SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
DİABETES MELLİTUS’UN YOL AÇTIĞI EREKTİL DİSFONKSİYONDA ASETİLSALİSİLİK ASİT KULLANIMININ KORUYUCU ROLU OLUP
OLMADIĞININ ARAŞTIRILMASI
Uzm.Ecz. Gaye HAFEZ
FARMAKOLOJİ ANABİLİM DALI
DOKTORA TEZİ
DANIŞMAN
Prof. Dr. Serap GÜR
2009-ANKARA
KABUL VE ONAY
Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü
Farmakoloji Doktora Programı
çerçevesinde yürütülmüş olan bu çalışma, aşağıdaki jüri tarafından
Doktora Tezi olarak kabul edilmiştir.
Tez Savunma Tarihi: 27 / 07 / 2009
Jüri Başkanı Prof.Dr.V.Melih ALTAN
Üye
Prof.Dr.Serap GÜR
Üye
Prof.Dr.Zeliha BÜYÜKBİNGÖL
Üye
Prof.Dr. Tuna KARAHAN
Üye
Doç.Dr.F.Tuncay AKI
ÖNSÖZ
İÇİNDEKİLER
KABUL VE ONAY ... II ÖNSÖZ ... III İÇİNDEKİLER ... IV SİMGELER VE KISALTMALAR ... VI ŞEKİLLER ... VIII TABLOLAR ... X
1.GİRİŞ ... 1
1.1.PENISIN ANATOMISI: ... 1
1.2.2. Ereksiyonun Santral Kontrolü: ... 7
1.2.3. Ereksiyonun Periferal Kontrolü: ... 8
1.2.4. Ereksiyonun Moleküler Fizyolojisi: ... 9
1.2.4.1. Relaksan mediyatörler: ... 14
1.2.4.2.KONTRAKTIL (ANTIEREKTIL)MEDIYATÖRLER: ... 16
1.3.DIABETIK EREKTIL DISFONKSIYON: ... 17
1.4.OKSIDATIF STRES: ... 19
1.5.ASETILSALISILIK ASIT VE SIKLOOKSIJENAZ: ... 23
2. GEREÇ VE YÖNTEMLER ... 29
2.1.DENEY HAYVANLARI ... 29
2.2.DIABETIN OLUŞTURULMASI VE ORAL ASPIRIN TEDAVISI: ... 29
2.3.BEDEN AĞIRLIKLARI VE KAN ŞEKERI SEVIYELERININ TAKIP EDILMESI: ... 30
2.4.IN VIVO DENEYLER,İNTRAKAVERNOZAL BASINÇ ÖLÇÜMÜ (ICP): ... 31
2.5.IN VITRO DENEYLER: ... 32
2.6.TOTAL RNA VE MRNA EKSTRAKSIYONU: ... 33
2.7.RT-PCR VE PCR: ... 33
2.8.İSTATISTIKSEL ANALIZ: ... 34
2.9.YAZIM VE GRAFIKLER ... 35
3. BULGULAR ... 36
3.1.BEDEN AĞIRLIKLARI VE KAN ŞEKERI DEĞERLERI: ... 36
3.2.IN VIVO ÇALIŞMA SONUÇLARI (ICP): ... 39
3.3.IN VITRO ÇALIŞMA SONUÇLARI (ORGAN BANYOSU): ... 42
3.3.1. Elektriksel Alan Stimülasyonu (EFS) İle Gevşeme Yanıtları: ... 42
3.3.2. Sodyum Nitroprussit (SNP) Gevşeme Yanıtları: ... 45
3.3.3. Fenilefrin Kasılma Yanıtları: ... 46
3.4. NNOS VE COX-1EKSPRESYONLARI ... 49
4. TARTIŞMA ... 52
5. SONUÇ VE ÖNERİLER ... 566
6. ÖZET... 577
SUMMARY ... 588
KAYNAKLAR... 599
SİMGELER VE KISALTMALAR
AA: Araşidonik asit
ACh: Asetilkolin (acetylcholine)
ASA: Asetilsalisik asit
cDNA: complementery deoksiribonükleik asit
COX: Siklooksijenaz (Cyclooxygenase)
DEPC: Dietilpirokarbonat (diethylpyrocarbonate)
DM: Diabetes Mellitus ED: Erektil Disfonksiyon
EFS: Elektriksel alan stimulasyonu (electrical field stimulation)
eNOS: Endotelial nitrik oksit sentaz
ICP: Intrakavernozal basınç (Intracavernosal pressure)
iNOS: Inducible nitrik oksit sentaz
MAP: Sistolik kan basıncı (Mean arterial pressure)
mRNA: messenger ribonükleik asit
NANC: Non-Adrenerjik Non-Kolinerjik (non-adrenergic-non-cholinergic)
NF-kB: Nükleer faktör-kappa B nNOS: Nöronal nitrik oksit sentaz
NO: Nitrik oksit
PCR: Polimeraz zincir reaksiyonu (polimerase chain reaction)
PDE: Fosfodiesteraz (phosphodiesterase) PG: Prostaglandin
PGI2: Prostasiklin
Phe: Fenilefrin (phenylephrine)
RT-PCR: Reverse Transkriptaz-polimerase zincir reaksiyonu
SNP: Sodyum nitroprussit STZ: Streptozotosin
Taq: DNA polimeraz TBE: Tris-Borik-EDTA
tRNA: total ribonükleik asit
15-(R)-HETE: 15(R)-hidroksieikosatetranoik asit
ŞEKİLLER
Şekil 1.1. Korpus kavernozum ve spongiozumun görünümü 2
Şekil 1.2. Penisin arteriyal ve venöz anatomisi 3
Şekil 1.3. Penisin nöral anatomisi 4
Şekil 1.4. Ereksiyon evreleri 6
Şekil 1.5. Penis düz kası kasılmasının moleküler mekanizması 10
Şekil 1.6. Ereksiyonun moleküler fizyolojisinde Rho/Rhokinaz yolağı 11
Şekil 1,7. Penis düz kas gevşemesinin moleküler mekanizması 13
Şekil 1.8. Diabetik komplikasyonlara neden olan mekanizmalar 21
Şekil 1.9. Nitrerjik radikal oluşumu 22
Şekil 1.10. Nitrik oksit sentaz enziminin kenetlenememesi 23
Şekil 1.11. Aspirinin kimyasal yapısı 24
Şekil 1.12. Araşidonik asit ve COX yolağı 25
Şekil 2.1 Kavernozal sinire uygulanan elektriksel alan stimülasyonu ile
intrakavernozal basınç ölçümü 32
Şekil 3.1 Beden Ağırlığı 37
Şekil 3.2 Kan Şekeri 38
Sekil 3.2.1.A Kontrol grubundan elde edilen kavernoz ve kan basınçlarına ilişkin trase 39 Sekil 3.2.1.B Diabet grubundan elde edilen kavernoz ve kan basınçlarına ilişkin trase 39 Sekil 3.2.1.C K+ASA grubundan elde edilen kavernoz ve kan basınçlarına ilişkin trase 40
Sekil 3.2.1.D D+ASA grubundan elde edilen kavernoz ve kan basınçlarına ilişkin
trase
40
Şekil 3.2.2 Kontrol, Diabet ve ASA tedavili gruplardan ICP/MAP oranı. 41
Şekil 3.3.1.1.A Kontrol grubundan elde edilen kavernoz dokuda EFS yanıtına ilişkin
trase 42
Şekil 3.3.1.1.B Diabet grubundan elde edilen kavernoz dokuda EFS yanıtına ilişkin
trase 42
Şekil 3.3.1.1.C K+ASA grubundan elde edilen kavernoz dokuda EFS yanıtına ilişkin
trase 43
Şekil 3.3.1.1.D D+ASA grubundan elde edilen kavernoz dokuda EFS yanıtına ilişkin
trase 43
Şekil .3.3.1.2 Kontrol, Diabet ve ASA tedavili gruplardan alınan kavernoz dokularda
EFS yanıtları 44
Şekil 3.3.2. .Kontrol, Diabet ve ASA tedavili gruplardan alınan kavernoz dokularda
SNP gevşemelerine ilişkin doz-yanıt eğrileri. 45
Şekil 3.3.3 1.A Kontrol grubundan elde edilen kavernoz dokuda Fenilefrin kasılmasına
ilişkin trase 46
Şekil 3.3.3 1.B Diabet grubundan elde edilen kavernoz dokuda Fenilefrin kasılmasına
ilişkin trase 46
Şekil 3.3.3 1.C K+ASA grubundan elde edilen kavernoz dokuda Fenilefrin kasılmasına
ilişkin trase 47
Şekil 3.3.3 1.D D+ASA grubundan elde edilen kavernoz dokuda Fenilefrin kasılmasına
ilişkin trase 47
Şekil 3.3.3.2. Kontrol, Diabet ve ASA tedavili gruplardan alınan kavernoz dokularda fenilefrinin kasılmalarına ilişkin doz-yanıt eğrileri 48
Şekil 3.4.1 A Kontrol ve diabetic sıçanlardan alınan korpus kavernos dokularından
nNOS mRNA ekspresyonları 49
Şekil 3.4.1 B ASA tedavili kontrol ve diabetik sıçanlardan alınan korpus kavernos
dokularından nNOS mRNA ekspresyonları 49
Şekil 3.4.1 C Kontrol ve diabetik sıçanlardan alınan korpus kavernos dokularından
Cox-1 mRNA ekspresyonları 49
Şekil 3.4.1 D ASA tedavili kontrol ve diabetik sıçanlardan alınan korpus kavernos
dokularından nNOS mRNA ekspresyonları 50
Şekil 3.4.2.A Kontrol, Diabet ve ASA tedavili gruplardan nNOS/BA ekspresyon
oranları. 50
Şekil 3.4.2.B Kontrol, Diabet ve ASA tedavili gruplardan Cox-1/BA ekspresyon
oranları. 51
TABLOLAR
Çizelge 2.7. PCR deneylerinde kullanılan primer dizilimleri 34 Çizelge 3.1. Deney hayvanlarının ağırlıkları ve kan şekerlerindeki
değişiklikler
36
Çizelge 3.3.2 Sodyum nitroprussit gevşemelerine ait pD2 değerleri. 45
1.GİRİŞ
Erektil disfonksiyon (ED), ereksiyon oluşturamama veya ereksiyonu devam ettirememe olarak tanımlanır (Nusbaum 2000; Anafarta ve ark., 2000). Erektil disfonksiyon oranı yaşlanmaya paralel olarak artmakla birlikte, yaşlanmanın mutlak bir sonucu değildir. Belirlenmiş potansiyel risk faktörlerinin varlığı, erektil disfonksiyonun her zaman yaşlanmaya eşlik etmediğini; fakat, yaşlanmayla daha sık görüldüğünü düşündürmektedir.
1.1. Penisin Anatomisi:
Penis korpus kavernozum ve korpus spongiozum olmak üzere 2 temel yapıdan meydana gelir (Şekil 1.1). Penisin hacmini oluşturan ve ereksiyonu düzenleyen temel yapılar korpus kavernozumlardır.
Erektil doku, penisi destekleyen iki korpus kavernozum ve glans penise uzanıp, üretrayı da kaplayan korpus spongiosum olmak üzere üç korporal kısımdan oluşur.
Her bir korpus kavernosum, elastik liflerden fakir, kollajen liflerden zengin tunika albuginea adı verilen fasyal bir kılıf ve Buck fasyası adı verilen kalın bir fibröz fasya ile çevrelenir.
Tunika albuginea, ereksiyonda içerdiği kollajen liflerinin imkan verdiği kadar genişler.
Kendisini geçen perforan (emisser) venleri sıkıştırıp venöz dönüşü engelleyerek ereksiyona katkıda bulunur. Tunika albuginea’nın oluşturduğu septal çıkıntılar korpus kavernozumların içinde birçok trabekül oluşturur. Bu trabeküller içinde erektil
sinüsoidal doku yer alır ve trabeküllerin iç yüzeyi endotel ile çevrilidir.
Buck fasyası tunika albuginea’nın dışında yer alır. Her iki kavernozal doku arasına girer ve kavernöz dokular ile spongioz doku arasında bir tabaka oluşturur. Bu fasya ereksiyonda sirkumfleks venleri ve derin dorsal veni sıkıştırarak rijiditeye katkıda bulunur.
Korpus spongiozum proksimal kısımda, bulbusu oluşturmak üzere genişler.
Yukarıya doğru ürogenital diafram boyunca kıvrılır ve prostatın apeksine ulaşır.
Korpus spongiozum, korpus kavernozuma oranla daha geniş sinüzoidal boşluklara sahiptir. Korpus spongiozumu çevreleyen tunika albuginea daha incedir.
Şekil 1.1 Korpus kavernozum ve spongiozumun görünümü (CAMPBELL ÜROLOJİ, 2005)
Penis, internal iliak arterin dalı olan internal pudental arter ile kanlanmaktadır. Pelvis içinde; internal pudental arter, sakrotüberöz ligamanın üzerinden ve sakrospinöz
ligamanın altından geçip, Alcock kanalında perineal arter dalını verdikten sonra kommon penil arter adını alır.
Kommon penil arter korpus kavernozuma ulaşmadan önce bulbar, üretral, kavernozal dalları verir ve dorsal arter olarak devam eder. Tunika albugineadan geçen kavernozal arter distale doğru uzanırken çok sayıda helisin dallar verir. Bu tribuşon şeklindeki düz kastan zengin damarlar doğrudan vakuollerden oluşan boşluklara açılır.
Penisin yüzeyel venöz sistemi, intermediate ve derin venöz sistem aracılığı ile drene edilir. Derin venöz sistem krural ve kavernozal venlerden oluşur. Kavernöz cismin drenajını sağlayan kavernöz venler, spongioz cismi drene eden üretral venlerle birleşerek internal pudental vene drene olur.
Şekil 1.2. Penisin arteriyal ve venöz anatomisi (CAMPBELL ÜROLOJİ, 2005)
Kavernozal sinirler (Walsh sinirleri) pelvik pleksusun bir dalıdır. Sempatik ve parasempatik lifler taşır. Kavernozal sinir prostatın posterolateralinde seyreder;
intrakavernozal basınç ölçümünde elektriksel stimulasyon uygulanan yer bu bölgedir.
İkinci ve dördüncü sakral spinal segment aralığındaki (S2-4) intermediolateral nukleuslardan gelen parasempatik sinirler, onuncu torasik ikinci lumbar spinal segment aralığındaki (T10-L2) torakolumbar bölgeden gelen sempatik sinirlerin oluşturduğu presakral sinir (nervus hipogastrikus) pelvik pleksusa katılır.
Kavernozal sinir lifleri, kavernozal ve üretral arterler ile beraber korpus kavernozum ve korpus spongiozuma girerler. Kavernozal sinirlerin terminal dalları helisial arterleri ve trabeküler düz kasları inerve ederler.
Şekil 1.3. Penisin nöral anatomisi (CAMPBELL ÜROLOJİ, 2005)
1.2. Ereksiyon Fizyolojisi:
1.2.1. Ereksiyon Evreleri:
Flask evre: Kavernöz arterden gelen kan akımı minimal olup yalnızca dokuyu besler. Sempatik etki altındadır ve kavernöz düz kas ile terminal arterioller kontraktedir.
Latent (dolum) evresi: Seksüel uyarı ile birlikte, sinirsel uyarılar kavernöz sinir uçlarından ve endotel hücrelerinden düz kas relaksanı NO salınımı ile sağlanır.
Trabekül düz kasların gevşemesi ile sinüzoidlerde kompliyans (genişleme derecesi) artar ve hızlı bir kan göllenmesi oluşur. Korpus kavernozuma hem sistol hem de diastolde kan girer. Bu relaksanların etkisi erektil dokuyu besleyen arter ve arteriollerde dilatasyona ve penis kan akımında 25-60 kat artışa neden olur.
Trabekül ile tunika albuginea arasındaki subtunikal venöz pleksus sıkışır ve venöz dönüş durur (veno-okluziv mekanizma). Penisin boyu uzadığı için intrakavernozal basınç henüz artmamıştır. Bu faz kişinin arter yapısı ve penis hacmine bağlı olarak 30 saniye ile birkaç dakika sürer (Şekil 1.4).
Tümesans evresi: Tam ereksiyon oluşana kadar intrakavernozal basınç sürekli artar. İntrakavernozal basınç arttıkça arteriyel akım düşer ve intrakavernozal basınç diastolik basıncın üzerine çıkınca sadece sistolde kan girer. Kan, korpus kavernozum içinde hapsolur ve penis flask pozisyondan ereksiyon durumuna geçer.
Tam ereksiyon evresi: Intrakavernozal basınç yükselir. Venöz kanalların çoğu komprese olmuştur ve venöz akım durur. Kan gazları arteriyel kandakine eşittir.
Rigid ereksiyon evresi: Kavernozal sinir uyarımıyla tam ereksiyon sağlandıktan sonra pudendal sinir uyarımıyla iskiokavernozal kaslar kasılır. İntrakavernözal basınç sistolik basıncın üzerine çıkar ve kavernozal arter içindeki akım durur.
Detümesans evresi: Detümesans evresinde; ejekülasyonla birlikte sempatik sistemde artan aktivite helisin arterlerde tonus artışına ve trabeküler kaslarda kasılmaya neden olur. Bu sayede intrakavernozal basınçta hafif bir artış olur. Veno- oklüziv mekanizma halen aktiftir. Yavaş detümesans evresinde, venöz dönüş kanallarının açılması ile birlikte intrakavernozal basınçta orta derecede azalma oluşur. Hızlı detümesans evresinde, arterial akımın uyarılma öncesine gelmesi ve veno-oklüziv mekanizmanın inaktif hale gelmesi ile intrakavernözal basınç hızla düşer.
Şekil 1.4. Ereksiyon evreleri (CAMPBELL ÜROLOJİ, 2005)
1.2.2. Ereksiyonun Santral Kontrolü:
Seksüel aktivite döngüsü birçok santral ve periferal nöronların kontrolü altındadır.
Eksitasyon, plato, orgazm, çözülme olmak üzere dört fazda gerçekleşir.
Santral supraspinal sistemler temel olarak limbik sistemde (olfaktör nukleus, medial preoptik alan, nukleus assumbens, amigdal nukleus, hipokampüs), hipotalamus ve onun paraventriküler ve ventromedial nukleuslarında lokalizedir (Argiolas 2003).
Hipokampüs, hipotalamusun paraventriküler nükleusu (PVN) ve medial preoptik alan (MPA) cinsel fonksiyon ve penil ereksiyon kontrolünde rol oynayan en önemli integrasyon merkezleridir (Marson 1993).
MPA’dan çıkan efferent yollar medial ön beyine ve oradan orta beyin tegmental bölgesine (substantia nigra yakınına) girer. Bu bölgelerdeki lezyonlara neden olan Parkinson hastalığı, multiple skleroz veya serebrovasküler olaylar bu iletinin bozulmasına ve bunun sonucunda ED’ye neden olurlar (Mallik 1994).
Dopamin: Erektil yanıtı ortaya çıkarmakta önemli olduğu bilinen paraventriküler nükleusta dopaminerjik yollar bulunmuştur (Ganong 1999). Dopamin agonisti olan apomorfin hipotalamusun paraventriküler nukleusu ve medial preoptik alanda lokalize olan nöronları (D2>D1 nonselektif dopamin reseptör agonistleri) aktive ederek cinsel fonksiyonları arttırdığı gösterilmiştir (Hiton 1995; Mantorsi 20003;
Anderson 2001 ).
Serotonin: Beyin sapında medial rafe nükleusta, hipotalamus, limbik sistem, neokorteks ve medulla spinaliste yedi çeşit serotonin (5HT=5-hidroksitriptamin) reseptörü bulunur. 5-HT-1A reseptör agonisti ereksiyonu inhibe ederken, ejekülasyonu arttırır. 5-HT-2 agonistleri ereksiyonu engellerken emisyonu ve
ejekulasyonu uyarır. 5-HT-2C reseptörünün stimulasyonu ise ereksiyonu uyarır (Ganong 1999; Ganon 1999 - 244; Lue 2002 ).
Norepinefrin: Norepinefrin salgılayan hücreler, beynin lokus sereleus, pons ve medullasında bulunur. Bu hücrelerin, hipotalamusun paraventriküler, supraoptik ve periventriküler nükleuslar, talamus ve neokorteks ile aksonal bağlantıları vardır.
Santral norepinefrin iletiminin cinsel fonksiyon üzerine etkisi olduğu düşünülmektedir (Anderson 2001).
Oksitosin: Erkek sıçanlarda hipotalamusun paraventriküler nukleusundan ekstrahipotalamik beyin bölgesine ve spinal korda yönlenen oksitosinerjik nöronların oksitosinle uyarılması, NOS aktivasyonu ile ereksiyon cevabı oluşturur (Argiolas 2004).
Prolaktin: ED şikayeti olan hastalarda %1-5 oranında prolaktin yüksekliği görülür.
Prolaktin seviyesinin yüksek olması luteinizan hormon salınımını azaltır ve seks hormon bağlayıcı globülin seviyesini düşürür, 5-alfa-redüktaz enzimini inhibe eder, MPA’daki dopaminerjik aktiviteyi baskılar. Sonuç olarak serum testesteron seviyesini düşürür ve erektil disfonksiyona neden olur (Buvat 2003).
1.2.3. Ereksiyonun Periferal Kontrolü:
Penisin nöral inervasyonu, parasempatik ve sempatik sinirler (kavernöz sinir içinde) ve somatik sinirler (pudental sinir içinde) ile sağlanır. Periferik nörojenik sistemde adrenerjik, kolinerjik, NANC (nonadrenerjik nonkolinerjik) lifler rol alır. Helisin arterler ve laküner boşlukları saran endotel hücreleri, sinusoidler nörotransmitterleri salgılayarak penis düz kaslarının tonusunu kontrol eder.
1.2.4. Ereksiyonun Moleküler Fizyolojisi:
Peniste düz kas kasılma ve gevşemesi hücresel serbest kalsiyum tarafından düzenlenir. Sinir uçlarından norepinefrin, endotelyumdan endotelin ve prostaglandinF2α, düz kastaki endotelyum aktif reseptörlerden, inositol trifosfat ve diaçilgliserolü artırarak, sarkoplazmik retikulum gibi intraselüler depolardan kalsiyum salınmasını sağlar, ve/veya düz kas hücre duvarındaki kalsiyum kanallarının açılmasıyla, ekstraselüler boşluktan kalsiyum girişini sağlar. Artan kalsiyum, kalmoduline bağlanır ve myosin-hafif zincirinde değişimlere neden olur. Sonuçta, myosin hafif zincirinin fosforilasyonunu katalizler, aktin filamentleri boyunca myosinin siklusunu gerçekleştirir. Ayrıca, hafif zincir fosforilizasyonu, ATP’den kasılma için gereken enerjiyi üreten myosin ATPazı aktive eder (Şekil 1.5).
Şekil 1.5. Penis düz kası kasılmasının moleküler mekanizması. Sempatik sinirlerden salınan norepinefrin ve endotelin ve endotelden salınan PGF2a, düz kas kaıslması için gereken bir dizi yolun başlangıç basamağı olan hücre içi kalsiyumun artmasını sağlamak için, reseptörleri aktive ederler (Dean ve Lue 2005).
Hücresel kalsiyum, bazal seviyeye düştüğünde, kalsiyum-duyarlı yolak devreye girer. Bir diğer mekanizma, hücresel kalsiyumu etkilemeden kasılmayı sağlayan, kalsiyum duyarlılığını artıran G-protein-bağlı eksitatör reseptörler üzerinden gerçekleşir. Bu yolak, küçük, monomerik G protein olan, Rho-kinazı aktive eden RhoA’yı içerir. Aktive olmuş Rho-kinaz, düz kas regülatör unitesi olan, kontraktil
tonusu sağlayan miyofilamentlerin defosforillenmesini önleyen miyozin fosfatazın inhibe olmasına neden olur
RhoA ve Rho-kinazın penil düz kasta da flask durumda olduğu (detümesans) gösterilmiştir. İlginç olarak, kavernozal RhoA miktarı, damar düz kasında bulunduğundan 17 kat fazla bulunmuştur. Selektif Rho-kinaz inhibitörü ile hayvan modellerinde penil ereksiyon, insan korpus kavernozumunda relaksasyon gözlenmiştir. Ortak kanı, penil düz kasın fazik kontraksiyonunun, hücresel kalsiyum artışı ile düzenlendiği ve tonik kontraksiyonun ise kalsiyum duyarlı yolaklarla düzenlendiğidir (Şekil 1.6.).
Şekil 1.6. Ereksiyonun Moleküler Fizyolojisinde Rho/Rho-kinaz yolağı (Christ ve Hodges, 2006).
Penis düz kasının gevşemesi, sarkoplazmadan serbest kalsiyumun azalmasıyla devam eder. Kalmodulin kalsiyumdan ayrılır, miyozin hafif zincir kinaz inaktive olur.
Miyozin, miyozin hafif-zincir fosfataz ile defosforillenir ve aktin filamentlerinden ayrılır ve kas gevşer. Diğer bir yargı, korpus kavernozum düz kasının, sadece NO-cGMP inhibitör yolağı üzerinden yürümediği, bu çapraz köprülerin fosforillenmesinin azalması ve dolayısıyla gevşemeye, bilinmeyen bir mekanizmanın da katkısının olabileceği yönündedir.
cAMP ve cGMP, düz kas relaksasyonu için gereken ikincil ulaklardır. cAMP ve cGMP bağımlı protein kinazları aktive ederek, iyon kanalları ve bazı proteinlerin fosforillenmesini sağlayarak şu sonuçlar elde edilir: 1) potasyum kanallarının açılması ve hiperpolarizasyon 2) endoplazmik retikulumdan intraselüler kalsiyumun geri alımı 3) voltaj duyarlı kalsiyum kanallarının inhibisyonu ve kalsiyum girişinin blokajı. Tüm bunların sonucu olarak, hücresel serbest kalsiyumda azalma ve düz kasta gevşeme görülür (Şekil 1.7; Dean ve Lue, 2005).
Şekil 1.7. Penis düz kas gevşemesinin moleküler mekanizması. Düz kasın gevşemesini sağlayan ikincil ulaklar cAMP ve cGMP, kendi protein kinazlarını aktive ederek, endoplazmik retikulumdan hücre içine kalsiyum salınımı, kalsiyum kanallarının kapanması, potasyum kanallarının açılmasını sağlayan proteinlerin fosforillenmesine neden olurlar. Hücre içi kalsiyumun azalması ile penil düz kas gevşer (Dean ve Lue 2005).
1.2.4.1. Relaksan mediyatörler:
Nitrik oksit: Penil ereksiyonu, otonomik sinir sistemi yönetir. Sakral parasempatik yolaklar, proerektil, sempatik yolaklar ise anti-erektil mekanizmaları yönetir. Nitrerjik sinirler ve endotel hücreler, peniste NO salınması ile, cGMP üretmek üzere guanilat siklazı aktive eder ve intraselüler kalsiyumun azalmasına neden olarak gevşemeyi sağlar (Ignarro ve ark., 1990; Raifer ve ark., 1992; Toda ve ark., 2005).
Gevşemeden sorumlu ana kimyasal mediyatörün NO olduğu kesin olarak ispatlanmıştır. Non-adrenerjik-non-kolinerjik (NANC) kavernozal sinir ucu ve endotelyum temel NO kaynaklarıdır (Gonzalez-Cadavid ve ark.; 1999; Lue, 2000).
Normal endotel fonksiyonunda, NO’nun vazodilatör etkisi, RhoA/Rho-kinaz aracılı vazokonstriksiyon ile dengededir ve vasküler tonusu sağlar. Patolojik durumlarda, endotelial nitrik oksit sentaz (eNOS) kenetsizlenme “uncoupling” olarak bilinen durum sebebiyle, NO’nun superoksit anyonu ile reaksiyonu sonucu artan peroksinitrit (ONOO-) seviyesi, NO’nun pro-oksidant etkilerini ortaya çıkarır. NO biyoyararlanımı ile vazokonstriktör fonksiyon arasındaki denge ve reaktif oksijen parçalarının oluşumu, normal ereksiyon için önem taşır.
Nitrik oksit, NOS enziminin katalitik aktivitesi ile, substratı olan L-arjininden sentezlenir. Bu reaksiyon, tetrahidrobiopterin (BH4) ve nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADPH)’ı içerir. NOS izoformları, endotelial (e), nöronal (n) ve indüklenebilir (“inducible”) (i) olmak üzere üç çeşittir. NOS’tan oluşan NO, soluble guanilat siklaz (sGC) ile etkileşir ve bu enzimi aktive ederek, intraselüler cGMP seviyesini ve protein kinaz G (PKG) aktivitesini artırır. PKG’nın aktivite olması, pek çok hücresel proteinin fosforillenmesiyle sonuçlanır (Örneğin, K+ kanalları, Ca++
kanalları ve pompası, miyozin binding (kalsiyum sensitizasyonunun değişmesiyle)).
Sonuç olarak, intraselüler kalsiyum azalır ve korporal düz kas tonusu azalır (Şekil 1.7).
NO-sGC-cGMP sinyalizasyonunun önemi, fosfodiesteraz gibi katabolik enzimler üzerinde araştırma yapılması gerektiğini gösterir. Bu enzimin, substrat afinitesi, selektivitesi ve regülatör mekanizmalarına göre 11 farklı izoenzimi vardır. Bunlar içinde, fosfodiesteraz tip 5 (PDE-5), PDE-6 ve PDE-9 yüksek oranda cGMP selektif olup, PDE-1, PDE-2 ve PDE-11 ve PDE-3 ve PDE-10, cGMP duyarlı ama cAMP selektiftir. Korpus kavernozumdaki predominant enzim tipi PDE-5’tir. PDE-5, cGMP’nin yıkımını özellikle siklik nükleotidi 5’-cGMP’ye hidrolize ederek katalizler, bu yüzden adı cGMP-spesifik PDE’dir (Rybalkin ve ark., 2003). PDE-5, NO sinyalinin oluşturduğu cGMP’yi azaltır. Bunun sonucu olarak, kontraktil proteinleri, iyon kanalları gibi farklı yolaklarla erektil yanıtı sağlayan, cGMP-bağımlı protein kinaz 1 (cGKI)’in vazorelaksan etkisini sınırlar. Hayvan modelleriyle yapılan bazı çalışmalarda, normal androjen seviyelerinin de PDE-5 üzerinde etkili olduğu saptanmıştır (Traish ve ark., 2003). Preklinik ve klinik çalışmalar, androjenin, PDE-5 ekspresyonu, fonksiyonu ve penisin PDE-5 inhibitörlerine verdiği yanıtı olumlu yönde etkilediğini göstermiştir.
Asetilkolin: Ereksiyon, S2-4 spinal segmentlerden köken alan parasempatik sinirlerdeki artmış sinirsel aktivite ile başlatılır. Preganglionik nörotransmitter olan asetilkolin, endotel hücrelerinden NO salınımını sağlar, presinaptik düzeyde adrenerjik sinir inhibisyonu yapıp muskarinik reseptörleri uyarır, noradrenalin salınımını inhibe eder böylece peniste tümesansa ve ereksiyona neden olur. Düz kas hücrelerinde M2, endotel hücrelerinde ise M3 reseptörler çoğunluktadır.
Vazoaktif İntestinal Peptid, Prostaglandinler ve diğerleri: Vazoaktif İntestinal Peptid (VIP) reseptörleri (tip1 ve 2) penil erektil dokuda yüksek konsantrasyonda
bulunur. G protein aracılığı ile adenil siklazı stimüle eder ve hücre içi cAMP düzeyini arttırır. cAMP, cAMP bağımlı protein kinazı aktive eder ve relaksasyon oluşturur.
PGF2α, PGI2 korpus kavernosum ve korpus spongiozumda kontraksiyona, PGE1 ve PGE2 ise relaksasyona neden olur (El Melegy 2005).
Pürinerjik mekanizmalar: Düz kas P1 pürinoseptörleri adenozine yanıt vererek korpus kavernosumda gevşemeye neden olur. Endotel hücrelerinde ATP P2Y
reseptörleri ile korpus kavernosumda gevşemeye neden olur (Tong 1992; Fredholm 1997).
1.2.4.2. Kontraktil (Antierektil) Mediyatörler:
Noradrenalin (NA): Penis düz kas kontraksiyonlarının ana düzenleyicileri α-1 adrenoreseptörlerdir. Üç alt tipi de (α1a,b,d) insan korpus kavernozumlarında gösterilmiştir. Noradrenalin α1 adrenoreseptörleri; guanidin nükleotid bağlayıcı protein (G protein) aracılığı ile inositol trifosfat (IP3) ve diasilgliserol (DAG) kullanarak hücre içi kalsiyum düzeyinin artışına neden olmaktadır. Salınan NA penil damarlardaki hem α-adrenoreseptörleri hem de β-adrenoreseptörlerini aktive eder.
Fakat β-adrenoreseptör konsantrasyonunun α-adrenoreseptörlerine göre oldukça az olması nedeniyle helisin arterlerde ve korpus kavernozumda kontraksiyona neden olur (Anderson 2001).
Endotelin: Endotel hücreleri tarafından salgılanan, güçlü vazokostrüktör etkisi olan bir peptitdir. ET-A reseptörleri vasküler düz kas hücrelerinde bulunur ve vazokonstrüksiyon ve hücresel çoğalmayı indükler. ET-B reseptörleri ise endotelial hücrelerde yer alır ve endotel bağımlı relaksan faktörler ve prostasiklin ile vasodilatasyonu sağlar (Kahn 2000).
Anjiotensin: Anjiotensin 1 anjiotensin dönüştürücü enzim tarafından Anjiotensin 2’ye dönüştürülür. İntrakavernozal dokuda konsantrasyonu artınca korpus kavernozumlarda kontraksiyona neden olur (El Melegy 2005).
1.3. Diabetik Erektil Disfonksiyon:
Diabetes Mellitus, nöronal, metabolik, endokrin ve vasküler değişimleri içeren çok etkenli bir hastalıktır. ED, diabetin son organ komplikasyonları arasındadır ve insidensi %50’dir. Aslında, hastaların pek çoğunda, ED etiyolojisi, kontraktilitenin artması, korporal düz kasın ve penis damarlarının gevşeme özelliğinde bozulma ile ilişkilidir. Temel fizyolojik bozulma, endojen gevşeme mekanizmalarının, penil ereksiyonu sağlayacak intrakavernozal basıncı artırmaya yetecek kan akımını sağlayamaması ile ilişkilidir (Christ ve ark., 2004).
Diabette gelişen ED’nin patofizyolojisi, nörojenik, vasküler ve hormonal faktörleri içeren birçok mekanizmanın kompleks ilişkisi ile açıklanmaktadır. Bununla birlikte, problemin gelişiminde, bozulan NO sentezi, endotel bağımlı gevşetici etkinin inhibisyonuna yol açan, endotelin (ET-B) reseptör bağlanma bölgelerinde artış, artmış serbest oksijen radikalleri ve buna bağlı oksidatif hasar, NO bağımlı selektif sinir harabiyeti, glikozillenmiş son ürünlerdeki artışa bağlı olarak oluşan harabiyet gibi bazı başka mekanizmaların da rol oynadığı gösterilmiştir (Lue, 2002).
DM’de, nöron ve endotelyumdan NO salınımına bağlı olarak, kavernozal düz kas gevşemesi azalır (Saenz de Tejada ve ark., 1989; Keegan ve ark., 1999). NO salınımının azalma sebepleri, diabetik nöropatiye bağlı olarak nitrerjik sinirlerde harabiyet (Cellek ve ark., 2003), eNOS ve nNOS ekspresyonunun down-regüle
olmasına bağlı olarak NO üretiminde ve biyoyararlanımında azalmadır (Vernet ve ark., 1995; Akignba ve Burnett 2001). Diabetik sıçanlarda, NO’nun substratı olan L- arjininin plazma konsantrasyonunun azaldığı gösterilmiştir (Pieper ve Dondlinger 1997).
Diabetik ED’nin tedavisi üzerine yapılan çalışmalarda, l-arjinin ile elde edilmiş olumlu sonuçlar sınırlıdır. Arjinaz, ortak substrat l-arjinin için NO ile yarışır. Kronik arjinin tedavisi, diabetik hayvanlarda korpus kavernosum düz kasında in vitro çalışmalarda erektil fonksiyonu düzeltmektedir. Diabetik hayvan modellerinde arjinaz aktivitesini detaylı olarak incelemek için, tek başına veya kombinasyonlar şeklinde l-arjinin replasman çalışmalarına gerek vardır.
Oksidatif stres, hipoksik dokularda oluşan serbest hücresel NADH/NAD+’ın artması, polyol ve sorbitol yolaklarında sorbitolün fruktoza NAD-bağımlı oksidasyonunun artmasının sonucudur (Williamson ve ark., 1993). Hipergliseminin yol açması nedeniyle, poliol yolağı, diabete spesifiktir. Hiperglisemik durumda, yüksek poliol yolağı, NOS temel ko-faktörü olan NADPH’ın seviyesini azaltır ve DAG gibi ikincil ulaklar aracılığıyla intraselüler kalsiyum salınımı artar ve böylece düz kas kontraktilitesi artmış olur. Öte yandan, diabette korpus kavernozum düz kasında, PKG-1 ekspresyonunun azalmasına bağlı olarak PKG-1 aktivitesinin anlamlı derecede azaldığı gösterilmiştir (Chang ve ark., 2004).
Erkeklerde hem DM hem de androjen eksikliği, yaşa bağlı olmaksızın yüksek oranda görülmektedir. Tip-1 ve tip-2 diabet modelleri ile yapılan çalışmalardan birinde, penil dokuda NOS ve serum androjen seviyelerinde azalma gösterilmiştir (Vernet ve ark., 1995). Başka bir çalışmada, iki farklı diabetik hayvan modelinde testosteron eksikliğine bağlı olarak gelişen biyokimyasal değişikliklerin ED’ye yol açtığı gösterilmiştir (Zhang ve ark., 2006).
Diabetik sıçanlarda yapılan bir çalışmada, RhoA/Rho-kinaz aşırı ekspresyonunun, diabetik ED’ye yol açtığı ileri sürülmüştür (Bivalacqua ve ark., 2004). İlginç olarak, hipogonadizmin testosteron ile tedavisinde, ED’nin düzelmesinin, RhoA/Rho-kinaz yolağının down-regüle edilmesi ile olduğu ileri sürülmüştür (Vignozzi ve ark., 2007).
Diabet ve metabolik sendromun, farklı mekanizmalar üzerinden hipogonadizm gelişmesine neden olabileceği ileri sürülmüştür. Bu sebepler arasında, vücut ağırlığında artma, seks-hormon bağlayıcı globulin seviyesinde azalma, gonadotropin salınımında azalma, Leydig hücre testosteron üretimi, testiküler steroid üretiminin sitokin-aracılı inhibisyonu ve östrojene bağlı olarak artmış aromataz aktivitesindan söz edilmiştir (Kalyani ve Dobs, 2007).
Mekanizmalar üzerinden hipogonadizm gelişmesine neden olabileceği ileri sürülmüştür. Bu sebepler arasında, vücut ağırlığında artma, seks-hormon bağlayıcı globulin seviyesinde azalma, gonadotropin salınımında azalma, Leydig hücre testosteron üretimi, testiküler steroid üretiminin sitokin-aracılı inhibisyonu ve östrojene bağlı olarak artmış aromataz aktivitesindan söz edilmiştir (Kalyani ve Dobs, 2007).
1.4. Oksidatif Stres:
Deneysel hiperglisemi, tip-1 ve tip-2 diabetes mellitus’a buna bağlı olarak gelişen oksidatif strese yol açmakta ve pek çok patolojik duruma yol açmaktadır. Diabetes Mellitus komplikasyonlarından sorumlu bir dizi yolağın aktivasyonu, hiperglisemi nedeniyle superoksidin (O2-) aşırı miktarda üretilmesiyle başlar (Jeremy ve ark., 2007, Şekil 1.8). Superoksit anyonu, NO ile birleşerek peroksinitriti (ONOO(-)) oluşturur (Şekil 1.9) ve NO biyoyararlanımı azalır. Peroksinitrit, reziastant penil
arterlerinin oluşuma yol açarak ciddi hücresel hasara ve apoptosise neden olan çok toksik bir moleküldür (Jeremy ve ark., 2007; Amaral ve ark., 2008). Peoksinitrit toksisitesinin ana mekanizmasının, mitokondriyal geçirgenlik ve poli (ADP-riboz) polimeraz-1 (PARP-1) ile ilişkili olduğu ileri sürülmüştür (Szabo 1996; Ying ve ark., 2005). Üstelik, ONOO(-), nitroksidatif stres kaynağı olan potent oksidanttır. Yüksek konsantrasyonda (>100nM), NO2+, NO2, OH, α-radikali ve yüksek reaktif oksijen partikülleri oluşumuna neden olur. Yüksek seviyedeki oksidatif stres, redoks reaksiyon kaskadının başlamasına, dolayısıyla apoptosise, nöron ve endotel hücrelerinde sitotoksik etkilere neden olur (Evgenov ve Liaudet, 2005).
Mitokondriden üretilen ROS da, diabetik komplikasyonlardan sorumlu patojenik mekanizmadır. ROS kaynakları, NADPH oksidaz, mitokondriyal elektron transport zinciri, ksantin oksidaz, NOS, siklooksijenaz (COX), lipoksijenaz, hemoksijenaz ve hemoproteinleri içerir. Bu enzimler ve elektron zinciri, küçük moleküllerin redoks döngüsünü, hipoksiyi, oksijenasyonu, oto-oksidasyonu, hiperoksi ve hemoglobin oksijenasyonunu yönetir (Şekil 8), (Kojda ve Harrison, 1999; Betteridge, 2000;
Hensley ve ark., 2000). NADPH oksidazın, diabet gibi patolojik durumlarda, damarlarda temel O2- kaynağı olduğu kesinleşmiştir (Cai ve ark., 2003; Jin ve ark., 2008). NADPH oksidazın, vasküler ED’de arttığı gösterilmiştir (Jeremy ve ark., 2007). Hipertansif (Jin ve ark., 2008) ve hiperkolesterolemik (Shukla ve ark., 2005) sıçanlarda NADPH oksidaz aktivitesi ile ilgili in vitro çalışmalar yapılmış olsa da, bu konuda penil diabetik dokuda çalışma yapılmamıştır. Bu nedenle, mitokondriyal oksidatif stres ve anti-oksidant koruma mekanizmaları ile ilgili yapılacak çalışmalar, DM aracılı ED’yi önlemek için yeni terapiler geliştirilmesini sağlayabilecektir.
Şekil 1.8. Diabetik komplikasyonlara neden olan mekanizmalar (Johansen ve ark., 2005)
Şekil 1.9. Nitrerjik radikal oluşum (Johansen ve ark., 2005)
Diabetik hayvanlarda, NO konsantrasyonunun azalmasını etkileyen diğer faktörler, NOS kenetsizlenmesi, NO yıkımının artması, endojen asimetrik dimetilarjinin (ADMA) tarafından NOS inhibisyonudur. Örneğin, NOS substratı olan l-arjinin veya ko-faktörü olan BH4 yokluğunda eNOS için kenetsizlenme gerçekleşebilmektedir.
Uncoupling durumunda, normalde bir subünitenin redüktaz kısmından, diğer bir subünitenin oksijenaz kısmına akan elektronlar, l-arjinin yerine moleküler oksijene doğru yön değiştirirler ve NO yerine O2- oluştururlar (Şekil 1.9). NO scavenging artışı (süpürülmesinin artışı) ve BH4 oksidasyonu ile, inaktif formların oluşması, bu duruma eşlik eder (Xia ve Zweier, 1997; Vasquez-Vivar ve ark., 1998; Hunte ve ark., 2002). Plazmadaki artmış endojen kompetetif NOS inhibitörü ADMA seviyesi pek çok hiperglisemik hayvan modelinde ve diabette NO’nun azalması ile ilişkilendirilmiştir (Knecht ve ark., 1992). NADPH oksidaz aktivitesi, O2- oluşumuna neden olmakla beraber, eNOS kenetsizlenmesinde de önemli bir rol oynuyor olabilir.
eNOS uncoupling, yüksek ADMA seviyeleri ve NADPH oksidaz aktivitesi, diabetik
hayvan modellerinde oluşan erektil disfonksiyonda hala araştırılması gereken konular arasında yer almaktadır.
Şekil 1.10. Nitrik oksit sentaz enziminin uncoupling durumu (Gür ve ark., 2008)
1.5. Asetilsalisilik Asit Ve Siklooksijenaz:
Aspirinin keşfi, M.Ö.4000’de Mısır papirüslerinde söğüt ağacının resmedilmiş olmasıyla başlar. Salisilik asit olarak bilinen bu form, daha sonraları asetillenerek asetilsalisilik asit halini almıştır. 1899’da asetilsalisilik asit, ilaç olarak piyasaya sürüleceği zaman, yeni bir isme ihtiyaç duyulmuştur. Bayer ilaç fabrikasının imzaladığı bu belgede, salisilik asitin elde edildiği bitkinin Latince adı Spiraea’nın kısaltılmış şeklinin ticari markanın ortasına konulması, başına asetilasyonu belirten
“a” harfinin eklenmesi, sonuna ise o tarihlerde ilaç isimlendirmelerinde kolay okunmayı sağlayan –in ekinin getirilmesi uygun bulunmuştur (Jeffreys 2004).
Aspirin, onyıllarca patent savaşlarına maruz kalmış, hakkında en fazla bilimsel makale yayınlanan ilaç ünvanını almıştır.
Aspirin, non steroidal antiinflamatuar (NSAID) sınıfının ilk ilacıdır. Antiinflamatuar, analjezik ve antipiretik özellikleri ile eski tarihlerden beri kullanılmaktadır. Yeni tarihli çalışmalarda, aspirin, kardiyovasküler hastalıklar ve kanser olmak üzere, iki ölüm riskini ortadan kaldırmak için kullanılmaktadır (Hennekens 2007; Patrono ve Rocca 2008).
Şekil 1.11. Aspirinin kimyasal yapısı
Aspirin bilinen antitrombotik, analjezik, antiinflamatuar etkisini, siklooksijenaz (COX) enzimini geri dönüşümsüz olarak inhibe ederek gösterir. COX enziminin, COX-1 ve COX-2 olmak üzere iki izoenzimi vardır. COX-1, normal dokularda normal şartlarda bulunan bir enzimdir. COX-2, normal dokularda düşük seviyede bulunurken, inflamasyon, yaralanma, ağrı gibi patolojik durumlarda pro-inflamatuar mediyatör olarak yüksek oranda üretilir. İnflamasyon gibi ekzojen stimülasyonda, araşidonik asit (AA), fosfolipazlarla prostaglandin G2 (PGG2) ve PGH2’ye parçalanır. COX-1 ve COX-2 enzimlerinin ikisi de, AA’in farklı prostaglandinlere dönüşümünü katalizler (Radi 2009). PGG2 ve PGH2’den sonraki COX ürünleri, bu ürünlerin farklı enzimlerle
metobolize edilmesine bağlı olarak, dokudan dokuya farklılık gösterir. AA, ayrıca 5- lipooksijenaz yolağı ile farklı lökotrienler üretebilir (Şekil 1.12). Aspirin ve diğer NSAID’lar, COX’u inhibe ederek, PG üretimini engeller, lipooksijenazı inhibe etmezler (Goodman and Gilman’s, 2001 bölüm 27).
Aspirin, COX-1 yapısında serin 530 kısmını asetilleyerek, AA’in COX’un aktif bölümüne bağlanmasını engeller, böylece PG üretimi engellenmiş olur. COX-2’de ise, aspirin, enzimin homolog serin 516 bölgesini asetiller. Aspirinin yaptığı bu kovalent modifikasyon, COX-2’den, COX-1’den farklı olarak, 15(R)- hidroksieikosatetranoik asit (15(R)-HETE) sentezlenmesine neden olur. Aspirin aracılı bu ürün, hücreler arası metabolizmada, 5-lipooksijenaz’ın 15-epilipoksin A4 oluşturmasına, ve bunun da, potent antiinflamatuar etkisi ile, aspirinin antiinflamatuar etkisinin artmasına neden olabildiği ileri sürülmüştür (Goodman and Gilman’s, bölüm 27).
Şekil 1. 12. Araşidonik asit ve COX yolağı. Siklik endoperoksidazlar (PGG2 ve PGH2), membran fosfolipidlerinden salınan araşidonik asit üzerinden COX-1 ve COX-2 enzimleri etkisiyle hidroperoksidaz ve siklooksijenazdan üretilirler. Şekilde gri kutular içinde gösterilen bu yeni ürünler, doku spesifik sentazlarla şekillenir ve etkilerini kendi membran reseptörleri üzerinden gösterirler. Kesik çizgiler, olası ligand- reseptör ilişkilerini göstermektedir. Aspirin ve diğer NSAID’lar, non-selektif COX-1 ve COX-2 inhibitörleridir ve lipooksijenaz yolağını etkilemezler. Epilipoksin, aspirinin COX-2 enzimini asetillemesiyle oluşmaktadır. Lipooksijenaz ve COX inhibitörleri, her iki yolakla da etkileşimdedir (Goodman and Gilman’s, Pharmacology).–
26
Aspirin sadece COX’u asetilleyerek inhibe eden potent bir antiinflamatuar değildir, pek çok transkripsiyon faktörünün aktivasyonunu da inhibe eder. Bunlar arasında nükleer faktör-kappa B (NF-kB), CCATT enhancer bağlanma proteini yer alır. NF- kB, inflamatuar protein transkripsiyonunda önemli rol oynar ve diabette arttığı gösterilmiştir. NF-kB ile ilgili diğer genlerin de diabette arttığı gösterilmiştir: iNOS, COX-2, ICAM-1, TNFα, IL-1β, proinflamatuar sitokinler. Bu değişimlerin, diabette PG ve nitrotirozin (peroksinitrit marker’ı) artışına neden olduğu düşünülmektedir (Zheng ve ark., 2007).
Aspirinin farklı dozlarda farklı etki gösterdiği belirtilmiştir. Düşük dozda, COX-1 inhibitörü olarak TXA2 inhibisyonu, orta dozda COX-1 ve COX-2 inhibisyonu ile PG sentezinin azalması gösterilmişken, yüksek dozda, bazı bilinmeyen etkileri olduğu ileri sürülmüştür (Zheng ve ark., 2007).
COX’un bilinen etki mekanizmasının dışında, başka mekanizmalarla da ilişkili olabileceği üzerinde durulmuş, bu konuda farklı çalışmalar yapılmıştır. İlişkide olduğu düşünülen bu mekanizmalardan biri de NOS’tur. Sıçanlarla yapılan bir çalışmada, hiperglisemi ile oluşan hücre ölümünden COX-2 ve NO’nun sorumlu olduğu, NO’nun iNOS’tan oluştuğu ileri sürülmüştür. iNOS ekspresyonu NF-kB ile düzenlenir ve NF-kB transkripsiyon faktörünün yapımından aspirin sorumludur. Bu mekanizmalar hücreden hücreye farklılık gösterebilir, çünkü aynı çalışmada, iNOS aracılı NO’nun artması retinal hücrede gözlenmiş, endotel hücrede gözlenmemiştir (Du ve ark., 2004).
COX ve NOS yolakları, ortak bazı mekanizmaları paylaşırlar. Pek çok hücre ve doku, sitokinlere veya inflamasyona yanıt olarak PG’leri üretirken, PG’ler, spontan olarak NO salınımını artırır. Her ikisi de, parakrin mediyatör olup, intraselüler sinyallerini siklik nükleotidler üzerinden verirler (cAMP, cGMP). NO ve bazı PG’ler,
vasküler düz kası gevşetir, platelet agregasyonunu inhibe ederler. NOS ve COX, ortak kofaktör olarak heme kullanırlar, bu nedenle, NO’nun COX’u heme komponenti üzerinden stimüle ettiğinden söz edilmiştir (Tetsuka ve ark., 1994).
Penil erektil dokuda, PGE2, prostasiklin (PGI2), PGE1 ve PGF2α dahil olmak üzere, in vitro çalışmalarla, PG’lerin varlığı tespit edilmiştir (Jeremy ve ark., 1986; Daley ve ark., 1996a). Tavşan korpus kavernosum striplerinde, PGF2α, TXA2, PGI2, PGE2 ve PGD2’yiiçeren bazal ve tonik prostanoid salınımını söz konusudur (Azadzoi ve ark., 1992). Korpus kavernosum striplerinin, ACh ile inkübasyonunda, tüm bu PG’lerin seviyesinin, radioimmunoassay çalışmalarıyla arttığı gösterilmiştir ve ACh ile stimüle edilen endotel-bağımlı gevşemenin, sadece NO ile değil, ayrıca COX ürünleri ile de ilişkili olduğu ileri sürülmüştür (Minhas ve ark., 2000). Yine tavşanlarla yapılan çalışmalardan elde edilen sonuçlara göre, oksijenin penisteki PG üretimi üzerinde düzenleyici etkisi olduğu gösterilmiştir (Daley ve ark., 1996b). Bazal ve ACh stimülasyonu sonrası oluşan yukarda sözü geçen PG’lerin azaldığı ve bu azalmanın AA suplemantasyonu ile düzelmediği gösterilmiştir. Bu da, peniste hipoksik durumlarda fosfolipaz A2 enziminin aktivitesinin kaybolduğunu düşündürür (Minhas ve ark., 2000).
2. GEREÇ VE YÖNTEMLER
2.1. Deney Hayvanları
300-310 g ağırlığında, Sprague-Dawley türü 16 haftalık erkek sıçanlar, Selçuk Üniversitesi Deneysel Tıp Araştırma ve Uygulama Merkezi’nden temin edilmiştir.
Ankara Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu’ndan alınan 15-08-2008 tarihli 2008-28-134 karar sayılı izinle deneylere başlanmıştır. Sıçanların bakımları Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmokoloji Anabilim Dalı araştırma laboratuvarındaki özel bölümde (07.00-19.00 saatleri arası aydınlık 19.00-07.00 saatleri arası karanlık, oda sıcaklığı 20±1 ºC) yapılmıştır. Deney hayvanları dört gruba ayrılmıştır: (1) kontrol, n=18, (2) diabetik, n=12, (3) aspirin tedavili, n=12, (4) diabetik-aspirin tedavili, n=13.
2.2. Diabetin Oluşturulması Ve Oral Aspirin Tedavisi:
Diabet, 40 mg/kg streptozotosin (STZ)’in kuyruk veninden i.v. olarak verilmesi ile oluşturulmuştur. Diabet indüksiyonundan 4 gün sonra, kan şekerleri ölçülmüş, kan şekeri seviyesi 250 mg/dL’nin altında olan sıçanlar çalışma dışı bırakılmıştır. Diabet süresi 8 hafta olup, STZ enjeksiyonundan dört gün sonra, hayvanlara gavaj yoluyla 100 mg/kg dozda asetilsalisilik asit verilmiştir. Asetilsalisilik asit tedavisi, diabetin indüksiyonundan sonra 8 hafta boyunca kontrol ve diabetik gruplar olmak üzere iki gruba uygulanmıştır.
Sıçanlara oral olarak verilen aspirin süspansiyon olarak hazırlanmıştır. Aspirin suda çözünmeyen bir madde olduğundan, kullanılabilecek en uygun çözücü metilselülozdur (Taussef ve ark., 2008; Kapetanovic ve ark., 2008). Aspirin, % 0,5 oranında metilsüloz-distile su karışımından oluşan çözücü ile havanda ezilerek süspanse edilir. Bir tablet (Aspirin 100 mg 20 tablet-BayerR) aspirinin içerdiği asetilsalisilik asit miktarı ve bir tablet ağırlığı dikkate alınarak, sıçanlara 100mg/kg dozda asetilsalisilik asit verilmiştir. Çalışmanın tamamında bu tedavi şeklinden
“aspirin tedavisi” olarak sözedilecektir.
2.3. Beden Ağırlıkları Ve Kan Şekeri Seviyelerinin Takip Edilmesi:
Hayvanların beden ağırlıkları her hafta ölçülmüş, aspirin tedavisine değişen beden ağırlıkları temel alınarak devam edilmiştir. STZ enjeksiyonunu takiben, ani hipoglisemi riskine karşın, sıçanlara 3 gün boyunca % 5 oranında glukoz içme suyuna karıştırılarak verilmiştir. Kan şekeri seviyeleri, kuyruk veninden kan örneği alınarak diabetin indüksiyonundan 4 gün sonra ölçülmüş, 2 hafta sonra ölçüm tekrarlanmıştır. Son ölçüm, 8.hafta sonunda, in vivo deneyler öncesinde yapılmıştır.
Kan şekeri seviyeleri, Accu-Check Go Roche şeker ölçüm cihazı ve aynı cihaza ait striplerle ölçülmüştür.
2.4. In Vivo Deneyler, İntrakavernozal Basınç Ölçümü (ICP):
Anestezi altında gerçekleşen in vivo deneyler sırasında tüm sıçanlara 100mg/kg ketamin (50mg/ml KetalarR-Eczacıbaşı İlaç Pazarlama) intraperitoneal olarak verilmiştir. Abdominal orta hat, insizyonla açılıp, mesane boynu ve çevre damarlar korunarak, prostatın posterolateralinde seyreden kavernöz sinir tespit edilmiştir (Şekil 2.1). Skrotum orta hattan insize edilerek penis serbestlenmiştir. Penisin derisi soyulup, her iki kruranın etrafındaki iskiokavernoz kaslar penisten ayrılmıştır.
Intrakavernozal basıncı (ICP) monitorize etmek için, heparinize edilmiş (250 U/ml) 23-gauge kanül, polietilen (PE)-50 tüpüne bağlanmıştır. İğnesi, penisin sol kruraya yerleştirilmiştir. Sistolik kan basıncı (MAP, mmHg), yine polietilen (PE)-50 tüpünün karotid artere geçirilmesi yani karotid arter kanülizasyonu ile ölçülmüştür (Christ G ve ark., 2004). Sol kruraya yerleştirilen kanül, basınç ölçer ve amplifikatör ünitesine bağlanarak, “Biopac Student Lab Pro MP35 Sistemi” ile veriler bilgisayara kaydedilmiştir. In vivo olarak ereksiyon oluşturmak için, kavernöz sinire, birbirine paralel iki platin elektrot ile dokunularak stimüle edilmiş ve ICP kaydedilmiştir. Grass S48 stimülatör ile uygulanan elektriksel alan stimülasyonun parametreleri aşağıdaki gibidir: akım voltajı: 7,5 volt, pulse genişliği: 30 ms, akım 1,5 mA, frekans 15 Hz.
Gruplar, maksimum ICP (mmHg), ICP/MAP, detümesans zamanları açısından karşılaştırılmış, elde edilen farklı veriler GraphPadPrism pro5 bilgisayar programı kullanılarak istatistiksel olarak değerlendirilmiştir.
Şekil 2.1. Kavernozal sinire uygulanan elektriksel alan stimülasyonu ile intrakavernozal basınç ölçümü
2.5. In Vitro Deneyler:
Deney hayvanları, uygulanan kavernozometri sonrasında kanatma (ekssanguinasyon) yöntemiyle öldürülmüştür. In vivo deneyler sonrasında korpus kavernosum dokusu çıkarılıp, ince şeritler haline getirilmiştir. Bir ucu ipek iplik tutucuya, diğer ucu “Grass FTCO3C force displacement transducer”a bağlanmıştır.
Şeritler, Krebs solüsyonu içinde 20 ml’lik organ banyolarına konulmuştur. Solüsyon
%95 O2, %5 CO2 ile sürekli havalandırılarak ve 37 ± 1C ve 1 g gerim altında 1 saat
dengelemeye bırakılmıştır. Mekanik aktiviteler, “MAY recorder equipment computer system” (COMMAT, Ankara, Türkiye) kullanılarak kaydedilmiştir.
Sırasıyla; asetilkolin (ACh, 10-8-10-3 M), elektriksel alan stimülasyonu (EFS, 1-32 Hz), sodyum nitroprussite (SNP, 10-8-10-3 M) ilişkin gevşeme yanıtları, 10-5 M fenilefrin (phe) ile kastırıldıktan sonra alınmıştır. Fenilefrine ilişkin kontraktil yanıtlar da 10-8-10-3 M doz aralığında alınmıştır.
2.6. Total RNA ve mRNA ekstraksiyonu:
Steril şartlarda alınıp sıvı nitrojende dondurulan korpus kavernozum doku örnekleri, moleküler çalışma için kullanılıncaya kadar, -80oC’de saklanmıştır. Moleküler deneyler öncesinde -80oC’den çıkarılan bu dokulardan, Pharmacia Biotech kitleri kullanılarak tRNA' lar izole edilmiştir. Elde edilen bu total RNA'ların 260 nm deki OD değerleri 0.05 ile 2.0 arasında olan örnekler deneye alınmış ve 260nM/280nM'deki OD değerleri de ölçülmüştür. Daha sonra RNA konsantrasyonları (ng/ml)=[(OD260)*dilüsyon faktörü*40ng/ml]/1000 l formülünden hesaplanmıştır.
2.7. RT-PCR ve PCR:
Elde edilen bu total RNA örneklerinden RT-PCR (reverse transcriptase-polymerase chain reaction) tekniği kullanılarak cDNA iplikçiği elde edilmiştir. Bunun için 1µg total RNA'ya karşılık gelen RNA örneğine DEPC H2O eklenerek bu toplam 10µl'ye tamamlanmıştır. 1µl olido dT'nin (Promega) eklenmesini takiben PCR makinesine 10 dk 70oC 'ye konularak ve daha sonra her bir örneğe 9µl RT-PCR karışımı (dNTP 1µl, 0.1MDTT 2µ1, 5Xbuffer 4µl, Superscript 1µl, RN ase 1µl ) eklenerek 42°C 50 dk
ve 95 ° C 5 dk olacak şekilde PCR makinesine konup elde edilen cDNA'lerin hemen kullanılacak bir kısmı -20oC kalan ise –80°C'de saklanmıştır.
Daha sonra PCR tekniği ile DNA polymerase (Taq) enzimi aracılığı ile bu sinyal amplifiye edilmiştir. PCR reaksiyonunda kullanılacak olan primer’lar ayrıca seçilmiştir. Her PCR reaksiyonu için 3µl cDNA, ilgili reseptör primer 2µl (sense), 2µl (antisense); ß-aktin primer 2 µl (sense), 2 µl (antisense); 10*Tfl Buffer 5µl; MgSO4
2.2 µl; dNTP 1 µl ve Tfl (Superscript) (Promega) 0.2 µl kullanılmıştır. Reaksiyon karışımı DNA thermal cycler (PCR makinesi) da ısıtma ve denatüralizasyon basamağı; 94° C 45sn, bağlanma (anneling);45sn ve Uzatma (extension); 72° C 2dk olacak şekilde 30-40 arasında amplifiye edilmiştir. Daha sonra her bir PCR ürününden 25µl 0.5* TBE Buffer'da %2-3'lik agarose jelde 90 dk. elektroforez yapılmıştır. Elektroforezin sonunda jelin sinyalinin fotoğrafı çekildikten sonra NIH IMAGE ile değerlendirmeye alınmıştır.
Primer Sense Antisense
nNOS 5'-GCGGAGCAGAGCGGCCTTAT-3’ 5'-TTTGGTGGGAGGACCGAGGG-3’
COX-1 5’-CCTCACCAGTCAATCCTGT-3’ 5’-AGGTGGCATTCACAAACTCC-3’
Çizelge 2.7. PCR deneylerinde kullanılan primer dizilimleri
2.8. İstatistiksel Analiz:
Tüm frekans ve konsantrasyona bağlı gevşeme yanıtları, fenilefrin ile oluşan kasılma yanıtının yüzdesi olarak, fenilefrine ilişkin kasılma yanıtları ise, mg kasılmanın, mg dokuya oranı olarak hesaplanmıştır. Frekans ve konsantrasyon yanıt eğrileri arasında anlamlı fark olup olmadığını tayin etmek için, istatistiksel
anlamlılık, tek yönlü ANOVA (one-way analysis of variance ANOVA) testi kullanılarak GraphPadPrism-Pro5 bilgisayar programı yapılmıştır. Haftalara göre sıçan ağırlıklarını göstermek üzere, aynı bilgisayar programında, çift yönlü ANOVA (two-way analysis of variance ANOVA) testi kullanılmıştır. Post-testler olarak Bonferroni-posttest kullanılmıştır. Bu çalışmada, çizelge ve şekillerde verilen tüm değerler belli sayıda deney sonucunun ortalamasıdır. pD2 değerleri, agonistlerin konsantrasyon-yanıt eğrilerinde, maksimum etkinin %50’ sini oluşturan yanıtın negatif logaritması olarak hesaplanmıştır. Grup isimleri, kontrol, diabetik (D), aspirin tedavili (ASA), diabetik aspirin tedavili (D+ASA) olarak kısaltılmıştır. İstatistiksel anlamlılık * p<0,05 ve **, p<0,01, ***, p<0,001 olduğunda anlamlı olarak düşünülmüştür.
2.9. Yazım Ve Grafikler
Bu tez, “Microsoft Office-Word-2007” bilgisayar programı ile yazılmış ve çıktılar HP Laser Jet 6P yazıcı ve kısmen de renkli yazıcı kullanılarak alınmıştır. Deney sonuçlarını gösteren grafikler “Microsoft Excel-2007” veri işlem programı kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
3. BULGULAR
3.1. Beden Ağırlıkları ve Kan Şekeri Değerleri:
Tüm gruplardan alınan deney hayvanlarının, beden ağırlığı ve kan şekerlerindeki değişiklikler çizelge 3.1’de toplu olarak, şekil 3.1 ve 3.2 de gösterilmiştir. Beden ağırlıkları, 8 haftalık süre sonunda, kontrollerle karşılaştırıldığında, diabetik ve diabetik-aspirin tedavili grupta anlamlı olarak düşmektedir. Aspirin tedavili grupta beden ağırlıkları 8. haftada anlamlı bir düşüş göstermektedir, ancak bu grupta, sıçan ağırlıkları kendi içinde düşmemiştir. 1.haftadan itibaren kilo alım hızları kontrole göre düşük olduğundan, 8.hafta sonunda elde edilen beden ağırlığı, kontrole göre düşük görünmektedir.
Kontrollerle karşılaştırıldığında, diabetik ve diabetik-aspirin tedavili sıçanlarda, kan şekerleri anlamlı olarak yükselirken, aspirin tedavili grupta beklenildiği gibi anlamlı düşme veya düzelme gözlenmemektedir.
K D K+ASA D+ASA
Beden ağırlığı (g) 326 ± 16,6 286 ± 26,3*** 286 ± 3,83*** 277 ± 22,7***
Kan şekeri (mg/dL) 91,7 ± 0,81 355 ± 41,4*** 88,1 ± 1,33 350± 32,1***
Çizelge 3.1. Deney hayvanlarının ağırlıkları ve kan şekerlerindeki değişiklikler;
***p<0,001 kontrol gruptan anlamlı olarak farklılığı göstermektedir. Grup isimleri, kontrol, diabetik (D), aspirin tedavili (ASA), diabetik aspirin tedavili (D+ASA) olarak kısaltılmıştır.
Beden Agirligi
1 4 8 1 4 8 1 4 8 1 4 8 0
100 200 300
400 K
D K+ASA D+ASA
***
*** **
***
Hafta
Beden Agirligi (gram)
Şekil 3.1. Haftalara göre sıcan ağırlığı değişimleri gösterilmiştir. Her bir sütun
“ortalamalar ± standart hataları” ve “asteriksler” kontrol gruplarından (**p<0,01,
***p<0,001) anlamlı farklılığı göstermektedir (Kontrol n=12, Dia n=6, ASA n=6, Dia+ASA
Kan Sekeri
0 2 4 6 8 10
0 100 200 300 400
500 K
D K+ASA D+ASA
***
***
***
***
***
***
Hafta
Kan sekeri mg/dL
Şekil 3.2. Haftalara göre kan şekeri değişimleri. Her bir nokta “ortalamalar ± ort.
standart hataları” ve “asteriksler” kontrol gruplarından ( ***p<0,001) anlamlı farklılığı göstermektedir (Kontrol n=12, dia n=6, ASA n=6, dia+ASA n=6).
3.2. In vivo çalışma sonuçları (ICP):
Sekil 3.2.1.A Kontrol sıçanlardan elde edilen kavernoz ve kan basınçlarına ilişkin traseler.
Sekil 3.2.1.B Diabetik sıçanlardan elde edilen kavernoz ve kan basınçlarına ilişkin traseler.
Sekil 3.2.1. C ASA tedavili kontrol sıçanlardan elde edilen kavernoz ve kan basınçlarına ilişkin traseler.
Sekil 3.2.1.D ASA tedavili diabetik sıçanlardan elde edilen kavernoz ve kan basınçlarına ilişkin traseler.
Anestezi altında alınan in vivo intrakavernoz basınç değerleri (ICP), karotit arterden alınan ortalama arteriyel basınç değerlerine (MAP) bölünerek her bir grup için ICP/MAP değerleri hesaplanmıştır. Hesaplanan bu değerler diabetin yol açtığı vasküler bozukluklar sonucunda oluşan erektil disfonksiyonun göstergesi olarak
kabul edilmektedir. Elde edilen sonuçlara göre kontrol grubu ile karşılaştırıldığında diabetik grupta istatistiksel olarak anlamlı bir azalma belirlenmiştir (K, 0.45±0.02, n=10; D, 0.17±0.03, n=5, p<0.001). Aspirin tedavisinin ICP/MAP değerleri üzerindeki etkisi değerlendirildiğinde K+ASA grubunda kontrole göre anlamlı bir farklılık bulunamamıştır (K, 0.45±0.02, n=10; K+ASA, 0.42±0.05, n=5, p>0.05). Bir başka ifade ile aspirin tedavisi kontrol hayvanlarda ICP/MAP değerlerini değiştirmemektedir. Buna karşın aspirin tedavisi diabetik gruptaki değerleri kontrol düzeylerine geri çevirmiştir (K, 0.45±0.02, n=10; D+ASA, 0.47±0.06, n=7, p>0.05).
ICP/MAP (7.5 Volt)
0.0 0.2 0.4
0.6 K
D K+ASA D+ASA
***
**
***
ICP/MAP
Şekil 3.2.2 Kontrol, Diabet ve ASA tedavili gruplardan alınan kavernoz dokularda 7.5 volt değerinde elde edilen kavernoz basınç değerlerinin eş zamanlı olarak karotit arterden alınan kan basıncı (Mean Arterial Pressure) değerlerine oranı (ICP/MAP).
Her bir değer “ortalamalar ± standart hataları” ve “asteriksler” kontrol gruplarından (tek yönlü ANOVA, **p<0.01,***p<0,001) anlamlı farklılığı göstermektedir (K, n=10, D n=5, K+ASA n=5, D+ASA n=7).
3.3. In Vitro Çalışma Sonuçları (Organ Banyosu):
3.3.1. Elektriksel Alan Stimülasyonu (EFS) İle Gevşeme Yanıtları:
Şekil 3.3.1.1.A Kontrol sıçanlardan alınan kavernoz dokuda 1, 2, 4, 8, 16 ve 32 Hz değerinde elde edilen gevşeme yanıtlarına ilişkin trase.
Şekil 3.3.1.1.B Diabetik sıçanlardan alınan kavernoz dokuda 1, 2, 4, 8, 16 ve 32 Hz değerinde elde edilen gevşeme yanıtlarına ilişkin trase.
Şekil 3.3.1.1.C ASA tedavili kontrol sıçanlardan alınan kavernoz dokuda 1, 2, 4, 8, 16 ve 32 Hz değerinde elde edilen gevşeme yanıtlarına ilişkin trase.
Şekil 3.3.1.1.D ASA tedavili diabetikl sıçanlardan alınan kavernoz dokuda 1, 2, 4, 8, 16 ve 32 Hz değerinde elde edilen gevşeme yanıtlarına ilişkin trase.
In vitro çalışmalarda kullanılmak üzere hazırlanan dokular, ICP’den sonra izole edilmişlerdir. In vivo deney protokolünün doku yanıtverirliğindeki etkisini değerlendirmek için fenilefrin (10-5 M) ile önkastırılmış kavernoz düz kas şeritlerinin gevşeme profili EFS kullanılarak belirlenmiştir. Kontrol, diabet, aspirin tedavili kontrol ve diabet gruplarına ait EFS gevşeme traseleri Şekil 3.3.1.1.A-D’de gösterilmiştir.
Deney protokolündeki en yüksek frekans olan 32 Hz kullanılarak elde edilen maksimum gevşeme yanıtları değerlendirildiğinde gruplar arasında anlamlı farklılık bulunamamıştır (K, n=10, 37.99±4.55; D, n=5, 26.94±6.23; K+ASA, n=6, 34.88±5.01; D+ASA, n=6, 41.22±6.44) (Şekil 3.3.1.2).
EFS
0 20 40
60 K,
D, K+ASA D+ASA
8 16 32
4 2
1
Hz
% Gevseme
Şekil 3.3.1.2. Kontrol, Diabet ve ASA tedavili gruplardan alınan kavernoz dokularda 1,2,4,8,16 ve 32 Hz değerinde alınan gevşeme yanıtları gösterilmektedir. Her bir nokta “ortalamalar ± standart hata” ile verilmiştir. (K n=12, D n=6, K+ASA n=6, D+ASA n=6).
3.3.2. Sodyum Nitroprussit (SNP) Gevşeme Yanıtları:
0 2
4 6
8 10
0 25 50 75 100
125 K
D K+ASA D+ASA
Log [SNP] (M)
% Gevseme
Şekil 3.3.2. Kontrol, Diabet ve ASA tedavili gruplardan alınan kavernoz dokularda sodyum nitroprusittin farklı konsantrasyonlarında elde edilen gevşemelerine ilişkin doz-yanıt eğrileri. Her bir nokta “ortalamalar ± standart hata” ile gösterilmiştir (K n=12, D n=6, K+ASA n=6, D+ASA n=6).
Nitrik oksit donörü olan sodyum nitroprussid (10-8-10-3M) kümülatif olarak organ banyosuna eklendiğinde, gruplar arasında ne maksimum gevşeme ne de pD2
değerleri arasında anlamlı farklılık bulunamamıştır. SNP doz yanıt eğrilerine ilişkin pD2 değerleri Tablo__ verilmiştir.
K D K+ASA D+ASA
pD2 6.45±0.15 6.01±0.19 6.12±0.05 6.15±0.04
Çizelge 3.3.2. Sodyum nitroprussit gevşemelerine ait pD2 değerleri (p>0.05).
3.3.3. Fenilefrin Kasılma Yanıtları:
Şekil 3.3.3.1.A Kontrol sıçanlardan alınan kavernoz dokuda α-adrenoseptör agonisti fenilefrinin 10-8,10-7, 10-6, 10-5, 10-4 ve 10-3 konsantrasyonlarında elde edilen kasılmalara ilişkin doz-yanıt trasesi
Şekil 3.3.3.1.B Diabetik sıçanlardan alınan kavernoz dokuda α-adrenoseptör agonisti fenilefrinin 10-8,10-7, 10-6, 10-5, 10-4 ve 10-3 konsantrasyonlarında elde edilen kasılmalara ilişkin doz-yanıt trasesi
Şekil 3.3.3.1.C ASA tedavili kontrol sıçanlardan alınan kavernoz dokuda α- adrenoseptör agonisti fenilefrinin 10-8,10-7, 10-6, 10-5, 10-4 ve 10-3 konsantrasyonlarında elde edilen kasılmalara ilişkin doz-yanıt trasesi
Şekil 3.3.3.1.D ASA tedavili diabetik sıçanlardan alınan kavernoz dokuda α- adrenoseptör agonisti fenilefrinin 10-8,10-7, 10-6, 10-5, 10-4 ve 10-3 konsantrasyonlarında elde edilen kasılmalara ilişkin doz-yanıt trasesi
Gruplara ait kavernozal dokularda non-selektif α-adrenoreseptör agonisti fenilefrinin 10-8,10-7, 10-6, 10-5, 10-4 ve 10-3 konsantrasyonlarında elde edilen kasılmalara ilişkin yanıtlar Şekil 3.3.3.1 A, B, C ve D’de gösterilmiştir. Gruplar arasında anlamlı fark bulunmamıştır (K n=12, D n=6, K+ASA n=6, D+ASA n=6) (Şekil 3.3.3.2).
-10 -8 -6 -4 -2
0 20 40 60 80 100
K D K+ASA D+ASA
log [fenilefrin] (M)
mg kasilma/mg doku
Şekil 3.3.3.2. Kontrol, Diabet ve ASA tedavili gruplardan alınan kavernoz dokularda α-adrenoseptör agonisti fenilefrinin farklı konsantrasyonlarnda elde edilen kasılmalara ilişkin doz-yanıt eğrileri.Her bir nokta “ortalamalar ± standart hata” ile gösterilmiştir (K n=12, D n=6, K+ASA n=6, D+ASA n=6).
3.4. nNOS ve COX-1 Ekspresyonları
Şekil 3.4.1.A Kontrol ve diabetik sıçanlardan alınan korpus kavernoz dokuları kullanılarak yapılan PCR deneyleri sonucunda elde edilen nNOS mRNA ekspresyonlarına ilişkin bantlar.
Şekil 3.4.1.B ASA tedavili kontrol ve diabetik sıçanlardan alınan korpus kavernoz dokuları kullanılarak yapılan PCR deneyleri sonucunda elde edilen nNOS mRNA ekspresyonlarına ilişkin bantlar.
Şekil 3.4.1.C Kontrol ve diabetik sıçanlardan alınan korpus kavernoz dokuları kullanılarak yapılan PCR deneyleri sonucunda elde edilen Cox-1 mRNA ekspresyonlarına ilişkin bantlar.
Şekil 3.4.1.D ASA tedavili kontrol ve diabetik sıçanlardan alınan korpus kavernoz dokuları kullanılarak yapılan PCR deneyleri sonucunda elde edilen Cox-1 mRNA ekspresyonlarına ilişkin bantlar.
Aspirin tedavisi kontrol grupta nNOS ekspresyonunu bir ölçüde azaltmasına karşın, bu fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (Şekil 3.4.2.A). Kontrol, diabet ve aspirin tedavili diabet gruplarındaki nNOS ekspresyonları arasında farklılık görünmemektedir (Şekil 3.4.2.A).
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
K D K+ASA D+ASA Bant Yogunlugu (nNOS/BA)
Şekil 3.4.2.A Kontrol, Diabet ve ASA tedavili gruplardan alınan kavernoz dokusundan yapılan PCR deneylerinden elde edilen nNOS ekspresyonlarına ilişkin bant yoğunluklarının aynı dokulardaki BA ekspresyon bantlarına oranı.
Aspirinin etki ettiği COX enzim grubundan COX-1 izoformunun mRNA ekspresyonu aspirin tedavisi olan diabetik grupta artmış, ancak diabetik grupla karşılaştırıldığında anlamlı farklılık bulunamamıştır (Şekil 3.4.2.B). Diğer üç grubun (kontrol, diabet ve aspirin tedavili kontrol) Cox-1 ekspresyonları birbirine çok yakındır (Şekil 3.4.2.B).
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
D K+ASA D+ASA K Bant Yogunlugu (Cox-1/BA)
Şekil 3.4.2.B Kontrol, Diabet ve ASA tedavili gruplardan alınan kavernoz dokusundan yapılan PCR deneylerinden elde edilen Cox-1 ekspresyonlarına ilişkin bant yoğunluklarının aynı dokulardaki BA ekspresyon bantlarına oranı.
