POLİMERİK NANOPARTİKÜL FLORESAN PROBLARLA BAKTERİYAL FİLMLERİN İN-VİVO GÖRÜNTÜLENMESİ
IN VIVO IMAGING OF BACTERIAL FILMS WITH POLYMERIC NANOPARTICLE FLUORESCENCE PROBES
ARAZ NOROUZ DIZAJI
PROF. DR. ERHAN BİŞKİN Tez Danışmanı
Hacettepe Üniversitesi
Lisansüstü Eğitim-Öğretim ve Sınav Yönetmenliğinin Biyomühendislik Anabilim Dalı için Öngürdüğü
DOKTORA TEZİ olarak hazırlanmıştır.
2017
v
vi
vii
i
ÖZET
POLİMERİK NANOPARTİKÜL FLORESAN PROBLARLA BAKTERİYAL FİLMLERİN İN-VİVO GÖRÜNTÜLENMESİ
ARAZ NOROUZ DIZAJI
Doktora, Biyomühendislik Anabilim Dalı Tez Danışmanı Prof. Dr. ERHAN BİŞKİN
20.06.2017, 97 sayfa
Bu tezin amacı floresan özelliği gösteren konjüge polimer problarını kullanarak, gram pozitif olan Staphylococcus aureus bakterilerinin ve bu bakteri tarafından üretilmiş olan biyofilmlerin in-vitro ve in-vivo olarak görüntülenmesidir. Bu amaç için maleimid fonksiyonel grubuna sahip olan DSPE-PEG2000 kullanılmış, 60 saniye 12W güçünde olan mikro uçlu prob sonikatör ile 9 ml su ortamında 1 ml THF çözeltisi varlığında sonike edilmiş, gece boyunca oda sıcaklığında karıştırılmıştır. Böylece konjüge polimerlerin paketlenmesi gerçekleştirilmiş, CPDP-Mal nanokapsüllerin (NK) sentezi gerçekleştirilmiştir. Elde edilen NK’ler Uv-vis spektrofotometre ile karakterize edilmiş, PFBT’ye ait olan karakteristik pik 470 nm’den 480 nm’ye bir kayma göstermiştir.
Oluşan bu pik kayması, PFBT probların DSPE-PEG2000-Mal tarafından paketlenme sonucunda ortaya çıkmıştır. Zeta-sizer ve TEM ile analiz sonucunda, bu NK’lerin dar bir boy dağılımı şeklinde 80nm çapına sahip oldukları tesbit edilmiştir.
Hazırlanan NK’lere spesifik hedeflendirilme özelliği kazandırılması vankomisin ligandının immobilizasyonu ile gerçekleştirilmiştir. Bu amaç için vankomisin molekülleri SH grubu ile fonksiyonelleştirlmiştir. 100 mg satın alınmış vankomisin belli oranlarda DMSO, DMF, HBTU ve DIEA ile 0°C’da reaksiyona girerek di-tiyol bağına sahip bis-vankomisin elde edilmiş, HPLC ile saflaştırılarak üç gün kuru döndürücüde bekletilmiştir. LC-MS ile karakterizasyon sonuçları, bis-vankomisinin sentezlendiğini kanıtlamıştır. TCEP kullanarak di-tiyol bağları koparılmış, elde edilen HS-Van molekülleri sulu bir ortamda CPDP-Mal NK’lerine immobilizasyonu gerçekleştirilmiştir. FTIR analizi ile alınan sonuçlar, vankomisin moleküllerin başarılıyla NK’lere bağlandığını göstermiştir. Sentezlenen HS-Van ve CPDP-S-Van Nk’lerin antibakteriyal özellikleri MİK, MBK ve DDM ile araştırılmıştır. Hazırlanmış olan CPDP-S-Van NK’lerin spesifik hedeflendirilme özellikleri in-vitro koşullarında S.
aureus ve E. coli üzerinde araştırılmış, bu NK’lerin başarılı bir şekilde sadece gram pozitif olan S. aureus’a bağlanması görüntülenmiş/belirlenmiştir. Lab koşullarında S.
aureus tarafından üretilmiş biyofilmlerin görüntülenebilmesini araştırmak için hazırlanmış CPDP-S-Van NK’ler kullanılmıştır, biyofilmlerin görüntülenmesini
ii
gerçekleştirmiştir. NK’lerin sitotoksisite özellikleri MTT testi ile araştırılmış, elde edilen sonuçlara göre kullanılabilecek en yüksek dozda dahi, %90 üzeri hücre canlılığı tesbit edilmiştir. Apoptoz ve nekroz testlerinden alınan sonuçlar ise hücrelerde her hangi bir toksik etki göstermemiştir. Elde edilen sonuçlar, hazırlanmış NK’lerin in-vivo ortamında kullanılabileceğinin bir güvencesidir. CPDP-S-Van NK’lerin in-vivo olarak S. aureus’u spesifik olarak görüntülebilmesini araştırmak için ICR fare hayvan modeli kullanılmıştr. S. aureus ve E. coli bakterileri subkütan olarak fare sırtının sağ ve sol bölgelerine enjekte edilerek, infekte hayvan modeli elde edilmiştir.
İnfekte hayvan modeline kuyruk damarından verilmiş NK’lerin hedeflendirilebilme özellikleri non-invazif canlı hayvan floresan görüntülenme tekniğini kullanarak Maestro EX floresan sistem cihazı ile araştırılmıştır. Sonuçlara göre hazırlanmış olan NK’lerin hedeflendirilmesi başarılıyla gerçekleştirilmiştir.
Anahtar Kelimeler: DSPE-PEG2000-Mal, Konjüge polimerler (CP), CPDP-S-Van NK’ler, Biyofilm, İnfekte hayvan modeli, Canlı hayvan floresan görüntülenme tekniği.
iii
ABSTRACT
IN VIVO IMAGING OF BACTERIAL FILMS WITH POLYMERIC NANOPARTICLE FLUORESCENCE PROBES
ARAZ NOROUZ DIZAJI
Doctor of Philosophy, Department of Bioengineering Supervisor Prof. Dr. ERHAN BİŞKİN
20.06.2017, 97 pages
The aim of this theses is to synthesize polymeric nanoparticle fluorescence probes in order to be used in in-vitro and in-vivo imaging of Staphylococcus aureus and the biofilms produced by these bacteria. 1ml THF solution containing certain amounts of PFBT “[poly(9,9-dioctylfluorene-2,7-diyl-co-benzothiadiazole)]” and DSPE-PEG2000- Maleimid were added to 9ml of DW. The ultra-sonication of this mixture was applied with 12W micro-tip probe sonication for 60s and steered overnight at the room temperature. At the end of this step, packaging of PFBT was done and CPDP-Mal nanocapsules (NCs) were synthetized successfully. Uv-vis spectrophotometery of the NCs was carried out and the results showed the characteristic peak shifting of PFBT from 470nm to 480nm that’s related to successful packaging of PFBT with DSPE-PEG2000-Mals. Zeta-sizer and TEM analysis showed that the prepared NCs have a diameter of 80nm in a narrow distribution.
To gain specific targeting properties for obtained NCs, the immobilization of vancomycin (as a ligand) has been carried out in accordance with the protocol. For this purpose, bis-vancomycin molecules containing di-thiol bond were synthetized and Purification of bis-vancomycin was carried out by implementing HPLC and keeping it for three days at freeze-dryer. The LC-MS analysis of bis-vancomycin showed the related characteristic peaks. The di-thiol bonds of bis-vancomycin were cleaved using TCEP in aqueous environment and obtained SH-Van ligands have successfully immobilized onto CPDP-Mal NCs in accordance with the protocol, which was confirmed by the FTIR spectra of the ligands. Antibacterial properties of prepared SH-Van and CPDP-S-Van NCs were investigated by MIC, MBC and DDM.
The in-vitro specific targeting properties of the CPDP-S-Van NCs were investigated on S. aureus and E. coli by confocal microscopy. Results showed that the NCs were targeted only to S. aureus. The NCs imaging abilities were examined on the biofilm which was produced in laboratory condition by S. aureus. The results manifested that the CPDP-S-Van NCs demonstrate high-level performance in the imaging of S.
iv
aureus biofilms. Cytotoxicity and apoptosis properties of NCs were investigated by MTT/WST-1 and caspase-3 antibody imaging assay. According to the results, cell viability was determined to be over 90% even at the highest dose and no apoptotic properties were detected for NCs. The results manifestly indicate that the prepared NCs can be used for the in-vivo studies. The ICR mouse animal model was used to inspect the specific imaging ability of CPDP-S-Van NCs against S. aureus in in-vivo conditions. Infected animal model was prepared by injecting S. aureus and E. coli bacteria subcutaneously into the right and left backside of the ICR mouse. Specific targeting abilities of NCs were investigated by using non-invasive live animal fluorescence imaging technique by the injection of CPDP-S-Van NCs from tail vein of infected animal model. According to the results the targeting of the prepared NCs has been done successfully.
Keywords: DSPE-PEG2000-Mal, Conjugated Polymers (CP), CPDP-S-Van NCs, Biofilm, Infected animal model, Live animal fluorescence imaging technique.
v
TEŞEKKÜRLER
Bilgi ve tecrübeleri ile tezimin planlanması ve gerçekleştirilmesinde değerli emeği bulunan, daima yol gösteren değerli danışmanım Prof. Dr. ERHAN BİŞKİN’e;
Yardımlarını eksitmden her zaman yardımcı olan değerli hocam Prof. Dr. Tülin KUTSAL’a;
Tezimin izleme komitesinde yer alan ve Jürimde olabilmek için bana zaman ayıran Doç, Dr. Yeşim EKİNCİ’ye;
Tezimde olan nanokapsüllerin sitotoksisite özelliklerinin araştırması için bana yardımcı olan Doç. Dr. Mustafa TÜRK’e;
Çin cümhüriyeti Nankai Üniversitesinde tezimin partikül sentezi ve İn-vivo çalışmalarımı yapmama imkan sunan Prof. Dr. Deling KONG ve Dr. Ding DAN’a;
Doktora süreci boyunca 1001 ve 1003 projeleri kapsamında bana mali destekte bulunan TÜBİTAK’a;
Kısmi destekleri için Nano-Bacteriophage ve ABREM projelerin’e;
Ayrıca tezimin antibakteriyal deneylerini yapabilmem için bakteri ve besiortamı ismarlayan ve bana yardımcı olan arkadaşım Dr. Farzin ASGHARI SANA’ya;
Her zaman yardımlarını benden eksik etmeyen arkadaşım Matin YAZDANI, Ehsan SANATTALAB, Oya BAL ve Aliakbar Ebrahimi’ye;
Beni bu güne kadar destekleyen ve benim için kendilerini zor duruma atan canım aileme;
Sonsuz teşekkürlerimle. Araz Norouz Dizaji.
vi
SİMGELER VE KISATMALAR
ATCC American Type Culture Collection
CP Konjüge Polimerler
CPDP-Mal CP-yüklü DSPE-PEG- maleimid nanokapsüller
DDM Disk Difüzyon Metodu
DIEA N, N-Diizopropiletilamin
DMSO Dimetil sulfoksit
DSPE [1,2-Distearoil-sn-gliserol-3-fosfatidiletanolamin- Poli(etilen glikol) maleimid]
EPR Enhanced Permeability and Retention effect
FTIR. Fourier transform infrared spectroscopy
HBTU N, N, N ', N'-tetrametil-O- (1H-benzotriazol-1-il) üronyum heksaflorofosfat, O- (Benzotriazol-1-il)-N, N, N', N'-tetrametilüronyum heksaflorofosfat
HPLC High-Performance Liquid Chromatography
HS-Van Tiyol uclu Vankomisin
ICR Institute of Cancer Research
LC-GS Liquid Chromatography-Mass Spectrometry
LUV Larg Unilamellar Vesicle
M.W Molecular Weight
Mal. Maleimid fonksiyönel grubu
MBK. Minimal Bakteriyostatik Konsantrasyonunu
MHA Mueller Hinton Agar
MHB Mueller Hinton Broth
MİK Minimal İnhibitör Konsantrasyonunu
MLV Multilamellar Vesicle
MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
Diphenyltetrazolium Bromide)
MVV Multilamellar Vesicular Vesicle
NB Nutrient Broth
NK Nanokapsül
PEG Polietilenglikol
PFBT [Poli(9,9-dioktilfluoren- 2,7-diil-ko-benzotiadiazol)]
QY Quantum Yield
SUV Small Unilamellar Vesicle
TCEP Tris (2-karboksietil) fosfin hidroklorür
TEM Transmission Electron Microscopy
THF Tetrahidroforan
TSB ULV
Tryptic Soy Broth Unilamiller Vesicle
Van Vancomisin
vii
İÇİNDEKİLER
Sayfa
ÖZET ... I ABSTRACT ... III TEŞEKKÜRLER ... V SİMGELER VE KISATMALAR ... VI İÇİNDEKİLER ... VII ÇİZELGELER ... XI ŞEKİLLER ... XII
1. GİRİŞ ... 1
2. GENEL BİLGİLER ... 4
2.1. Nanoteknoloji ... 4
2.2. Nanomalzemeler ... 4
2.2.1. İnorganik Nanopartiküller ... 4
2.2.2. Organik Nanopartiküller... 5
2.3. Organik Nanotaşıyıcılar ... 5
2.3.1. Nanokapsüller (Miseller, Lipozomlar) ... 6
2.3.1.1. Lipozomların Sınıflandırılması ... 6
2.3.1.2. İnkapsülasyon Teknikleri ... 8
2.3.1.3. Lipozom Sentezinde Kullanılan Lipitler ... 10
2.3.1.3.1. [1,2-Distearoyl-sn-glycerol-3-phosphatidylethanolamine– Poly(ethyleneglycol)] (DSPE-PEG) blok kopolimerler ... 12
2.3.2. Nanokapsüllerin Spesifik Olarak Hedeflendirilmesi ... 12
2.3.2.1. Biyolojik Hedeflendirme Ajanı (Ligand) ... 12
2.3.2.2. Antibiyotik Temelli Ligandlar ... 13
2.3.2.2.1. Vankomisin ... 15
2.4. Floresan Problar ... 17
2.4.1. Konjuge Polimerler (CP)... 18
2.4.1.1. Poli(9,9-dioktilfloren- 2,7-diil-ko-benzotiadiazol) ... 20
2.5. Biyolojik Görüntülenme ... 21
2.5.1. Floresan Görüntülenme ... 23
2.5.2. Floresan Mikroskopu ... 23
viii
2.6. Bakteri ... 25
2.6.1. Bakterilerin Hücresel Yapısı ... 25
2.6.2. Biyofilm... 26
2.6.2.1. Biyofilm Yaşam Döngüsü ... 26
2.6.2.2. Biyofilmleri İçeren İnsan Bakteriyal Enfeksiyonları ... 27
2.7. Bakterilerin İn-vivo Floresan Görüntülenmesi ... 28
3. DENEYSEL ÇALIŞMALAR ... 30
3.1. Kullanılan Malzemeler ... 30
3.2. Floresan Probu Taşıyan DSPE-PEG2000 Malimid Fonksiyonelli Nanokapsüllerin Hazırlanması (CPDP-Mal NK’ler). ... 30
3.3. Tiyol Fonksiyonelli Vankomisin Hazırlanması ... 31
3.3.1. Hazırlanan Tiyol Uclu Vankomisinin Karakterizasyonu ... 33
3.3.2. Sentezlenmiş Bis-Vankomisin ve HS-Van’ların MALDI Kütle Spektroskopisi33 3.4. Tiyol Uclu Vankomisinin CPDP-Mal NK’lerin Üzerine İmobilizasyonu ... 33
3.5. Elde Edilen NK’lerin Memeli Hücrelerinde Gösterdiği Sitotoksisite ve Apoptozis Etkilerinin Araştırılması. ... 35
3.5.1. WST-1 Tekniği ile CPDP-Mal NK’lerin L929 Fare Fibroblast Hücrelerin Üzerinde Gösterdiği Sitotoksisite Etkilerinin Araştırılması ... 35
3.5.2. Hazırlanmış CPDP-S-Van NK’lerin NIH/3T3 Fare Embriyonik Fibroblast Üzerinde Gösterdiği Sitotoksisite Özellikleri ... 36
3.5.3. Kazpas 3 Antikor Boyaması ile CPDP-Mal NK’lerin L929 Fare Fibroblast Hücrelerin Üzerinde Gösterdiği Apoptotik Etkilerinin Araştırılması ... 36
3.6. Hazırlanan HS-vankomisin, CPDP-S-Van NK’lerin Antibakteriyal Özelliklerinin Araştırılması ... 37
3.6.1. MİK ve MBK Çalışmaları ... 37
3.6.2. DDM Çalışmaları ... 39
3.7. Biyofilmlerin Üretimi ... 40
3.7.1. Üretilmiş Olan Biyofilm Niteliğinin Belirlenmesi ... 41
3.8. Biyofilm ile CPDP-S-Van NK’lerin Etkileşimi ... 42
3.9. Hazırlanan CPDP-S-Van NK’lerin Gram Pozitif Bakteriler İçin Hedeflendirme Özgüllüğünün Araştırılması ... 43
3.9.1. S. aureus Bakterisine Özel Hedeflendirilmiş CPDP-S-Van NK’lerin Konfokal Mikroskopu ile Belirlenmesi ... 44
3.9.2. CPDP-S-Van NK’lerin S. aureru Etkileşiminin Görüntülenmesi ... 44
ix
3.10
. İn-vivo Çalışmaları ... 45
3.10.1. İnfekte ICR Fare Modelinin Hazırlanması ... 45
3.10.2. CPDP-S-Van NK’lerin Farenin Enfekte Bölgesini Spesifik Olarak Görüntülenmesi ... 45
3.10.3. Hayvanın Canlı Floresan Görüntülenmesi... 46
4. SONUÇ VE TARTIŞMA ... 47
4.1. CPDP-Mal NK’ler ve HS-Van Moleküllerin Karakterizasyonu ... 47
4.1.1. UV-Vis Spektrofotometre Analiz Sonuçları ... 47
4.1.2. Hazırlanmış HS-vankomisin’in Sıvı Kromatografisi-Gaz Spektroskopisi (LC- MS) ile Karakterizasyonu ... 48
4.1.3. Bis-Vankomisin ve HS-Van’ların MALDI Spektrometre Sonuçları ... 48
4.1.4. Hazırlanmış Bis-vankomisin ve CPDP-S-Van NK’lerin FTIR ile Karakterizasyon Sonucu ... 49
4.1.5. CPDP-Mal ve CPDP-S-Van NK’lerin DLS Analiz Sonuçları ... 51
4.1.6. CPDP-Mal ve CPDP-S-Van NK’lerin TEM Görüntülenme Sonuçları ... 52
4.2. Elde Edilen NK’lerin Memeli Hücrelerinde Gösterdiği Sitotoksisite ve Apoptozis Etkilerinin Araştırılması ... 53
4.2.1. CPDP-Mal NK’lerin WST-1 Yöntemi ile Elde Edilen Sitotoksisite Sonuçları . 53 4.2.2. CPDP-S-Van NK’lerin 3 NIH/3T3 Fare Embriyonik Fibroblast Hücreleri Üzerinde Sitotoksisite Araştırma Sonucu ... 54
4.2.3. Kazpas 3 Antikor Boyama Tekniği Kullanarak CPDP-Mal NK’lerin Apoptoz Özelliklerin Belirlenmesi ... 55
4.3. Hazırlanan HS-vankomisin, CPDP-S-Van NK’lerin Antibakteriyal Özelliklerinin Araştırılması Sonucunda Elde Edilen Sonuçlar ... 57
4.3.1. MİK ve MBK Test Sonuçları ... 57
4.3.2. DDM Analiz Sonuçları ... 59
4.4. S. aureus (ATCC 25923), S. epidermidis (ATCC 12228) ve S. epidermidis (ATCC 35984) Bakteriler ile Hazırlanmış Biyofilmler ... 60
4.5. Biyofilm ile CPDP-S-Van NK’lerin Etkileşim Sonucu ... 63
4.6. CPDP-S-Van NK’lerin S. aureus’a Spesifik Bağlanabilme Özelliklerinin Araştırma Sonuçları... 64
4.6.1. S. aureus Bakterisine Özel Hedeflendirilmiş CPDP-S-Van NK’lerin Konfokal Mikroskopu Ile Belirlenmesi ... 64
x
4.6.2. Hedeflendirilmiş CPDP-S-Van NK’lerin S. aureus ile Etkileşiminin TEM
Görüntülenme Sonuçları ... 67
4.7. S. aureus Bakterisinin İn-Vivo Görüntülenmesi ... 69
5. GENEL SONUÇLAR... 72
6. KAYNAKLAR ... 76
ÖZGEÇMİŞ ... 96
xi
ÇİZELGELER
Sayfa Çizelge 2.1. Lipozom yapısını elde etmek için kullanılan lipidler. ... 11 Çizelge 2.2. E. coli’ye karşı hedeflenme ajanı olarak kullanılan ẞ-laktam antibiyotik ligand’lar [83]. ... 14 Çizelge 2.3. Biyolojik sistemlerde yaygın şekilde kullanılan floresan probların listesi ve onlara ait uygulamalar. ... 18 Çizelge 2.4. Görüntülenme amaçlı kullanılan floresan mikroskop türleri. ... 24 Çizelge 2.5. İnsan vücudunda biyofilm oluşturan bakteriyal enfeksiyonları [177]. .... 28 Çizelge 3.1. Antibakteriyal ve biyofil çalışmalarına standard bakterileri ... 37 Çizelge 3.2. Kullanılan Bekteri/NK orani ... 44 Çizelge 4.1. PFBT, DSPE-PEG2000-Mal, HS-vankomisin ve CPDP-S-Van NK’lerden elde edilen önemli pikler. ... 50 Çizelge 4.2. CPDP-Mal NK’lerin sitotoksisite sonuçlarının L929 hücre hattında derişimlere bağlı % canlılık oranı. ... 53 Çizelge 4.3. Üç farklı bakteri üzerinde elde edilen MİK ve MBK değerleri ... 59 Çizelge 4.4. HS-vankomisin ve CPDP-S-Van NK’lerin standard bakterilerde oluşturmuş inhibisyon çap değerleri. ... 60
xii
ŞEKİLLER
Sayfa Şekil 2.1. A) Lipozom ve B) misel yapısının şematik gösterimi [33]. ... 6 Şekil 2.2. Lipozom oluşmasının şematik gösterimi [54]. ... 10 Şekil 2.3. Malimid fonksiyonellenmiş DSPE-PEG molekülün kimyasal yapısı [65]. .. 12 Şekil 2.4. Vankomisin’nin kimyasal yapısı [97]. ... 15 Şekil 2.5. Vankomisin etki mekanizmasının şematik gösterilişi [99]. ... 16 Şekil 2.6. Vankomisin ile peptidoglikan bölgesindeki açil-D-alanin-D-alanin kalıntısı arasında etkileşim [101]. ... 16 Şekil 2.7. Yaygın olarak kullanılan bazı konjüge polimerlerin kimyasal yapılarının adapte edilmiş şekli [140]. ... 19 Şekil 2.8. Jablonski diyagramın şematik bir çizimi. IC iç dönüşüm, ISC sistemler arası çapraz dönüşüm, S0 enerji temel düzeyi, S1 ve Sn uyarılmış tekil düzeyleri ve T1
uyarılmış üçlü düzey anlamına gelmektedir [141]. ... 20 Şekil 2.9. PFBT konjuge polimerin moleküler yapısı ve ışık uyarılma, yayma özellikleri [146]. ... 21 Şekil 2.10. Biyolojik sistem görüntülenme tekniklerinde ortaya çıkan gelişmelerin tarihçesi [118]. ... 22 Şekil 2.11. Gram pozitif ve gram negatif bakterilerin hücresel duvar yapılarının şematik gösterimi [176]. ... 25 Şekil 3.1. Bis-vankomisin sentezinin şematik çizimi. ... 32 Şekil 3.2. İmmobilizasyon tekniklerinde kullanılan tiyoeter bağ oluşumunun A) mekanizması, B) şematik çizimi. ... 34 Şekil 3.3. A) 50 nm geçirgenlik sınırlı gözeneklere sahip olan diyaliz membranı B) CPDP-S-Van/HS-Van karışım içeren diyaliz membranı. ... 35 Şekil 3.4. A) HS-vankomisin ve B) CPDP-S-Van NK’lerin MİK ve MBK testi için uygulanan derişim miktarları ve standard bakteri taslağının şematik çizimi. ... 39 Şekil 3.5. Uç farklı bakteri üzerinde A) standard vankomisin ile DDM, B) 20 ve 2 µg derişimde HS-vankomisin (disklerde A ve B harfları ile isimlendirilmiş) ve CPDP-S- Van NK’lerin (disklerde C harfı ile isimlendirilmiş) DDM testlerin şematik bir tastağı.40 Şekil 3.6. Biyofilm oluşumunun araştırılması için uygulanmış olan taslağın şematik gösterimi. ... 41
xiii
Şekil 3.7. S. aureus kullanarak hazırlanmış olan biyofilmlerin CPDP-S-Van NK’ler ile etkileşimi. ... 42 Şekil 3.8. İnfekte hayvan modelin hazırlanması ... 45 Şekil 3.9. Non-invazif canlı hayvan floresan görüntülenme için kullanılan Maestro EX floresan görüntülenme sistemi (CRi, Inc.) ... 46 Şekil 4.1. PFBT ve CPDP NK’lerin UV-Vis spektrumları. ... 47 Şekil 4.2. Hazırlanan HS-vankomisin’nin LC-MS spektrumları ... 48 Şekil 4.3. Sentezlenmiş A) Bis-Van ve B) HS-Van moleküllerin MALDI spektrumları.
... 49 Şekil 4.4. A) PFBT, B) DSPE-PEG2000-Mal, C) HS-vankomisin ve D) CPDP-S-Van NK’lerin FTIR spektrumları. ... 51 Şekil 4.5. A) CPDP-Mal NK, B) CPDP-S-Van NK’lerin DLS çap dağılımının ortalaması, C) CPDP-Mal NK ve D) CPDP-S-Van NK’lerin zeta potansiyel değerlerinin grafiği. ... 52 Şekil 4.6. A) CPDP-Mal ve B) CPDP-S-Van NK’lerin TEM cihazı ile alınan görüntüleri. ... 53 Şekil 4.7. CPDP-Mal NK’lerin sitotoksisite sonuçlarının L929 hücre hattında derişimlere bağlı %canlılık oranı. ... 54 Şekil 4.8. CPDP-S-Van NK’lerin 3 NIH/3T3 fare embriyonik fibroblast hücreleri üzerinde gösterdiği sitotoksisite etkisi. ... 54 Şekil 4.9. A) 0, B) 0.37 nM, C) 0.75 nM, D) 1.5 nM ve E) 3 nM CPDP-Mal NK’ler ile muamele edilmiş L929 fare fibroblast hücre hatının ışık mikroskop görüntüleri.
Kullanılmış en yüksek CPDP-Mal NK’lerin L929 hücrelerin üzerinde herhangi bir apoptozik etki göstermemiştir. ... 56 Şekil 4.10. Kazpas 3 antikor boyaması ile A) 0, B) 0.37, C) 0.75, D) 1.5 ve E) 3 nM CPDP-Mal NK’lerin L929 fare fibroblast hücre hattı üzerinde gösterdiği apoptosis etkisinin ışık mikroskop görüntüleri. ... 57 Şekil 4.11. A) HS-vankomisin, B) CPDP-S-Van NK’lerin MİK ve MBK test sonuçları.
... 58 Şekil 4.12. 30µg vankomisin içeren standard diskin ATCC 35984, 12228 ve 25923 bakterileri üzerinde gösterdiği inhibisyon sonuçlarının görüntüsü. ... 59 Şekil 4.13. S. epidermidis (ATCC 35984), S. epidermidis (ATCC 12228) ve S. aureus (ATCC 25923) bakteriler üzerine A) 20 µg HS-vankomisin, B) 2 µg HS-vankomisin ve C) CPDP-S-Van NK’lerin DDM test sonuçları. ... 60
xiv
Şekil 4.14. A) S. aureus (ATCC 25923), B) S. epidermidis (ATCC 12228) ve C) S.
epidermidis (ATCC 35984) bakterilerin biyofilm oluşturmasını gösteren kristal viole UV-Vis absorbanslarının grafiği, D) 3 grafiğin zamana karşı OD595 değerlerinin grafiği. ... 61 Şekil 4.15. Üç farklı bakteri suşun tarafından üretilmiş biyofilmlerin A) boyanmamış ve B) kristal viyole ile boyanmış görünüşlerin bir fotoğrafı. ... 62 Şekil 4.16. S. aureus kullanarak A) 24, B) 48 ve C) 72 saat sonra üretilmiş biyofilmlerin boyanmamış, D) 24, E) 48 ve F) 72 saat sonra bu filmlerin kristal viyole ile boyanmış ışık mikroskobu görüntüleri. ... 63 Şekil 4.17. S. aureus kullanarak hazırlanan biyofilmlerin CPDP-S-Van NK’ler ile A ve C) ışık, B ve D) floresan mikroskopu görüntüleri. ... 64 Şekil 4.18. CPDP-S-Van NK’lerin spesifik bir olarak S. aureus’a bağlanmasının konfokal mikroskopu görüntülenmesi. ... 66 Şekil 4.19. A) S. aureus bakterisi ile etkileştirilmiş CPDP NK’ler, B) ortamda serbestce dolaşan CPDP NK’ler ve C) üzerine herhangi bir CPDP NK bağlanmamış S. aureus’un TEM görüntüleri. ... 67 Şekil 4.20. A) S. aureus ile CPDP-S-Van NK’lerin spesifik etkileşimi, B, C ve D) ayni görüntünün yakınlaştırlmış farklı bölgelerin TEM görüntüsü. ... 68 Şekil 4.21. CPDP-S-Van NK’lerin bakteriye bağlanma mekanizmasının çizimi. ... 69 Şekil 4.22. Fare sırtının sağ ve solunda S. aureus ve E. coli bakterileri ile oluşturulmuş enfeksiyon bölgelerin CPDP-Mal NK’ler ile canlı in-vivo görüntüleri.
CPDP-Mal NK’lerin A) normal görüntüleme (floresansız) B) 1, C) 3 ve D) 5 ve E) 24 saat intravenöz injeksiyonundan sonra alınan floresans görüntüler. ... 70 Şekil 4.23. Fare sırtının sağ ve solunda S. aureus ve E. coli bakterileri ile oluşturulmuş enfeksiyon bölgelerin CPDP-S-Van NK’ler ile canlı in-vivo görüntüleri.
CPDP-S-Van NK’lerin A) enjekte edilmeden çnce, B) 1, C) 3 ve D) 24 saat intravenöz injeksiyonundan sonra alınan görüntüler. ... 71
1
1. GİRİŞ
İnsanoğlu yaşam boyunca çeşitli hastalıklarla karşılaşmış ve büyük bir çabayla bu hastalıklarla mücadele etmiştir. Bu hastalıklar bazen başka bir mikroorganizma veya parazitler tarafından meydana gelmiş, kimi zaman ise vücudun kendisinden kaynaklanarak ölümlere sebep olmuştur. Zaman içinde insanlar elde ettiği tecrübeler sayesinde gösterilen septomların hangi hastalığa ait olduğunu anlıyarak hastalığın teşhisini öğrenmişlerdir. Bu yaşam ve ölüm mücadele sürecinde doğanın sunmuş olduğu doğal malzemeleri kullanarak, hastalıkların tedavisini öğrenmişlerdir. Milattan önce 1550 yılında eski mısırda bal ve domuz yağı ile emdirilmiş yara bantları kullanılarak, yaralarda enfeksiyonların ortaya çıkmasına engel oluşturmuşlardır.
Günümüzde bal’da önemli miktarlarda bakterileri öldürebilen hidrojen peroksidin bulunduğu bilinmektedir [1]. Eski Sırbistan, Çin ve Yunanistan da ezilmiş küflü ekmeğini yara üzerine koyarak, enfeksiyonlara karşı bir merhem icat etmişlerdir.
Penicillium spp. küflerin antibiyotik üretim yeteneğine sahip olmaları günümüzde bilinen bir konudur [2].
Asırlar geçtikçe enfeksiyonlara karşı kullanılabilen yöntem ve maddeler elde bulunmuştur. İnfeksiyon ve bakteri kaynaklı olan hastalıkların tedavisi antibiyotiklerin keşif ve saflaştırmasıyla birlikte gerçekleştirilmiştir. 1874 yılında ilk kez William Roberts mavi peynirde olan Penicillium glaucum tarafından oluşan küf sayesinde herhangi bir bakteriyal kontaminasyonun olmadığını fark etmiştir. Bir kaç yıl sonra Louis Pasteur tarafından yürütülen araştırma sonucunda Penicillium notatum küfünü bulunduran ortamlarda Bacillus anthracis bakterilerinin üreyemediğini fark etmiştir.
1928 yılında Alexander Fleming bazı küflerin antibakteriyal özelliği gösteren proteinler sentezlediğini tesbit ederek ilk kez penisilin terimini kullanmıştır. Bu madde ilk kez 1942 yılında Ernst Chain ve Howard Florey tarafından izole edilerek, tıp dünyasında büyük bir devrim yaşatmışlardır. Daha sonra farklı küfler ve mikroorganizmalar tarafından üretilen antibiyotikler izole edilmiş, biyoteknoloji bilimi yardımıyla yüksek miktarlarda antibiyotikler üretimi gerçekleştirilmiştir. Genetik mühendisliği ise yeni özellikler gösteren antibiyotiklerin icadına büyük bir katkıda bulunmaktadır. Günümüzde çeşitli nesillere sahip yüzden fazla antibiyotiğin varlığı bakteriler tarafından oluşan hastalıkların tedavisinde yüksek derecede bir başarı ve güvene neden olmaktadır. Ara sıra bakterilerde oluşan antibiyotik dirençleri nedeniyle yeni antibiyotiklerin tasarım ve sentez araştırmaları hiç durmadan devam etmektedir.
2
Tedavi amaçlı kullanılan ilaçların hemen hemen tümünde istenmeyen yan etkiler görülmektedir. Bu ilaçların bir kısmında ise yüksek derecede toksisiteye sahip olmaları nedeniyle kullanılabilmeleri sınırlı bir seviyededir. Örneğin kemoterapi için yaygın şekilde kullanılan ilaçlar sadece kanserli hücrelere sınırlı kalmayıp, sağlıklı hücreler üzerinde benzer şekilde etki gösterebilmektedir. Son yıllarda bu handikapların azalmasına yönelik bir çok araştırma grubu tarafından çalışmalar yürütülmüştür. Bu soruna bulabildikleri en iyi çözüm ise ilaçların hedeflendirilmesi ve spesifik olarak sadece istenen hücrelere yönlendirilmesidir. İlaçların sadece hedef hücrelere gitmesi ve bu ilaçların serbest şekilde kan dolaşımında olmasını gerçekleştirmek için, bu ilaçların taşıyıcılar içinde paketlenmesi gerekmektedir. Bir çok grup tarafından farklı malzemeler kullanarak ilaçların taşıyıcılar içinde paketlenmesi gerçekleştirlmiştir. İlaç taşıyıcı için yaygın olarak polimerler kullanılmaktadır. Kullanılan bu polimerlerin ortak noktası onların yüksek derecede biyouyumluluk özelliğine sahip olmalarıdır. Önemli olan diğer bir özellik ise, hazırlanan taşıyıcıların en fazla 250nm’lik bir çapa sahip olmasıdır. Aksi taktirde vücudun ince olan damarlarda tıkanıp, daha büyük sorunlara yol açabilmektedir.
Nanotaşıyıcıların sentezinde bir çok polimer kullanılsa da, en çok tercih edilen malzeme hücre zarına yakın olan çeşitli fosfolipidlerdir. Bu malzeme ilaç içeren sulu bir ortamda bipolar özelliğinden dolayı çift katmanlı bir yapı oluşturarak, ortamda olan ilacı kendi yapısının merkezinde hapsedebilmektedir. Bu malzemenin bir avantajı ise, istenen hücreye bağlandıktan sonra hücre zarı ile birleşerek, içinde olan ilacı hücreye verebilmesidir. Bu malzemenin diğer bir avantajı ise kolayca fonksiyonelleşebileceği ve dolayısı ise amaca bağlı olarak gereken ligand molekülleri ile immobilize edebilmesidir.
Paketlenmiş ilaçların hedeflenmiş hücrelere ulaşması ve sadece istenen hücrelere bağlanmasını sağlamak için ise özel hedefleme molekülleri (ligand) kullanılmaktadır.
Kullanılan ligandların biyouyumluluk, düşük miktarda yüksek hasasiyet ve nanotaşıyıcılara kovalent gibi kuvvetli bağlar ile bağlanması gibi bazı özelliklere sahip olmaları gerekmektedir. Nanotaşıyıcıların hedeflendirilmesinde kullanılan ligandlar, biyolojik kaynaklı veya sentetik olarak elde edilebilmektedir. Ligandlar çoğu zaman sadece hedeflendirme ajanı olarak görev yapsa da, bazen aynı zamanda tedavi için de kullanılabilmektedirler. Bu tür ligandlar hem hedeflendirme ve hem tedavi özelliğine sahip olmalarından dolayı bi-fonksiyonelli ligandlar olarak adlandırılabilirler.
3
Bu ligandlara en iyi örnek antibiyotiklerdir. Böylece bu antibiyotikler ile hedeflendirilmiş olan nanotaşıyıcılar aynı zamanda hedef bakterileri üzerinde antibakteriyal özelliği göstererek, hem hedeflenme hem de tedavi görevini aynı zamanda üstlenebilmektedir.
Vücut içinde hastalıklı hücrelerin görüntülenmesi bu hastalıkların morfolojik görüntüsü ve vücut içinde dağılımı hakkında bilgi kazandırarak, hastalığın tam zamanlı izlenmesi ve tedavisinde büyük bir katkıda bulunmaktadır. Hücre görüntülenmesi için genel olarak floresan özelliğe sahip biyouyumlu moleküller kullanılmaktadır. Floresan özelliği gösteren bu moleküller sulu bir ortamda nanotaşıyıcılar tarafından paketlenerek, ligandlar tarafından spesifik olarak özel reseptora sahip olan hücrelerin üzerine bağlanarak görüntülenme gerçekleştirilir.
Kullanılan moleküller amaca uygun bir biçimde floresan özelliği gösteren polimer veya monomer olabilmektedir. Hücre görüntülenmesi in-vitro ve in-vivo şeklinde gerçekleştirilir. Genel olarak hazırlanmış floresan boyalar taşıyan nanoparçacıklar ilk aşamada in-vitro ortamında hücreler üzerinde seçiciliği araştırılır, alınan sonuçlara yönelik in-vivo ortamında hedef hücrelerin görüntülenmesi gerçekleştirilir.
Bu tezin amacı floresan özelliği gösteren konjüge polimer problarını kullanarak, gram pozitif olan Staphylococcus aureus bakterilerinin ve bu bakteri tarafından üretilmiş olan biyofilmlerin in-vitro ve in-vivo görüntülenmesidir.
4
2. GENEL BİLGİLER
2.1. Nanoteknoloji
Nanoteknoloji çok hızla ilerleyen ve elektronik, malzeme ve tıp’ta büyük bir katkıya sahip olan bir bilim dalıdır [3]. Amerikan Ulusal Nanoteknolji Girişimi’ne göre en az tek bir boyutunda 1-100 nm ölçüde olan herhangi bir malzemeyi kapsayan mühendislik ve imalat dalı olarak tanımlanmaktadır [4]. Bu kritik ölçünün altında olan malzemeler yeni ve alışık olmayan işlevlerinden yararlanarak, cihaz imalatı, güneş enerji üretimi ve tıp’ta ilaç üretimi gibi geniş bir uygulamaya sahiptir [5]. Biyouyumlu özelliğine sahip olan malzemeler sayesinde vücutta herhangi bir toksik etki göstermeyen ve kan dolaşım sisteminde taşınabilir özelliğe sahip nanopartiküller tanı, kanser tedavisi ve ilaç taşıyan araçlar olarak tıp’ta büyük bir uygulama göstermektedir [4, 6, 7].
2.2. Nanomalzemeler
Nanomalzemeler sahip olduğu olağanüstü elektriksel, optik ve katalitik özellikleri nedeniyle son yıllarda ilgi odağı haline gelmiştir. Fizik, kimya, malzeme bilimleri, mekanik ve elektrik mühendisliği, bilgisayar ve sağlık gibi birçok araştırma alanlarında geniş bir uygulama göstermektedirler [8]. Bu malzemelerin boyut ve morfolojik özelliklerinin onların işlevleri üzerinde belirgin bir şekilde etki gösterdiği bilinmektedir. Bu nedenle çeşitli malzeme ve teknikler kullanılarak farklı boyut ve morfolojik özelliklere sahip nanomalzemelerin elde edilmesi mümkün olmaktadır [9].
Nanomalzemeler iki veya üç boyutlu olarak, yüzey üzerinde veya parçacık şekilde sentezlenebilmektedir. Organik veya inorganik malzemeler kullanarak, farklı uygulamalara uygun nano-malzemeler hazırlanmaktadır. Demir oksit, gümüş, altın, titanyum, platin ve alimünyum gibi metal malzemelerin kullanımı sonucunda metalik nanomalzemeler (nanopartikül, nanoçubuk, nanokafes, kuantum noktalar) elde edilirken, organik malzemeler ile misel, lipozom, karbon nanotüpler elde edilebilmektedir [10-12].
2.2.1. İnorganik Nanopartiküller
Gümüş, demir, altın, platin, titanyum ve silika gibi malzemelerin yığın formları tıp’ta birçok uygulamaya sahipken, bunların nanoparçacık şekilleri ise teşhis, tedavi ve ilaç taşınımı için geniş çapta kullanılmaktadırlar [13-18]. Bu malzemelerin nano çapında gösterdikleri sıradışı özelliklerinden dolayı, fototermal, görüntülenme ve yüksek kapasitede ilaç taşınımı için kullanılmaktadırlar [19-21]. Altın ve gümüş
5
nanopartiküllerin sahip olduğu SPR özelliği, bu malzemelerin termoterapi ve görüntülenme uygulamaları için uygun seçenek haline getirmiştir [22, 23]. Bir çok grup tarafından yaygın şekilde kullanılan bu malzemeler üzerinde yapılan sitotoksisite incemeleri sonucu, biyolojik sistemler için minimum düzeyde toksik etki gösterdikleri belirlenmiştir. Dolayısı ise in-vivo çalışmaları için güvenilir bir malzeme oldukları kanıtlanmıştır [24, 25]. İnorganik nanopartiküllerin diğer bir avantajı ise hetero-bi-fonksiyonel molekülleri tarafından kullanıma uygun bir şekilde fonksiyonelleştirilebilmeleridir. Böylece spesifik olarak kanser tedavisi ve ilaç dağıtımında hedeflendirilmeleri sağlanabilmektedir [26, 27].
2.2.2. Organik Nanopartiküller
Daha çok polimerik nanopartiküller olarak bilinen bu malzemeler sentetik ve doğal olarak ikiye ayrılırlar. Metalik nanopartiküllerin aksine bu partiküller daha cok cihaz iletkenlik ve güneş pillerinde değil, biyolojik sistemler için uygun olmaktadırlar [28].
Bu nanopartiküllerin sentezi için bir çok değişik yöntem bulunması nedeniyle, uygulamaya yönelik istenen özellikleri taşıyan parçacıkların sentezine olanak kazandırılmıştır [29, 30]. Doğal olan biyopolimerik nanopartiküller canlı sistemler için minimum toksisite ve yan etki risklerine sahip oldukları ve vücut biyolojisine gösterdiği benzerliklerden dolayı bir çok uygulamaya sahiptir. Bu malzemelerin en öneli avantajı ise onların daha kolay ve kalıcı şekilde uygulamaya yönelik fonksiyonelleştirilebilmesidir [31]. Bunların bazılarında hücre zarına yüksek benzerliğe sahip olması, bu malzemelerin nano-mikro boyutlarda ilaç paketlemesinde ve spesifik olarak istenen hücre veya dokuya taşımasına olanak sağlamaktadır [32].
2.3. Organik Nanotaşıyıcılar
Kanser tedavisinde kullanılan toksik kimyasal ilaçların sadece kanserli hücreler de değil, normal hücrelerde de aynı şekilde toksik etki göstermektedir. Bu nedenle kemoterapi uygulamalarında bu yan etkileri minimum düzeye indirmek veya tamamen kaldırmak için zaman geçtikçe bazı çözümler elde edilmiştir. Bu çözümlerden birisi ilaçların direk kan ve normal hücreler ile temas etmeden, sadece tedavisi amaçlanan hücrelere yöneltilmesinin sağlanmasıdır [33]. Kan dolaşımında olan ve 100nm’den daha küçük olan bu nanotaşıyıcılar kolaylıkla damarlardan dışarı çıkıp, içinde taşıyan toksik ilaçları doğrudan istenilen tümör hücrelerine sevk edebilme özelliğine sahiptiler [34]. Taşınması amaçlanan ilacın (veya her hangi bir kimyasal) özelliklerine bağlı olarak, farklı malzemelerden hazırlanmış çeşitli
6
nanotaşıyıcılar kullanılabilmektedir. Literatürde polimerik nanopartikül, lipozom, misel, dendrimer, altın, demir oksit, karbon-tabanlı malzemeler ve silikon gibi çeşitli malzemeler kullanarak nanotaşıyıcıların sentezi gerçekleştirilmiştir [35].
2.3.1. Nanokapsüller (Miseller, Lipozomlar)
Polimerik nanopartiküller kategorisinde olan nanokapsüller, bir ya da birden fazla aktif malzeme (çekirdek) ve koruyucu matriks’ten (kabuk veya membran) oluşan bir nano-kabarcık yapıdır [36, 37]. İç kısmında bir boşluk olan bu nanomalzemeler boyut ve kullanılan polimerlerin özelliklerine bağlı olarak, sınırlı bir şekilde ilaç ve boya moleküllerini taşıma kapasitesine sahiplerdir [33, 38]. Farklı uygulamalar için çeşitli polimerler ile farklı yapıda elde edilebilmektedirler. Biyolojik sistemlere uygun bir şekilde kullanımlarını sağlamak için, poli(laktik asit) (PLA), poli(laktik asit-co-glikolik) (PLGA) ve poli-e-kaprolakton (PCL) gibi biyobozunur ve toksik olmayan malzemeler kullanırken, diğer uygulamalar için tiyol bağlanmış poli metakrilik asit ve poli(N-vinil Pirrolidon) kullanılmaktadır [39]. Taşınması amaçlanan ilaç veya boyanın moleküller özelliklerine bağlı olarak farklı yapılarda nanokapsüller hazırlanmaktadır. Hidrofob ilaçlar için genel olarak tek tabakalı membran şeklinde olan amfifilik polimerler kullanılırken (misel), hidrofil özelliği gösteren ilaçlar için çıft tabakalı zarla oluşan fosfolipit yapısına sahip polimerler tercih edilmektedir (lipozom) [33]. Lipozom ve miselin yapısal farkları Şekil 2.1’de verilmiştir.
Şekil 2.1. A) Lipozom ve B) misel yapısının şematik gösterimi [33].
2.3.1.1. Lipozomların Sınıflandırılması
Lipozomların sınıflandırılması kabarcık büyüklüğü, membran tabaka sayısı ve hazırlanma metoduna göre yapılmaktadır.
7
ULV (unilamellar vesicles): tekli çift-katman membrandan oluşan lipozomlar.
o SUV (small unilamellar vesicles): 100nm’den küçük olan tekli çift-katman membrandan oluşan lipozomlar.
o LUV (larg unilamellar vesicles): 100nm’den büyük olan tekli çift-katman membrandan oluşan lipozomlar.
MLV (multilamellar vesicle): konsantre şeklinde olan birkaç çift-katman membrandan oluşan lipozomlar.
MVV (multivesicular vesicle): konsantre olmayan çoklu çift-katman membrandan oluşan lipozomlar [40].
Başka bir sınıflandırmada ise bu lipozomların gösterdiği taşıma fonksiyonel özelliği üzerinden yapılmaktadır.
İmmünolipozomlar: biyoaktif molekülleri aktif hedefleme şeklinde vücut içinde taşınması için tasarlanmış lipid parçacıklardır.
Virozomlar: yapay virüsler şeklinde hazırlanan ve rekombine protein’leri aktif hedeflenmiş şekilde vücut içinde taşıyan lipozomlardır [41].
Gizli lipozomlar: kan dolaşımında ak yuvarlar tarafından fagositoz’e uğramaları için PEG ile kaplanmış ve aktif hedeflenmiş olan lipozomlardır [42, 43].
Transferozomlar: cilt yolundan biyoaktif molekülleri vücut’a taşıyabilen lipozomlardır.
Bu tür lipozomlar fosfolipit, kolesterol ve sodyum kolat gibi yüzey koruyucudan oluşmaktadırlar. Sıkışıp uzayarak kendi çaplarının onda birine sahip olan gözeneklerden geçme yeteneğine sahip lipozomlardır [44].
Arkaeozomlar: bir veya daha fazla Arkea (Arkeabakteri) membran özünün karışımından oluşan lipozomlardır [45]. Arkea’ larda görünen olağanüstü dayanıklılık özelliklerine sahiplerdir. Örneğin; sıcak, oksidasyon, kimyasal ve enzimatik hidrolizlere direnç gösteren lipozomlardır [46].
Veziküler fospholipit jel’ler (VPGs): Yüksek yoğunluğa sahip yarı-katı kıvamda olan lipozomlardır. Yüksek basınçlı homojenleştirme metodu ile yüksek yoğunlukta olan bu parçacıklar elde edilmektedir. Parenteral depo formülasyon ve gen koruması için kullanılır. Uzun zaman dayana sahip olması nedeniyle, uzun zaman saklanabilen lipozomlardır [47].
Kokleatlar: fosfatidilserin gibi negatif yüklü lipitler ve kalsiyum gibi di-valent (iki değerli) katyon’lardan oluşan küçük boya sahip olan lipid-tabanlı taşıyıcılardır. Puro şekilli çok katmanlı bir yapıya sahip liposomlardır. Hidrofobik, hidrofilik, negatif veya
8
pozitif yüklü moleküller kokeleatlar tarafından kolayca taşınabilir, dolayısıyla ağız yolundan verilen ilaçlar için en uygun adaylı lipozom olarak kullanılmaktadır [48].
Nanolipozomlar: nano çapında olan lipozomlardır. Biyolojik sistemlerde kullanılabilmek için mikrolipozomlara göre birçok avantaja sahiptir. Küçük boyu bu lipozomların kan dolaşımında makrofajlar tarafından tanınmalarını engeller, kapiler damarlardan dokulara nüfuz eder ve hücre içine kolayca girebilmektedir. Hedeflenen bölgede yüksek tedavi kapasitesine sahiptir. Daha kontrollü ve stabil bir biçimde hedeflenen bölgede ilaç salımı yapabilmektedir [49].
2.3.1.2. İnkapsülasyon Teknikleri
Lipozom hazırlanması için literatürde bir çok teknik verilmesine karşın, bütün yöntemler aşağıdaki dört ana basamaktan ibarettir [50].
1. Organik fazında bulunan lipitlerin kurutulması.
2. Lipitlerin sulu fazda dağıtılması.
3. Elde edilen lipitlerin saflaştırılması.
4. Hazırlanan lipozomların karakterizasyonu.
Pasif ve aktif yükleme teknikleri olarak, lipozomların sentezi iki ana gruptan oluşmaktadır. Pasif yükleme tekniği ise üç farklı yönteme sahiptir.
a. Mekaniksel dağıtma yöntemi.
b. Çözücü içinde dağılımı.
c. Deterjan uzaklaştırma yöntemi [51, 52].
Literatürde mekaniksel dağıtım yöntemleri kapsamında yedi farklı yöntem bulunmaktadır.
1. Sonikasyon.
2. Fransız basınçlı hücre: ekstrüzyon.
3. Buzlanmış-çözülmüş lipozomlar.
4. Elle sallayarak lipit filmlerin hidrasyonu.
5. Mikro-emülsifikasyon.
6. Membran ekstrüzyon.
7. Yeniden kurutulmuş vesiküller [51, 52].
9
Mekaniksel dağıtma yöntemlerinden olan sonikasyon tekniği, yaygın olarak SUV (100nm’den küçük olan) lipozomların hazırlanmasında ve homojen şekilde dağıtılmasında kullanılmaktadır. Ön hazırlamaya göre iki farklı şekilde uygulanmaktadır. Birinci yöntem sırasında ilk önce organik bir çözücünün varlığında MLV (membran formunda olan) lipozomlar içinde dağıtılmış olan ve taşınması hedeflenen ilaç veya herhangi bir kimyasal ajan hazırlanması gerçekleştirilir. Daha sonra organik fazı uzaklaştırılıp, üzerine su ilave edilmektedir. Bu çözelti sonikasyona maruz kalınca MLV parçalanır, LUV lipozomlar ortaya çıkması sağlanır.
Sonikasyon devam edince bu parçacıklar daha küçük olan SUV lipozomlara dönüşür.
Elde edilen çözeltide bulunan LUV-SUV karışımı santrifüj sırasında saflaştırılır, filtre edilerek LUV’lerin ortamdan uzaklaştırılması sağlanmaktadır (Şekil 2.2). Bir başka yöntem ise organik solvent içinde çözülen lipitlere ilaç, boya veya taşınması amaçlanan ajanları ilave edilir. Elde edilen çözelti sulu bir ortama eklenip, ortamda olan lipit’ler lipozom’a dönüşür. Sonikasyon uygulanması ile ortaya çıkan LUV’ler daha küçük olan SUV’lere dönüşerek homojen çapta lipozomlar elde edilmektedir.
Sonikasyon uygulaması için iki farklı yöntem kullanılmaktadır.
a. prob sonikasyon: bu tür sonikatör’lerde olan uç, lipit ve ajan bulunduran çözelti içine girerek, yüksek güçte enerji aktarılmasını gerçekleştirir. Bu yöntem sırasında elde edilen lipozom’ların yaklaşık %5’inde esterleşme ortaya çıkmaktadır.
b. banyo sonikasyonu: bu yöntem sırasında elde edilen lipozom’ların dağılımı yapılsa da, daha düşük bir güç kullanımı nedeniyle daha düşük bir verimle karşılaşılmaktadır.
Bu yöntemin en önemli avantajı, daha düşük güç kullanımı nedeniyle sıcaklık kontrollü bir şekilde oluşmaktadır [53].
10
Şekil 2.2. Lipozom oluşmasının şematik gösterimi [54].
2.3.1.3. Lipozom Sentezinde Kullanılan Lipitler
Lipozom hazırlanması için bir çok grup tarafından çeşitli lipitler kullanılmaktadır.
Lipozomal yapının elde edilmesi için kullanılmış olan lipitlerin amfifilik gibi bazı kritik özelliklere sahip olmaları gerekmektedir. Lipozom yapısını oluşturabilen bu bileşikler genel olarak hidrofobik özelliği gösteren iki yağ asidi ve fonksiyonel grubunu taşıyan hidrofil bir diğer zincirden oluşmaktadır. Toplam uç yan zincir olarak gliserol molekülün omurga yapısına bağlanma sonucunda elde edilmektedir. Fosfolipid yapısında olduğu gibi fosfat veya negatif yüklü alkol fonksiyonel yan gruptan oluşan bu moleküller sulu ortamlarda lipozom oluşturma özelliğine sahiplerdir. Bu moleküllerin en önemli özelliklerinden biri, amaca göre fonksiyonelleştirilebilmeleridir.
Literatürde yaygın olarak lipozom yapılarını elde etmek için kullanılması rapor edilen lipitlerin genel bir listesi Çizelge 2.1’de verilmiştir [55, 56].
11
Çizelge 2.1. Lipozom yapısını elde etmek için kullanılan lipidler.
Lipid Açık adı
DLPC Dilinolloilfosfatidilkolin
DMPC 1,2-dimiristoil-sn-glisero-3-fosfokolin
DPPC 1,2-dipalmitoil-sn-glisero-3-fosfokolin
DSPC 1,2-distearoil-sn-glisero-3-fosfokolin
DOPC 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin
DMPE 1,2-dimiristoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin
DPPE 1,2-dipalmitoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin
DOPE 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin
DMPA•Na 1,2-ditetradecanoyl-sn-glisero-3-fosfat
DPPA•Na 1,2-dipalmitoil-sn-glisero-3-fosfat
DOPA•Na 1,2-di- (9Z-octadecenoyl-) -sn-glisero-3-fosfat DMPG•Na 1,2-dimiristoil-sn-glisero-3-fosfo (1'-rac-gliserol)
DPPG•Na 1,2-dipalmitoil-sn-glisero-3-fosfo (1'-rac-gliserol) DMPS•Na 1,2-dimiristoil-sn-glisero-3-fosfo-L-serin (sodyum tuzu) DPPS•Na 1,2-dipalmitoil-sn-glisero-3-fosfo-L-serin (sodyum tuzu) DOPS•Na 1,2-Dioleoil-sn-glisero 3-fosfoserin (sodyum tuzu) DOPE Glutaryl•(Na)2 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N- (glutaril)
DSPE-mPEG- 2000•Na
1,2-Distearoil-fosfatidiletanolamin-metil-polietilenglikol konjügatı-2000
DSPE-mPEG- 5000•Na
1,2-Distearoil-fosfatidiletanolamin-metil-polietilenglikol konjügatı-5000
DSPE-Maleimide PEG-2000•Na
1,2-distearoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N- [maleimid (polietilen glikol) -2000]
DOTAP•Cl 1,2-Dioleoiloksi-3-trimetilamonyum propan klorür
12
2.3.1.3.1. [1,2-Distearoyl-sn-glycerol-3-phosphatidylethanolamine–
Poly(ethyleneglycol)] (DSPE-PEG) blok kopolimerler
DSPE-PEG ilaç paketleme’de geniş bir kullanıma sahip olan polimer’e bağlanmış olan fosfolipit’ten oluşan bir bileşiktir. FDA onaylı olan bu malzemenin yapısını oluşturan fosfoetanolamin, bakterilerin hücre zarı ve diğer canlıların merkez sinir sisteminin önemli bir parçası olarak bilinmektedir. Biyouyumluluk, biyobozunurluk ve amfifilik özelliğe sahip olan bu malzeme diğer biyomoleküllerle foksiyonelleştirip biyolojik sistemlerde spesifik şekilde kullanılabilmektedir. Birçok araştırma grubu tarafından ilaç paketleme ve hedefleme aracı olarak kullanılması nedeniyle, bu maddenin inkapsülasyon verimini ve diğer taraftan kan dolaşımında dayanıklığını artırabilmek için üzerinde birçok yapısal değişiklikler yapılmıştır/yapılmaktadır [57].
Bu malzemenin PEG molekülü amaca göre 2000 veya 5000 molekül ağırlığına sahipken, malimid, amin, karboksilik asit, biyotin, folat, siyanür, süksinil ve azid gibi fonksiyonel gruplar tarafından farklı amaçlarda kullanmak üzere fonksiyonelleştirilmiştir [58-64]. Şekil 2.3’te malimid fonksiyonel grubuna sahip DSPE-PEG(M.W=2000,5000) molekülünün kimyasal yapısı verilmiştir.
Şekil 2.3. Malimid fonksiyonellenmiş DSPE-PEG molekülün kimyasal yapısı [65].
2.3.2. Nanokapsüllerin Spesifik Olarak Hedeflendirilmesi 2.3.2.1. Biyolojik Hedeflendirme Ajanı (Ligand)
Son zamanlarda kanser gibi ölümcül hastalıkların tedavisinde tasarlanmış olan ilaçlar aktif şekilde kullanılır hale gelmiştir. Buna rağmen hazırlanmış olan bu ilaçlar sadece kanserli hücrelerle kalmayıp, sağlıklı dokulara da aynı şekilde toksik etki göstermektedir. Diğer taraftan bu ilaçların sentezinde kullanılan maddeler ve teknikler pahalı olduğu için bu tarz tedaviler yüksek maliyetli olmaktadır. Bu durumlar neticesinde maliyetin düşürülmesi ve yan etkilerin minimum düzeye indirilmesi için çözüm bulunması kritik bir hale gelmiştir. Dolayısı ise hazırlanmış ilaçların spesifik bir şekilde sadece tedavisi amaçlanan doku ve hücrelere yönlendirilmesi gerekmektedir.
13
Çözüm ise moleküler seviyeye inmek, hücrelerin biyolojisinden ilham alarak sadece istenilen bu hücrelere affinite gösteren ve ligand adı verilen moleküllerin tasarımıdır.
Ligand’lar biyolojik kaynaklardan veya sentetik olarak hazırlanabilmektedir. Biyolojik ve doğal yollardan elde edilen ligandların eldesi için kullanılan yöntemler aşağıda sıralanmıştır.
Monoklonal antibodi teknolojisi [66, 67].
Faj gösterimi [68, 69].
SELEX teknolojisi (spesifik aptamer seçim ve üretimi) [70, 71].
Biyoteknolojik yöntemler (Plasmid klonlama-ekspresyon yöntemi) [72, 73].
2.3.2.2. Antibiyotik Temelli Ligandlar
Bakteriler üzerinde farklı mekanizmalar vasıtasıyla ölümcül, veya durdurucu etki gösteren antibakteriyal bileşimler olarak bilinmektedirler [74, 75]. Doğal olarak belli bir bakteri veya mantar türleri tarafından üretilebilen bu maddeler laboratuvar koşullarında istenilen uygulamaya uygun şekilde tasarlanıp, sentezlenebilmektedir [76]. Etki mekanizmasına bağlı olarak bu bakterilerin DNA, RNA, DNA polimeraz, RNA polimeraz, ribozom, hücre zarı, peptidoglikan ve lipopolisakarit gibi farklı bölgelerinde mevcut reseptörlere bağlanabilmektedirler [77-82]. Antibiyotiklerin bu özelliklerinden yararlanarak aktif hedeflendirilmiş nanotaşıyıcılarda ligand görevi alabilmektedirler. Bu moleküllerin ligand şeklinde kullanılabilmeleri için bazı kritik özelliğe sahip olmaları gerekmektedir. Örneğin bu maddelerin kovalent olarak nanotaşıyıcılara bağlayabilmesi için bu moleküllerin aktif olmayan yapısal bölgelerinde amin veya karboksilik fonksiyonel gruplara sahip olmaları gerekmektedir [83]. Çizelge 2.2’de E. coli üzerinde kullanılmış ẞ-laktam antibiyotiklerinin bir listesi verilmiştir.
14
Çizelge 2.2. E. coli’ye karşı hedeflenme ajanı olarak kullanılan ẞ-laktam antibiyotik ligand’lar [83].
Antibiyotik Kimyasal yapı Hedeflenme fonksiyonu
Sefaloridin Hücre büyümesi
6-aminopenisilanik asit
Hücre büyümesi ve bölünmesi
Mesiliyanin Hücre büyümesi ve
bölünmesi
Benzilpenisilin Hücre bölünmesi
Sefaleksin Hücre bölünmesi
Piperasilin Hücre bölünmesi
Ampisilin Hücre bölünmesi
15
2.3.2.2.1. Vankomisin
Gram pozitif bakteriler tarafından meydana gelen enfeksiyonlara karşı glikopeptid ailesinde yer alan antibakteriyal bir etkin maddedir. Cilt ve kan dolaşımı enfeksiyonları, endokardit ve Staphilococcus aureous kaynaklı olan menanjit için tercih edilen bir ilaçtır [84]. Vankomisin, metasilin dirençli Staphilococcus aureous (MRSA) bakteriye karşı etkili kalan ender antibiyotiklerden biridir [85]. Biyo-kaynaklı olan bu antibakteriyal madde Amycolatopsis orientalis mikroorganizması tarafından kendisini diğer bakterilerden korumak amaçlı sentezlenmektedir [86]. Birçok grup tarafından farklı amaçlar (ticari veya araştırma) için laboratuvar koşullarında genetik mühendisliği ve biyoteknoloji bilimlerini kullanarak optimize bir şekilde üretilebilmektedir [87-96]. C66H75Cl2N9O24 kimyasal formülüne sahip bu bileşim, 1449.265 g/mol molekül ağırlığına sahip olarak serbest –COOH fonksiyonel grubuna sahiptir. Karboksilik grubunun varlığı bu molekülün daha kolay ve güvenilir bir şekilde immobilizasyon’una yol açarak, mükemmel bir hedeflenme ajanı olmaktadır.
Vankomisin’in kimyasal yapısı Şekil 2.4’te verilmiştir.
Şekil 2.4. Vankomisin’nin kimyasal yapısı [97].
Geniş spektrum etkisine sahip olan bu antibiyotik, gram pozitif bakterilerin hücre duvarında bulunan peptidoglikan yapısının sentezlenmesini engelliyerek, bakteriyal inhibisyonunu gerçekleştirir [98]. Bu antibakteriyal maddenin reseptörü peptidoglikan tabakalarının ana zincir kısmında olan N-asetilglikozamin’e bağlanmış penta-peptid (beş aminoasit’ten oluşan bir peptit) üzerindedir. Vankomisin penta-peptid’in üzerinde
16
olan açil-D-alanin-D-alanin kalıntısına elektrostatik olan hidrojen bağı ile bağlanmaktadır [99]. Bu antibiyotiğe direnç gösteren bakterilerin peptidoglikan yapılarında olan açil-D-alanin-D-alanin bölgede vankomisin reseptörü bulunmamaktadır. Bakterilerin üreme fazında peotidoglikan sentezi sırasında vankomisinin penta-peptit bölgesine bağlanarak, penta-glisin (beş-glisin) köprüsünü sentezleyen enzimin bu bölgeye oturmasını engeller. Böylece peptidoglikan sentezi tamamlanmaz ve bakteri inhibisyonu gerçekleştirilir [100]. Vankomisinin etki mekanizması şematik olarak Şekil 2.5’te ve peptidoglikan ile moleküler etkileşimi ise Şekil 2.6’da gösterilmiştir.
Şekil 2.5. Vankomisin etki mekanizmasının şematik gösterilişi [99].
Şekil 2.6. Vankomisin ile peptidoglikan bölgesindeki açil-D-alanin-D-alanin kalıntısı arasında etkileşim [101].
17
Literatürde olan birçok çalışmada hedeflendirme ajanı olarak vankomisin kullanılmıştır. 2007 yılında Pereira ve arkadaşları tarafından vankomisin’e dirençli olan S. aureus (VRSA) hücre duvarının sentezini araştırabilmek amacıyla BODIPY FL floresan boyaya takılmış vankomisin kullanılmıştır [102]. Xing ve arkadaşları ise 2011 yılında vankomisin-profirin konjugatını elde ederek, floresan ışımaya sahip gram pozitif bakterilere karşı aktif hedeflendirilmiş bir bileşim elde etmişlerdir [103].
Sheikh ve arkadaşları 2012 yılında hazırladıkları vankomisin-rodamin konjugatını başarılı bir şekilde hedeflendirip, konfokal mikroskopu ile görüntü elde etmişlerdir [104]. Oosten ve arkadaşları tarafından 2013 yılında yapılan araştırmalar sonucunda, vankomisin-800CW kombinasyonu ile gram pozotif bakterilerin gerçek zaman in-vivo görüntülenmesi başarıyla gerçekleştirlmiştir [105].
2.4. Floresan Problar
Floresan boyalar belli bir dalga boyunda uyarlanan ve daha sonra farklı bir dalga boyundan ışık yayan moleküller olarak geniş bir şekilde floresan işaretleme teknolojisinde uygulanmaktadırlar [106]. Bu bileşikler altın ve gümüş gibi nano ve mikro taşıyıcılara kovalent / elektrostatik bağlanarak veya organik nanotaşıyıcılar tarafından paketlenerek tanı etiketleri şekilinde kullanılıp, gösterdiği sinyal şiddetlerine bağlı olarak nitel ya da nicel analizler için kullanılabilmektedirler [107- 109]. Floresan işaretli moleküller veya literatürde daha çok bilinen ‘‘floresan problar’’, biyolojik sistemlerde amino asitler, DNA, RNA ve hücre üzerinde olan bir çok reseptör ve proteinlerin tanımlama-görüntülenmesinde ve olası hastalıkların erken teşhisi için kullanılmaktadırlar [110-114]. Yüksek hızda tanı, düşük miktarlarda kullanım, radyasyon olmayan ve düşük toksisite gösteren özellikler bu probların en büyük avantalı olarak bilinmektedir. Bu da floresan probların biyolojik sistemlerde kullanılabilmesi için onları güvenilir bir aday haline getirmiştir [115].
Floresan problar genel olarak genetik kodlanmış ve genetik olmayan iki ana grupa sınıflandırılmaktadırlar. Genetik kodlanmış olan floresan problar ökaryot veya prokaryot hücrelerde DNA’dan transkripte edilmiş mRNA üzerinden ribozomlar tarafından sentezlenmektedir. Biyoteknolojik teknikler ile bu moleküllerin yüklü miktarlarda elde edilmesi bir çok araştırma grubu tarafından yapılmaktadır [116, 117].
Yeşil, sarı ve kırmızı floresan protein (GFP, YFP ve RFP) veya genel olarak floresan proteinler (FP) canlı sistemler tarafından sentezlenen floresan moleküllere en iyi örneklerdir [117, 118]. Genetik olmayan floresan molekülleri ise kimyasal yolları ile
18
lab koşullarında sentezlenmektedirler. Günümüzde bir çok araştırmada kullanılmış olan genetik olmayan floresan probların bir listesi Çizelge 2.3’te verilmiştir.
Çizelge 2.3. Biyolojik sistemlerde yaygın şekilde kullanılan floresan probların listesi ve onlara ait uygulamalar.
Floresan prob Uygulama
Rodamin 123 Canlı hücrelerde mitokondori’nın zar potansiyelin incelenmesi [119].
Rodamin 6G Canlı hücrelerde flörür iyonların izlemesi [120].
FITC Canlı hücre görüntülenmesi [121].
Siyanin ailesi (Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 ve
Cy7)
Nukleik asit işaretlemesi, Mikroarray ve canlı hücre görüntülenmesi [122].
Auramin O Acit-fast bakterilerin görüntülenmesi [123, 124].
Antrasen İnterasellüler organellerin spesifik görüntülenmesi [125].
Piren Canlı hücre görüntülenmesi [126].
Konjuge polimerler
ailesi Canlı hücre görüntülenmesi [127].
2.4.1. Konjuge Polimerler (CP)
Floresan özelliğine sahip olan konjuge polimer (CP) adı verilen malzemeler günümüzde biyolojik görüntülenmede ilgi odağı olmuştur [128-132]. CP’ler sahip olduğu doymamış delokalize π-konjuge elektron ana zinciri sayesinde mükemmel iletkenlik, fotolüminesan ve ışık absorpsiyon özelliğine sahip makromoleküllerdir. Bu olağanüstü özellikleri sayesinde ışık yayan diyotlar, alan etkili transistörler, fotovoltaik aygıtlar ve gösterdiği düşük sitotoksisite özelliğinden dolayı biyolojik detektörlerde geniş bir uygulamaya sahiptirler [133, 134]. CP’lerin sentez sırasında bu moleküllerin ana zincirini oluşturan monomerleri amaca uygun şekilde ayarlanarak, gösterdiği iletkenlik ve optiksel özellikleri arasında yer değişikliği ortaya çıkabilmektedir [135- 137]. İletkenlik özelliklerini artırmak için poliasetilen (PA), polianilin (PAN) ve polipirrol
19
(PPy) kullanılırken, elektro-fotolüminesans özellikleri için polifluoren (PF), polifenilen (PPE), poli(fenilen vinilen) (PPV) ve politiyofen gibi polimerler kullanılmaktadır [138, 139]. CP moleküllerin ana zincir yapısı Şekil 2.7’de gösterilmektedir.
Şekil 2.7. Yaygın olarak kullanılan bazı konjüge polimerlerin kimyasal yapılarının adapte edilmiş şekli [140].
CP’lerin elektron transfer prosesi kuantum fiziğinde olan Jablonski klasik diyagram’ı ile açıklanabilmektedir. CP moleküllerin enerji seviyesi temel düzey (S0), uyarılmış tekil düzey (S1, Sn) ve uyarılmış üçlü düzey’e (T1) bölünmektedir. Bu moleküller tarafından enerji emme sırasında temel düzeyde bulunan elektronlar üst enerji düzeylerine uyarılmaktadır. Uyarılmış olan elektronlar temel enerji düzeyine geri dönünce, enerji farkını radyal veya radyal olmayan yollarla serbest bırakırlar. Radyal olmayan enerji serbest bırakma yolu ısı şeklindeyken, radyal formunda serbestleşen enerji floresan veya fosforesan (fosfor gibi ışıllama) yaymasıyla gerçekleştirilir. CP moleküllerinde S1 enerji seviyesinden S0’a düşme sırasında floresan, T1’den S0’a gelmesi sonucunda ise fosforesan ışınlama ortaya çıkmaktadır (Şekil 2.8) [141].
20
Şekil 2.8. Jablonski diyagramın şematik bir çizimi. IC iç dönüşüm, ISC sistemler arası çapraz dönüşüm, S0 enerji temel düzeyi, S1 ve Sn uyarılmış tekil düzeyleri ve T1
uyarılmış üçlü düzey anlamına gelmektedir [141].
CP’lerin foto-fiziksel özellikleri onların kimyasal yapısı, ana zincir yapısı, konjugasyon uzunluğu, yan zincir düzeneği ve konformasyonu gibi bir çok parametreden etkilenmektedir [131, 132, 142, 143]. Örneğin ana zincir yapısında zincirler arası etkileşimlerin artmasıyla birlikte, elektronların uyarılması daha düşük enerji seviyelerinde gerçekleştirilir. Bu enerjinin serbest bırakılmasıyla birlikte bariz kırmızı dalgaboyunda ışık yayılması gerçekleştirilir [132].
2.4.1.1. Poli(9,9-dioktilfloren- 2,7-diil-ko-benzotiadiazol)
Suda çözülebilen katyonik konjuge polimerlerden olan PFBT veya ticari adıyla bilinen F8BT, 460-470 nm dalgaboyunda uyarlanma ve 545-578 nm’de yayma özelliği göstermektedir [144]. PFBT molekülün floresan özelliği bu molekülün yapısında olan benzen halkalarından kaynaklanmaktadır. 4 ± 1% kuantom verimi (QY) gösteren bu madde, floresan probu olarak mikroarray ve biyolojik görüntülenmede geniş bir uygulamaya sahiptir [145, 146]. PFBT molekülün kimyasal yapısı, uyarılma ve yayma özellikleri Şekil 2.9’da verilmiştir.
21
Şekil 2.9. PFBT konjuge polimerin moleküler yapısı ve ışık uyarılma, yayma özellikleri [146].
2.5. Biyolojik Görüntülenme
Günümüzde sağlık problemlerinin etkin bir şekilde teşhis ve tedavisinde kullanılan bu yöntem birçok araştırma grubunun odak noktası olmuştur [147, 148]. Görüntülenme yöntemleri sayesinde temel biyolojik süreçleri makroskopik ölçüden mikroskopik seviyeye düşmüş, alt-hücresel düzeyde çalışmalarına yol açmıştır. Son zamanlarda Manyetik rezonans görüntülenme (MRI), pozitron emisyon tomografi (PET) , ultrason, fotoakustik ve floresan görüntülenme tekniklerinin geliştirmesiyle birlikte daha güvenilir bir şekilde biyolojik sorunların teşhisi ve görüntülenmesi gerçekleştirilmiştir [149-154]. Bu tekniklerin arasında, floresan görüntülenmenin gösterdiği non-invazif, yüksek zamansal-uzaysal çözünürlük ve gerçek zamanlı gibi özellikler sayesinde temel bir strateji haline getirilmiştir [155]. Biolojik sistem görüntülenmesinin en önemli uygulamalarından biri ise onkoloji alanıdır [156, 157]. Genomik, proteomik ve metabolik üzerinde güvenilir teşhis sağlayabileceği bu yöntem sayesinde, moleküler seviyede kanserli hücre-doku görüntülenmesi güvenilir ve son derece dikkat çeken bir yöntem haline gelmiştir [158]. Yeni analiz teknikleri ve nicel görüntülenme yazılım araçlarının gelişmesi sayesinde metabolik sinyal yolları temel alınarak kanserli hücrelerden daha net ve detaylı görüntüler alınması mümkün olmuştur [159].
Kanserli hücrelerde devamlı gerçekleşen mutasyon olaylarından kaynaklanan metabolik sinyal yollarında ortaya çıkan değişikliklerin güvenilir bir şekilde takip edilmesinin son derece önemli olduğu belirlenmiştir. Dolayısıyla uygun bir prob tasarımı ile hedeflenme, teşhis ve tedavi daha da güvenilir bir seviyeye yükselmiş
22
olmaktadır [160-162]. Biyolojik sistemlerin görüntülenmesi için 1873 yılından beri görüntülerin çözünürlüklerini iyileştirmek için birçok sistemin geliştirilmesi öngörülmektedir. Daha iyi çözünürlük elde edilmesi için bir kaç görüntülenme cihazının birleştirilmesi zaman içinde gerçekleştirilmiştir. Buna örnek olarak ışık mikroskopuna floresan mikroskobun kurulmasıdır. Şekil 2.10’da biyolojik sistemlerin görüntülenmesinde ortaya çıkan yeni tekniklerin kısa bir tarihçesi şeklinde verilmiştir.
Şekil 2.10. Biyolojik sistem görüntülenme tekniklerinde ortaya çıkan gelişmelerin tarihçesi [118].
23
2.5.1. Floresan Görüntülenme
Biyolojik sistemlerin görüntülenmesi için elektron mikroskopu gibi yüksek çözünürlüğe sahip mikroskoplar kullanılsa dahi, hücre ve dokulardan en güvenilir görüntülenmeler onların canlı hallerinden alınmaktadır. Pozitron emisyon tomografi, manyetik rezonans görüntülenme (MRI) ve optik koherens tomografi teknikleri ile canlı hücre ve dokudan görüntü alınabilmesine rağmen, bu tekniklerle en fazla 100- 1000 µm’lik bir çözünürlükte görüntüler elde edilmektedir. Bu da hücre yapısının canlı durumda moleküler ve metabolik yolların araştırılmasında sınırlamalara neden olmaktadır. Biyolojik sistemlerin araştırılmasının önemsenmesi gereken olaylardan biri ise geçici sinyallerin tesbitidir. Örneğin sinapslar arasında gerçekleşen sinyal alışverişi milisaniye’de gerçekleşmektedir. Bu olayın tesbit edilmesinin tek yolu ise doku’dan (ve/veya sinir hücreleri) canlı iken görüntü alınmasıdır [118].
2.5.2. Floresan Mikroskopu
Floresan mikroskobu, floresan ışıma prensibine dayanarak canlı/cansız sistemlerden görüntü almayı sağlamaktadır. Dolayısıyla günümüzde daha iyi ve gelişmiş teknikler sayesinde çeşitli hassasiyete sahip ve floresan temelli mikroskopların geliştirilmesi gerçekleştirilmiştir. Çizelge 2.4’de floresan mikroskop çeşitleri ve kullanım alanları verilmiştir.
