ve başlangıç pH değerleri için oluşturulan CCD tasarım matrisine göre yapılan deneylerin koşulları ve sonuçları ... 84

Çizelge 5.6 β-glukan içeriğini artırmak üzere çoğalma ortamına eklenecek katkı maddelerinin etkisinin incelenmesi için oluşturulan CCD Matrisi... 86

Çizelge 5.7 Çoğalma ortamına eklenecek katkı maddelerinin etkisinin incelenmesi için oluşturulan CCD tasarım matrisine göre yapılan deney koşulları ve sonuçları ... 86

Çizelge 5.8 Çoğalma ortamına eklenecek katkı maddelerinin etkisinin incelenmesi için oluşturulan CCD tasarım matrisine göre yapılan deney koşulları ve sonuçları ... 90

Çizelge 5.9 CaCl2’ün marjinal etkisini incelemek amacıyla oluşturulan CCD matrisi ... 90

Çizelge 5.10 Sorbitol’ün marjinal etkisini incelemek amacıyla oluşturulan CCD matrisi ... 90

Çizelge 5.11 EDTA’nın marjinal etkisinin incelenmesi için oluşturulan CCD tasarım matrisine göre yapılan deney sonuçları... 90

Çizelge 5.12 CaCl2’ ün marjinal etkisinin incelenmesi için oluşturulan CCD tasarım matrisrisine göre yapılan deney sonuçları ... 91

Çizelge 5.13 Sorbitol’ ün marjinal etkisinin incelenmesi için oluşturulan CCD tasarım matrisrisine göre yapılan deney sonuçları ... 91

(16)

Çizelge 5.14 β-glukan içeriğinin katkı maddelerinin marjinal etkilerini veren

regresyon modelleri ... 92 Çizelge 5.15 pH kontrolsüz ve pH kontrollü deneylerde maya çoğalması boyunca

pH’ın değişimi ... 94 Çizelge 5.16 pH kontrollü ve pH kontrolsüz deneylerde biyotepkime süresince maya

derişimin değişimi... 94 Çizelge 5.17 pH Kontrollü ve pH Kontrolsüz koşullarda çoğaltılan mayanın β-glukan

içerikleri ... 95 Çizelge 5.18 Otoklavlanmış ve otoklavlanmamış sıvı besi ortamlarının pH

değerlerini ayarlamak için harcanan asit miktarı ... 99 Çizelge 5.19 Cohen-Coon ile hesaplanan PID parametreleri ... 107 Çizelge 5.20 Üç farklı yaklaşıma göre belirlenen model parametrelerinden

hesaplanan kontrol parametreleri ile gerçekleştirilen deneysel PID

kontol deneyine ait ISE ve ITSE performans kriterleri ... 108 Çizelge 5.21 Kademeli olarak elle pH değerlerinin ayarlanma zamanları ve ayarlanan

pH değerleri ... 112 Çizelge 5.22 Kademeli olarak elle pH değerlerinin ayarlandığı deneye ait maya ve β-

glukan sonuçları ... 112 Çizelge 5.23 Farklı model derecelerindeki ARMAX model yapıları için ISE değerleri ... 123 Çizelge 5.24 Kademeli değişen pH set noktası takibinde PID kontrol benzetimi için

performans kriterleri ... 123 Çizelge 5.25 PID ve kendinden ayarlamalı PID kontrol benzetimlerinin performans

kriterleri ... 123 Çizelge 5.26 Dinamik deney ve on-line kademeli PID kontrol deneyinin β-glukan

verimi yönünden karşılaştırılma ... 123 Çizelge 5.27 FTIR spektrumuna göre β-glukan yapı karakterizasyonu ... 131

(17)

1. GİRİŞ

Son yıllarda bazı besinlerin doğal yollardan hastalıkların önlenmesi ve tedavisindeki etkinliğinin bilimsel olarak ispatlanması, sağlığımızın korunmasında beslenme desteğinin önemini arttırmıştır. Bu sebeple, fonksiyonel besinler, nutrasötikler ve doğal sağlık ürünleri daha fazla tüketilir hale gelmiştir. Bu ürünlerden birisi de β-glukandır.

Beta glukan (β-glukan), ilk kez 1960 yılında ABD'de Tulane Üniversitesinde Prof. Dr.

Nicolas Di Luzio tarafından tanımlanmış ve bağışıklık sistemi üzerindeki etkileri gösterilmiştir. β-glukan, sağlık üzerindeki olumlu etkileri nedeniyle ABD'de FDA (Food Drug Administration) ve Avrupa'da EFSA (European Food Safety Administration) gibi gıda denetim kuruluşları tarafından onay almış, yan etkisi olmayan ve ilaçlarla birlikte kullanıldığında etkileşime girmeyen bir maddedir. Dünyada, başta ABD olmak üzere Kanada, İngiltere, Norveç, İsviçre gibi ülkelerde beslenme desteği olarak OTC (over the counter) ürün kategorisinde kullanılırken, Japonya'da bazı mantar türlerinden elde edilen β-glukanlar ilaç kategorisinde bulunmaktadır. Sağlık alanındaki olumlu etkilerinden yararlanılarak beslenme desteği veya ilaç olarak kullanılan β-glukan krem yapımında, yem endüstrisinde ve mayonez yapımında da kullanılmakta olan bir üründür.

Yulaf başta olmak üzere çeşitli tahıllar, ekmek mayası (Saccharomyces cerevisiae), mantarlar (Coriolus versicolor, Lentinus edodes, Schizophyllum commune) ve bazı bakteriler (Agrobacterium sp., Alcaligenes faecalis) β-glukan kaynağı olarak kullanılabilmektedir. Beta glukan, kaynağına göre (1,3), (1,4) ve (1,3), (1,6) bağlantı noktalarına sahip, β-glikozidik bağlarıyla bağlı olarak kısa ve orta uzunluktaki zincirlerden oluşan polisakkarit formlarında bulunur. β-glukanın bu formları arasında ne tür farklılıklar olduğu henüz kesin olarak bilinmemekle birlikte tahıl temelli β- glukanlar, β-(1⟶3),(1⟶4) bağları içermekte olup, suda çözünme özelliklerinden dolayı insan beslenmesinde çözünür lif desteği olarak önemli rol oynamaktadırlar.

Ekmek mayası veya mantardan elde edilen β-(1⟶3),(1⟶6) bağları içeren β- glukanların ise bağışıklık sistemini güçlendirici etkisinden faydalanılmaktadır. Maya kaynaklı suda çözünmeyen β-glukanların bağışıklık sistemi üzerindeki olumlu etkilerinin yanı sıra pek çok iyileştirici ve hastalık önleyici etkisi olduğu bilinmektedir.

(18)

Mayalar, ucuz temin edilebildikleri ve hücre duvarları yeterince yüksek β-glukan içeriğine sahip olabildiklerinden dolayı β-glukan üretimi için ideal hammadde olarak kullanılabilirler. Ayrıca yapılan çalışmalar, maya kaynaklı β-glukanların en etkili bağışıklık sistemi koruyucu maddesi olduğunu göstermektedir. Ekmek mayası olarak bilinen S.cerevisiae mayasının hücre duvarı önemli bir β-glukan kaynağıdır (Kim ve Yun 2006).

Hücre duvarı yapısı ve bileşimi mayanın çoğalma koşullarına sıkı bir biçimde bağlıdır.

Bununla birlikte mayanın kuru ağırlığı ve polisakkarit bileşiminin çoğalma ortamındaki karbon kaynağı, azot kısıtlaması, sıcaklık, pH ve havalandırma gibi işletim koşullarına ve biyoreaktör işletim türüne bağlı olarak %50’den fazla oranda değişim gösterebildikleri bilinmektedir Mayanın çoğaltıldığı ortamın pH’ı çoğalma ve ürün oluşumu üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. Bu nedenle maya çoğalması boyunca ürün oluşumu için uygun pH’ın belirlenmesi ve kontrolu büyük önem taşımaktadır (Uscanga ve François 2003).

Bu tez çalışması kapsamında, β-glukan kaynağı olarak seçilen S.cerevisiae (ekmek mayası) mikroorganizmasının çoğalma koşulları incelenmiş olup β-glukan üretim verimi açısından optimum sıcaklık ve pH değerleri belirlenmiştir. Çalışmalara ilk olarak, S.cerevisiae mayasının β-glukan içeriğini arttırmadaki önemli basamaklardan biri olan maya seçimi ile başlanmıştır. Farklı yıllarda katı besi ortamına aktarımları gerçekleştirilmiş olan mayalar ile liyofilize halden yeni canlandırılan mayanın aktiviteleri ve β-glukan içerikleri öçülerek uygun maya seçilmiştir.

S.cerevisiae’nın (ekmek mayası) β-glukan içeriğinin arttırılması amacıyla optimizasyon çalışmalarında deney tasarımı, az sayıda deneyle çok sayıda verinin toplanabilmesine olanak tanıyan ve birkaç parametrenin etkili olduğu sistemlerde parametrelerin birbiri üzerindeki etkilerinin ortaya konulmasını sağlayan bir istatistiksel optimizasyon yöntemi olan Merkezi Birleşik Tasarım (Central Composite Design) ile yapılmıştır. Bu amaçla gerçekleştirilen deney sonuçları “Yanıt Yüzey Yöntemi” (Response Surface

Methodology) kullanılarak değerlendirilmiştir. Değerlendirme sonucu en yüksek β-glukan içeriği açısından çoğalma ortamının optimum sıcaklık ve pH değerleri

(19)

bulunmuştur. Daha sonra belirlenen optimum sıcaklık ve pH değerlerlerinde çoğaltılan S.cerevisiae’nın β-glukan içeriği üzerine çoğalma ortamına eklenen katkı maddelerinin

etkisinin incelenmesiyle devam edilmiştir. Literatürden elde edilen bilgilere göre β-glukan içeriğini arttıracağı düşünülen EDTA (etilendiamin tetra asetik asit), CaCl2

(kalsiyum klorür) ve sorbitol olmak üzere 3 farklı katkı maddesinin etkisi incelenmiştir.

Merkezi Birleşik Tasarım yöntemi ile deney tasarımına uygun gerçekleştirilen deneyler sonucunda katkı maddelerinin üçünün birlikte kullanıldığı durumda β-glukan içeriğini arttıran bir etkisi olmadığı keşfedilmiştir. Buna istinaden katkı maddelerinin marjinal etkileri incelenerek sonuçlar tekrar değerlendirilmiştir.

β-glukan, geliştirilen alkali-asidik ekstraksiyon metodu ile S.cerevisiae hücre duvarından fiziksel ve kimyasal işlemler uygulanarak ekstrakte edilmiştir (Donsis 1993). Ekstraksiyon sonunda elde edilen β-glukan, glikoz içeriği üzerinden Antron- H2SO4 Metodu ile UV spektrofotometrede absorbans ölçümüne dayalı olarak belirlenmiştir. Antron-H2SO4 metodunun yanı sıra ticari olarak edinilen Enzimatik Analiz Kiti (Megazym) ile de β-glukan analizi gerçekleştirilmiştir. Her iki yöntem, avantaj ve dezavantajları yönünden karşılaştırılmıştır.

On-line kontrol çalışmalarına başlamadan önce, pH kontrolunun S.cerevisiae mayasının β-glukan içeriğini nasıl etkileyeceğini incelemek için maya çoğalması boyunca pH’ın kontrol edilmediği ve pH’ın kontrol edildiği durumlar için ölçek büyütme adımları uygulanarak inkübatörde, 500 ml’lik erlen biyoreaktörlerde kademeli değiştirilen set değerlerinde elle (manuel) pH kontrol deneyleri gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma sonucunda β-glukan içeriğini artırmak üzere pH’ın mikroorganizma çoğalması boyunca kontrolunun gerekliliği ve bu kontrolün nasıl bir set profilini takip edecek şekilde gerçekleştirileceği belirlenmiştir.

İnkübatördeki kontrol deneylerinin ardından biyoreaktörde kontrol çalışmalarına geçilmiştir. Bu amaçla, kontrol çalışmalarında kullanılacak asit-baz çifti ve derişimleri belirlenmiştir. Ardından sistemin yatışkın koşula ulaşması için sisteme on-line olarak bağlı olan baz pompası ve manuel olarak beslenen asit akış hızlarının ne olması gerektiği tespit edilmiştir.

(20)

PID kontrol parametreleri, yatışkın hale getirilen sistemde pozitif basamak etki durumunda girdi-çıktı ilişkisi belirlenerek hesaplanmıştır. Cohen-Coon yöntemi ile hesaplanan parametreler ADVANTECH VISIDAQ paket programındaki Visual Basic dilinde kodlanan algoritmaya yazılarak biyoreaktör sisteminde sabit set noktasında pH kontrolü PID ile gerçekleştirilmiş ve deney sonuçları yorumlanarak kontrol parametreleri optimize edilmiştir.

Matlab programlama dilinde kodlanan PID ve kendinden ayarlamalı PID kontrol yöntemleri kullanılarak prosesin pH kontrol benzetimi gerçekleştirilmiş her iki kontrol yönteminin başarısı ISE ve ITSE performans kriterleri yönünden karşılaştırılmıştır.

Kendinden ayarlamalı PID kontrol algoritmasında yer alan sistem modelinin mertebesi na= 2, nb=1 olan ARMAX model olarak belirlenmiştir.

Çalışma boyunca S.cerevisiae hücre duvarından ekstrakte edilen β-glukanın yapı karakterizasyonu FTIR analizleri ile sağlanmıştır. Sonuç olarak IR spektrumları ile β- glukanın karakteristik bağ yapıları doğrulanmış ve uyumluluğu referans standartla karşılaştırılarak desteklenmiştir.

Bu yüksek lisans tez çalışması, Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi tarafından 13L4343005 numaralı proje kapsamında desteklenmiştir.

(21)

2. KAYNAK ARAŞTIRMASI

Bu bölümde maya çoğalma ortamının ve maya hücre duvarından ekstraksiyonu için kullanılan yönteminin β-glukan üretim verimine etkisinin incelenmesi ile ilgili yapılan çalışmalara ve çoğalma ortamının pH değerini kontrol etmek amacıyla kullanılan PID ve Kendinden Ayarlamalı PID (Self-tuning PID) kontrol yöntemlerinin uygulamalarına ilişkin çalışmalara yer verilmiştir.

2.1 S.cerevisiae Çoğalma Koşullarının β-glukan Üretimine Etkisinin İncelendiği Kaynaklar

Manners vd. (1973), Saccharomyces cerevisiae hücre duvarından glukanı ekstrakte ederek, bu yapıdaki ana bileşenin (~%85’i) β-(1→3) glukan oluğunu tespit etmişlerdir.

Yüksek molekül ağırlığına sahip β-(1→3) glukan yapısının, %3 oranında dallanmış β- (1→6) glikozidik bağlar içerdiğini bulmuşlardır. Böylece maya glukanının heterojen bir yapıda olduğunu göstermişlerdir. Maya glukanının hücre duvarından, ekstraksiyonunu, sıcak alkali ve asit çözeltilerini kullanarak gerçekleştirmişlerdir. Yapılan analizler sonucunda β-glukanın yüksek polimerizasyon derecesine (1450±150) sahip olduğunu ve β-glukanın suda çözünürlüğünün düşük olmasından dolayı reaksiyonlarının zor olduğunu ileri sürmüşlerdir. Ayrıca β-(1→6) glikozidik bağlarının dallanma oranının β- (1→3) glukanın çözünürlüğünü arttırdığını belirlemişlerdir.

Fleet ve Manners (1976), Alkali ortamda çözünen β-glukanı, azot gazı altında soğuk seyreltik (%3) NaOH kullanarak S.cerevisiae hücre duvarından altı gün boyunca ekstrakte etmişlerdir. Maya hücre duvarlarını bir homojenizatör ile mekanik olarak parçaladıktan sonra dondurarak kurutmuşlar ve böylece ekstraksiyona hazırlamışlardır.

Alkali ekstraksiyondan sonra nötr hale getirilen çözeltiden hücre duvarının yaklaşık

%20’sini temsil eden alkali çözünür β-glukan ekstraktını jel olarak çöktürmüşlerdir.

Kimyasal analizler sonucunda alkali-çözünür β-glukan örneğinin yüksek oranda β- (1→3) glikozidik bağı içerdiğini, suda çözünmediğini ancak NaOH ve dimetil sülfoksit (DMSO) çözeltilerinde çözünebildiğini tespit etmişlerdir.

(22)

Müller vd. (1997), S. cerevisiae hücre duvarından suda çözünmeyen β-(1→3) glukanları, hidroklorik asit kullanarak ekstrakte etmişlerdir. Bununla birlikte hidroklorik asitin, aşındırıcı ve toksik özelliklere sahip olmasından dolayı β-(1→3) glukanın büyük ölçekli farmasötik ekstraksiyonunda kullanılmasının uygun olmayacağını tespit etmişlerdir. Ekstraksiyon işlemini asetik asit, formik asit ve fosforik asit kullanarak gerçekleştirmişlerdir. Sonuç olarak alkali-asit ekstraksiyonun ikinci basamağı olan asit ekstraksiyonunda hidroklorik asit yerine asetik asit, formik asit ve fosforik asit kullanılması arasında anlamlı bir farklılık olmadığını tespit etmişlerdir. Ekstrakte ettikleri mikropartikül halindeki β-glukanları, farmasötik sınıfında yer alan çözünür β- (1→3) glukan fosfat üretimi için başlangıç materyali olarak kullanmışlardır.

Ferimund vd. (2003), β-glukanın, sıcak alkali ve bazik muamelelerini içeren geleneksel ekstraksiyon metotlarının polimerik zincir bozunmasına neden olduğunu ve ürünün yararlı etkilerini ve verimini azalttığını öne sürmüşlerdir. Bu amaçla glikoz zincirlerinde bozunmaya yol açmayan bir ekstraksiyon yöntemi geliştirmişlerdir. İki maya fabrikasından aldıkları kurutulmuş toz halindeki maya hücre duvarlarının sulu çözeltilerini hazırlayarak yüksek sıcaklıkta 5 saat süre ile bekletmişlerdir. Ardından santrifüjleyerek üst sıvıyı ayırmışlardır. Burada süpernatant emülsiyon görevi gören mannoproteinleri içermektedir. Kalan kısımdaki çözünür proteinleri uzaklaştırmak için proteaz enzimi kullanmışlardır. Enzimatik uygulama sonucu elde ettikleri β-glukan örneklerini asetonla yıkayarak püskürtmeli kurutma (spray-drying) yöntemi ile kurutmuşlardır. Sonuç olarak, uç pH değerleri içermeyen, hassas, basit, hızlı ve büyük ölçeğe uyarlanabilir sıcak su ekstraksiyonu ile %92 saflıkta ve %85 verimde β-glukan üretmişlerdir. Yapı analizlerini NMR spektroskopisinde belirlemişlerdir. Glukan örneklerinin yağ asidi ve glikoz içeriğini gaz kromatografisinde FID dedektör kullanarak belirlemişlerdir. İki ayrı fabrikadan alınan S.cerevisiae hücre duvarlarının analiz sonuçları aynı miktarda glukan içeriğine sahip olmadıklarını göstermiştir. Bu durumun ortaya çıkmasında mayanın çoğalma koşullarının farklılık göstermesinin etkili olduğunu tespit etmişlerdir.

(23)

Uscanga ve François (2003), çeşitli çoğalma koşullarında üretilen Saccharomyces cerevisiae mayasının hücre duvarı polisakkarit bileşimini incelemişlerdir. Maya hücre duvarının β-1,3-glukan, β-1,6-glukan, mannan ve kitin içeriğini belirlemek için enzimatik ve kimyasal metotlar kullanmışlardır. Hücre duvarının kuru ağırlığı ve polisakkarit içeriğinin karbon kaynağı, azot kısıtlaması, pH, sıcaklık, havalandırma ve işletim türü ile değişebildiğini bulmuşlardır. Maya hücrelerini, besin kısıtlamasının olmadığı üstel fazın erken evrelerinde besi ortamından ayırmışlardır. Şekerler üzerinden miktar tayini içinβ-glukan ve mannanın asit hidrolizini gerçekleştirmişlerdir. Glikoz ve mannoz miktarları, Yüksek Performanslı Anyon Değiştirme Kromatografisi (HPAEC) ile belirlenmiştir. Çoğalma ortamı pH değerinin 4 olduğu durumda en yüksek β-glukan içeriğine ulaşmışlardır. Farklı sıcaklıkların polisakkarit bileşimine etkisi incelendiğinden yüksek β-glukan içeriğine 37 °C’de ulaşmışlardır.

Kim ve Yun (2006), farklı işletim türlerinde (sürekli, kesikli ve yarı kesikli) maya çoğalmasının hücre duvarı bileşimine etkisini araştırmışlardır. S. cerevisiae mayası, 5L’lik biyoreaktörde, 30°C’de ve 2.5 L’lik çalışma hacminde pH=3.5’de kontrol edilerek çoğaltılmıştır. Dondurarak kurutulmuş maya hücrelerini özel tasarlanmış bir sistemle parçaladıktan sonra çözünür β-glukanı sıcak alkali ekstraksiyonla elde etmişlerdir. β-glukan miktarını HPLC ile belirlemişlerdir. Ayrıca çoğalma evrelerinde β-glukan içeriğini β-glukanaz enzimine karşı direncin ölçülmesi ile tespit etmişlerdir.

Kesikli ve sürekli işletimde, hücrelerin durağan faza ulaşana kadar β-glukanaza karşı direncinde artış olduğunu, durağan fazın bitiminde ise direncin azaldığını bulmuşlardır.

Bu durum β-glukan içeriğinin durağan fazın erken evrelerinde en yüksek olduğunu göstermektedir. Yarı-kesikli işletimde ise en yüksek β-glukan içeriğine ulaşmışlardır.

Jaehrig vd. (2008), son yıllarda antioksidan özellik gösterdiği bilinen β-glukanı, farklı ortamlarda geliştirilen S. cerevisiae hücre duvarından ekstrakte ederek antioksidan aktivitesini araştırmışlardır. Maya çoğalmasında ana karbon kaynağı maltoz, glikoz ve galaktoz olan üç farklı besi ortamı kullanmışlardır. Çoğalma prosesi boyunca sıcaklığı 25°C’de, pH ≥ 4 olacak şekilde kontrol etmişlerdir. Maya hücrelerini parçaladıktan sonra β-glukanı, sıcak su ekstraksiyonu ve enzimatik işlemlerin sonunda elde etmişlerdir. Maya hücrelerinin beta glukan içeriğini “Megazym Yeast Beta Glucan

(24)

Assay Kit” ile enzimatik olarak, antioksidan aktivitesini ise Elektron Paramanyetik Rezonans (EPR) spektroskopisi ile belirlemişlerdir. Çalışmanın sonunda, en yüksek β- (1→3),(1→6) glukan içeriğini, karbon kaynağının glikoz olduğu ortamda bulmuşlardır.

Böylece, beta glukan içeriği ve antioksidan kapasitesi arasındaki önemli farklılıkların mayaların farklı ortamlarda geliştirilmesine bağlı olduğunu kanıtlamışlardır.

Shokri vd.(2009), β-glukanın ekstraksiyonu ve saflaştırılması için optimal bir prosedür geliştirmişlerdir. Besi ortamında çoğaltılan S.cerevisiae maya hücrelerini sonikasyon ile parçalayarak hücre duvarı materyalini oluşturmuşlar, ardından alkali ekstraksiyonla çözünür β-glukanı elde etmişlerdir. Hücre duvarının düşük verimde elde edilmesinin, hücre parçalama yöntemine ve kullanılan maya suşuna bağlı olduğunu tespit etmişlerdir.

Yılmaz (2010), Atık ekmek mayasından β-glukan izolasyonu ve saflaştırılmasına farklı koşulların etkisini araştırmıştır. NaOH derişimi, ekstraksiyon sıcaklığı, süresi, yıkama sayısı ve uygulama basamaklarına göre protein içeriğinin ve dolayısıyla da β-glukan saflığının değiştiği tespit edilmiştir. β-glukan veriminin ise alkali ekstraksiyonda kullanılan bazın derişimine, ekstraksiyon süresine ve sıcaklığına bağlı olarak değişebileceğini belirtilmiştir.

Mongkontanawat vd. (2011), S.cerevisiae mayasının besi ortamına eklenen katkı maddelerinin mikroorganizma çoğalma hızına ve miktarına etkisini araştırmışlardır.

Kesikli işletilen bir biyoreaktörde maya çoğalma ortamının optimum koşullarını Mathematica bilgisayar programını kullanarak belirledikten sonra katkı maddelerinin hücre morfolojisi ve β-glukan içeriği üzerine etkisini incelemişlerdir. Besi ortamına eklenen katkı maddelerinin (EDTA, GTP ve florür) β-1,3-glukan sentaz enziminin aktivitesini arttırdığını belirtmişlerdir. Farklı derişimlerdeki EDTA (etilendiamin tetra asetik asit), SDS (sodyum dodesil sülfat) ve NaCl (sodyum klorür) katkı maddeleri varlığında çoğaltılan üç ayrı maya suşunun, enzimatik analiz metodu (Megazym) ile β- glukan içeriklerini ölçmüşlerdir. Katkı maddelerinin S.cerevisiae’dan üretilen β-glukan kalitesi ve fonksiyonel özellikleri üzerinde etkili olduğunu ve üretim veriminin düşük maliyetle arttırılabileceğini göstermişlerdir.

(25)

Galovic vd. (2012), Farklı kurutma yöntemlerinin ve ultasonikasyonun β-glukanın yapısal özellikleri ve agloremasyonu üzerindeki etkilerini incelemişlerdir. S.cerevisiae mayasından ekstrakte edilen β-glukan örneği üzerinde, havada kurutma, dondurarak kurutma ve püskürtmeli kurutma yöntemleri denenmiştir. Püskürtmeli kurutma sonikasyon ile kombinlendiğinde glukanın mikro yapısında minimal değişiklikler gözlenmiş ve aglomerasyon ihmal edilebilir olmuştur.

Novak vd. (2012), Ekmek mayası hücre duvarından izole ettikleri β-glukan içerikli polisakkarit süspansiyonlarını β-glukan filmlerin hazırlanmasında kullanmışlardır.

Biyolojik aktif madde içerikli bu filmler tekstil esaslı malzemeler için alternatif oluşturmaktadır. β-glukan filmlerin yapısal ve fiziksel özelliklerini spektroskopik, enzimatik, termal ve mikroskopik analizlerle belirlemişlerdir.

2.2 PID ve Kendinden Ayarlamalı (Self-tuning) PID Kontrol Çalışmalarını İçeren Kaynaklar

Lin vd. (2011), NMR spektroskopisinde sistem performansını düzeltmek için yeni bir pnömatik kontrol sistemi geliştirilmiştir. NMR spektroskopisinde, örneklerin dönüşünü düzenlemek için kullanılan geleneksel PID kontrol, uzun ayar süresi, kararlı hal hatası nedeniyle nesnenin doğrusal olmayan bir karakter sergilemesine neden olmaktadır.

Bunun için PID kontrol yönteminin yerine fuzzy self-tuning PID kullanılmıştır.

Deneyler sonucu kullanılan kontrol yöntemi hızlı tepki ve dayanıklılık gibi üstün özellikler göstermiştir.

Tajjudin vd. (2012), Bir buhar damıtma prosesinde, buhar sıcaklığı kontrolünde geleneksel PID kontrol yöntemini, self-tuning PID yöntemi ile karşılaştırmışlardır.

Karşılaştırmalar, bozucu etkilerle set noktasındaki değişikliklerin Matlab simülasyonu ile değerlendirilmesi sonucu yapılmıştır. Her iki kontrol yöntemi de tatmin edici yanıtlar vermiştir ancak IAE indeksi self-tuning PID kontrol yönteminin daha üstün performans sağladığını göstermiştir.

(26)

Yang vd. (2012), PLC kontrol edicilerde daha iyi bir kontrol performansı elde edebilmek için geleneksel PID kontrol temeline dayalı fuzzy kontrol teknolojisi geliştirilmişlerdir. Sıcaklık kontrol sistemleri, doğrusal olmayan, büyük gecikmeli ve eylemsizlik ile ifade edilir. Bu sistemlerde doğru matematiksel modellerin oluşturulması ve kontrol parametrelerinin sabitlenmesinin zorluğundan dolayı hassas bir kontrol gerçekleştirilememektedir. Fuzzy teknolojisinin dinamik performans özellikleri geleneksel PID nin avantajları ile birleştirilince yüksek hassasiyet ve kararlıkta bir kontrol sağlanmıştır.

Coelho (2009), Otomatik sesli yanıt sistemlerinde kullanılan PID kontrol edici sisteminde kontrol parametrelerini belirlemek amacıyla Lozi harita üzerinde temel kaos optimizasyon yaklaşımı uygulamışlardır. Sayısal simulasyon sonuçları, PID kontrolün otomatik sesli yanıt sisteminde iyi bir performans gösterdiğini belirtmektedir.

Zheng vd. (2009), Yapılan çalışmada SRM (Switched Reluctance Motor) sisteminde yer alan ses kontrolü sağlanmasında self-tuning PID kontrol zaman değişiminine istinaden zaman gecikmesinin önüne geçilmesi amacıyla çalışmışlardır. Simülasyonlar ve deneysel çalışmalar kontrol performansını test etmek ve etkinliğini değerlendirmek amacıyla uygulanmıştır. Self-tuning PID kontrolün cihazın genel performansını geleneksel kontrol yöntemlerine oranla daha yüksek seviyede arttırdığı tespit edilmiştir.

Boling vd. (2007), Doğrusal olmayan pH nötralizasyon prosesinde çok modelli adaptif kontrol sistemi kullanmışlardır. Çok modelli self-tuning PID konrol edicinin sağlamlık ve performans özellikleri diğer geleneksel kontrol edicilerle kıyaslanmıştır. Yapılan simülasyon deneyleri sonucu geleneksel kontrol yöntemleri ile kıyaslandığında adaptif kontrol edicinin geniş aralıklarda gözlenen ölçüsüz bozukluklarda oldukça etkili olduğu ancak ani değişimlere karşı yanıtın yavaş olduğu gözlenmiştir.

(27)

3. KURAMSAL TEMELLER

3.1 β-glukanın Yapısı ve Özellikleri

β-glukan, genel formülü (C6H10O5)n olan, β-glikozidik bağlarla birbirine bağlanmış D- glikoz monomerlerinden oluşan bir polisakkarit molekülüdür. Alfa ve beta olmak üzere iki tipte bulunan glikozidik bağın tipini, C-1’deki –OH grubunun pozisyonu belirlemektedir. Eğer anomerik karbonun hidroksil grubu CH2OH grubuna göre trans konumundaysa, şeker bir alfa anomeridir. Eğer anomerik karbonun hidroksil grubu CH2OH grubuna göre cis konumundaysa, şeker bir beta anomeridir. Bir başka deyişle glikoz molekülü, C-1'e bağlı olan hidroksil grubunun halka düzleminin altında olduğu durumda α; halka düzleminin üstünde olduğu durumda ise β yapısında bulunmaktadır.

C-1’deki –OH grubunun pozisyonu α pozisyonu ise α-glikozidik bağ, β pozisyonu ise β- glikozidik bağ oluşmaktadır. Alfa glikozidik bağlarla bağlanmış moleküller, metabolizmada kolayca değişirken, beta glikozidik bağlar bağ yapısını daha da güçlendirirler.

Şekil 3.1 α-D-glikoz ve β-D-glikoz yapıları

Şekil 3.2 β-glikozidik bağ yapısı

(28)

β-glukanlar doğada, kaynağına göre (1→3),(1→4) ve (1→3),(1→6) bağlı olarak kısa ve orta uzunluktaki zincirlerden oluşan polisakkarit formlarında bulunmaktadır. Farklı bağlantı yerlerinin görüldüğü molekül formları şekil 3.3’de yer almaktadır. β-glukan molekülündeki bu bağlantılar lineer β-(1→3), dallanmış β-(1→3),(1→6), halkalı β-(1→3),(1→6) ve lineer β-(1→3),((1→4) konfigürasyonlarında bulunabilmektedir.

(a)

(b)

Şekil 3.3 a. β-(1→3),(1→6) ve b. β-(1→3),(1→4) glukan yapıları

Bağlantı yerleri arasındaki farklılıklardan ve farklı kaynaklarda farklı bağlantı formlarında bulunmasından dolayı β-glukan molekülünün fiziksel ve kimyasal özellikleri net olarak tespit edilememiştir. Bununla birlikte çizelge 3.1’de kahverengi alglerden elde edilen ve yan zinciri dallanmış β-(1→3),(1→6) bağ yapısına sahip, ticari olarak “laminarin” olarak adlandırılan β-glukan molekülüne ait belirlenen bazı fiziksel ve kimyasal özellikler yer almaktadır.

(29)

Çizelge 3.1 Laminarin’e ait fiziksel özellikler (PPDB 2009)

Sudaki çözünürlük (mg/L) 301500

Metanolde çözünürlük (mg/L) 60

Asetonda çözünürlük (mg/L) 21

Erime Noktası (°C) Bozunuyor

Kaynama Noktası (°C) Bozunuyor

Buhar Basıncı (25 °C’ de) (mPa) 2.60 x 10-2

Henry Sabiti (20 °C ‘de) 1.79 x10-11

3.2 β-glukan Kaynakları

Yulaf başta olmak üzere çeşitli tahıllar, mantarlar, bazı bakteriler ve algler hücre duvarı bileşeni olarak β-glukan içermektedirler. Çizelge 3.2’de farklı kimyasal bağlantı yerlerine sahip β-glukanların farklı kaynaklarda bulunduğu görülmektedir.

Çizelge 3.2 Farklı kaynaklardan elde edilen β-glukanlar ve kimyasal yapıları (Bacic vd.

2009)

Kimyasal Yapısı Kaynak Bilinen Adı Referans Lineer

β-(1⟶3) Agrobacterium sp. Curdlan Harada et al. (1968)

Dallanmış β-(1⟶3),(1⟶6)

Saccharomyces cerevisae Maya hücre duvarı

glukanı Kollar et al. (1995; 1997) Hearn ve Siestma (1994) Candida albicans

Aspergillus fumigatus

Mantar hücre duvarı glukanı

Lineer β-(1⟶3),(1⟶4)

Hordeum vulgare Avena sativa Triticum vulgare

Tahıl Glukanları

Cui et al. (2000) Lazaridou et al. (2004) Fontaine et al. (2000) Aspergillus fumigatus Mantar Hücre

Duvarı Glukanı Lineer

β-(1⟶3)(1⟶6) glikozil

Laminaria sp. Laminarin Elyakova et al. (1994) Akima et al. (1985) Miyazaki et al. (1974) Zhang et al. (2004) Schizophyllum commune Schizophyllan

Coriolus versicolor Coriolan Lentinus edodes Lentinan β-(1⟶3) glukan +

mannoz+ galaktoz Pleurotus ostreatus Pleuran Chan et al. (2009)

(30)

3.3 β-glukan Kaynağı: S. cerevisiae (Ekmek Mayası)

Mayalar, ucuz temin edilebildikleri ve hücre duvarları yaklaşık %50-55 oranında β- glukan içeriğine sahip olabildiklerinden dolayı β-glukan üretimi için ideal hammadde olarak kullanılabilmektedirler. Ayrıca yapılan çalışmalar maya kaynaklı β-glukanların en etkili bağışıklık sistemi koruyucu maddesi olduğunu göstermektedir (http://www.beslenmedestegi.com, 2012). Ekmek mayası olarak bilinen Saccharomyces cerevisiae mayasının hücre duvarı da önemli bir β-glukan kaynağıdır. Maya kaynaklı β- glukanın kimyasal yapısının β-(1→3), (1→6) bağ yapısına sahip olduğu yapılan NMR spektroskopisi, periyodat oksidasyonu, metilasyon ve enzimatik hidroliz analizleri ile tespit edilmiştir (Manners 1973).

Şekil 3.4 Maya hücre duvarı yapısı

Çizelge 3.3 Saccharomyces cerevisiae’nın hücre duvarı makromolekülleri (Klis vd.

2002)

Makromolekül Kuru ağırlık yüzdesi

Sentezlendiği bölge

Polimerizasyon derecesi

Mannoproteinler 35-40 Salgı yoluyla 200

β-(1,6)-glukan 5-10 Plazma membranı 140

β-(1,3)-glukan 50-55 Plazma membranı 1500

Kitin 1-2 Plazma membranı 190

(31)

Çizelge 3.3 ve şekil 3.4’te görüldüğü gibi maya hücre duvarı glukanlar, mannoproteinler ve kitinden oluşmaktadır. Duvar yapısının ana bileşeni (%50-55) β- glukandır. Bu yapının %85’ini β-(1,3)-glukan ve %3’ünü β-(1,6)-glukan oluşturmaktadır. Hücre duvarının dayanıklılığını sağlayan β-glukanlar mikrofibriler yapıda şekillenmişlerdir. Hücre duvarı β-(1,3) glukan ve kitin tabakası halindedir. Kitin N-asetilglukozamin’in bir polimeridir ve maya hücre duvarlarının yalnızca %2-4 kadarını oluşturur. Bu tabakanın dış yüzeyine mannoproteinler yapışmıştır.

Mannoproteinler hücre geçirgenliğinde önemlidir ve hücre duvarı kuru ağırlığının yaklaşık üçte birini oluşturmaktadır. Hücre duvar proteinleri β-(1,3) glukan-kitin ağına ya dolaylı olarak bir β-(1,6) glukan kısmıyla ya da doğrudan kovalent bağlarla bağlanmaktadır.

3.4 β-glukanın Kullanım Alanları ve Sağlık Üzerindeki Etkileri

1960’larda Dr. Diluzio, Avrupa’da ilaç olarak kullanılan ve kaba bir maya hücre duvarı karışımı içeren Zymosan’ın immün sistemi aktive edici etkisinin β-glukan olduğunu keşfetmiştir. Bağışıklık sistemi üzerinde uyarıcı etkisinin yanı sıra anti-inflamatuar, anti-mikrobiyal, anti-enfektif, anti-viral, anti-tümoral, yara iyileştirici, kolesterol düşürücü, radyoaktif koruyucu, sindirimi düzenleyici özellik gösteren β-glukan, hastalıkların önlenmesi ve tedavisinde doğal destek olarak kullanılmaktadır.

β-glukanların suda çözünürlüğü biyolojik aktivitesini etkilemektedir. Çizelge 3.4’te farklı kimyasal yapıdaki β-glukanların farklı biyolojik etkiler gösterdiği görülmektedir.

Tahıl kaynaklı β-(1⟶3),(1⟶4) yapısındaki glukanlar, suda çözünme özelliklerinden dolayı insan beslenmesinde çözünür lif desteği olarak rol oynamaktadırlar. Tahıllar arasında yulaf yoğun miktarda β-glukan içerir ve kolesterolü düşürme, kan şekerini dengeleme, mide ve bağırsak çalışmasını düzenlemeye yardımcı olur. Suda çözünmeyen, ekmek mayası veya mantardan elde edilen β-(1⟶3)(1⟶6) yapısındaki glukanların ise bağışıklık sistemi üzerindeki etkilerinden yararlanılmaktadır.

Ayrıca β-glukanların kan yapıcı özellik gösterdiği ve sitokin indüksiyonunu sağladığı bilinmektedir. Sitokinler, monositler, makrofajlar ve lenfositler gibi bağışıklık sistemi

Şekil

Updating...

Referanslar

Benzer konular :