Doku Kültürlerinde Kullanılan Besin Ortamları ve Kültür Şartları

(1)

Doku Kültürlerinde Kullanılan Besin Ortamları ve Kültür

Şartları

Sebahattin ÖZCAN

(2)

Bitki BiyoteknolojisininTarihçesi

• 1902 ilk izole edilmiş hücrelerin kültürü (Haberlandt)

• 1904 Olgun embriyoların kültürü (Hanning)

• 1917 Biyoteknoloji teriminin ilk defa kullanımı (Karl Ereky)

• 1920 Oksinin tanımlanması (Went ve ark.)

• 1922 Kök ve sürgün uçlarının laboratuvarda çoğaltımı (Kotte ve Robbins)

• 1924 İlk embriyo kurtarma tekniği (mısır) (Dieterich)

• 1934 İlk sürekli kök kültürleri (domates) (White)

• 1934 İlk kallus kültürleri (Gautheret)

• 1942 İlk kallus kültürlerinden sekonder metabolit eldesi (Gautheret)

• 1946 Sürgün uçlarından (apikal meristem) ilk bitki eldesi (Ball)

• 1953 DNA'nın yapısının belirlenmesi (Watson ve Crick)

• 1954 Hücre süspansiyonlarından ilk bitki eldesi (Muir ve ark.)

• 1957 İlk sitokininin tanımlanması ve organ oluşumunda

sitokinin/oksin oranının öneminin ortaya konulması (Skoog ve Miller)

(3)

Bitki BiyoteknolojisininTarihçesi

• 1958 İlk somatik embriyogenesis (havuç) (Steward ve ark.)

• 1960Enzimler kullanılarak ilk canlı protoplast izolasyonu (Cocking)

• 1962 MS besin ortamının geliştirilmesi (Murashige ve Skoog)

• 1965 Tek hücreden bitki rejenerasyonu (Vasil ve Hilderbrandt)

• 1967İlk haploid bitkinin üretimi (anter polen kültürü) (Bourgin ve Nitsch)

• 1968 B5 ortamının geliştirilmesi (Gamborg ve ark.)

• 1970 HEPA filtrelerin kullanılmaya başlanması

• 1971 Protoplastlardan ilk bitki rejenerasyonu (Nagata ve Takabe)

• 1978 Cinsler arası ilk somatik melezleme (Melchers ve ark.)

• 1983 Transgenik ilk bitkinin elde edilmesi (tütün) (Murai ve ark.)

• 1986 Transgenik ilk bitkinin tarla testleri (tütün)

• 1990 Sentetik tohum geliştirme ve hızlı dondurma yoluyla germplazm muhafazası çalışmalarının başlaması

• 1995 İlk rekombinant insan gıdası (Flavr Savr, domates)

(4)

BİTKİ BİYOTEKNOLOJİ

1. Bitki Doku ve Hücre Kültürleri

2. Bitki genetik Mühendisliği

(5)

Bitki doku ve hücre kültürlerinin bitki ıslahındaki uygulama alanları

• Türler arası melezlemelerden sonra embriyo kültürü

• Haploid bitki üretiminde anter (polen) ve yumurtalık (ovül) kültürü

• Somaklonal varyasyon

• İn vitro seleksiyon

• İn vitro döllenme

• İn vitro germplazm muhafazası

• Somatik hücre melezlemesi (protoplast füzyonu)

• Gen transferi

(6)

Bitki doku kültürünün ticari uygulamaları

• Hastalıksız bitki elde edilmesinde meristem kültürü

• Mikroçoğaltım

• Sentetik tohum üretimi

• Sekonder metabolit üretimi (kallus-

hücre süspansiyonları)

(7)

Bitki Doku ve Hücre Kültürlerinin Tanımı

• Tanımı: Yapay besin ortamında, Steril şartlarda (in vitro), yaprak gövde, anter, kök, çiçek, yan ve tepe meristemleri gibi bitki organları ile tek bitki hücre ve

protoplastlarından yeni bitkilerin elde

edilmesidir.

(8)

Yapay Besin Ortamı

• Bitki doku ve organları büyüme için gerekli olan besin maddelerini içeren yapay besin ortamında gelişirler.

• Doku kültürlerinin başarısını yapay besin ortamı önemli ölçüde etkilemektedir.

• Dış şartlarda olduğu gibi sağlıklı in vitro bitki büyümesi için de;

• nispeten yüksek miktarlarda (major elementler olarak

isimlendirilen) azot (N), potasyum (K), kalsiyum (Ca), fosfor (P), mağnezyum (Mg) ve sülfür (S)

• Düşük miktarlarda diğer elementler olan (minör bitki

elementleri veya iz elementler) demir (Fe), nikel (Ni), klor (CI),

manganez (Mn), çinko (Zn), bor (B), bakır (Cu), ve molibden

(Mo) ihtiyaç duyarlar.

(9)

Yapay Besin Ortamı

• Epstein (1971) e göre; bir element aşağıdaki durumlarda bitki gelişimi için mutlak gerekli olarak kabul edilir;

• Onsuz bitki gelişme periyodunu tamamlıyamıyorsa,

• Eğer aksiyonu sipesifik ve başka bir element tarafından yerine getirilemiyorsa,

• Bitki üzerine direk bir etkisi varsa

• Mutlak gerekli olduğu bilinen bir molekül

yapısındaysa.

(10)

(11)

Yapay Besin Ortamı

• Su

• Major elementler: N, P, K, Ca, Mg, S

• Minor (iz) elementler :, Mn, Zn, Cu, Na, Ni, CI, B,Mo

• Vitaminler: thiamin, nikotinik asit, pridoksin, Myo-inositol, folik asit, glisin ve glutamin

• Şekerler: sukroz, glikoz, maltoz, rafinoz ve fruktoz (20-60 g/l)

• Jel yapıcı maddeler: Agar (değişik tipleri),

agaroz, phytagel ve Gelrite. Genellikle % 0.25-

1.0 arasında kullanılırlar.

(12)

Yapay Besin Ortamı

• Bitki büyüme düzenleyicileri

• Bazı kimyasallar bitki dokuları içerisinde doğal olarak bulunurlar (endogenus) ve besin

değerinden ziyade düzenleyici etkide bulunurlar.

Bu bileşikler bitki hormonları veya bitki büyüme bileşikleri olarak bilinirler.

• Bitki büyümesi için aynı fizyolojik etkiyi gösteren sentetik kimyasallar da Bitki Büyüme

Düzenleyicileri olarak isimlendirilirler.

(13)

Bitki büyüme düzenleyicileri

• Bitki Büyüme düzenleyicileri 5 grupta toplanmaktadır.

1. Oksinler

2. Sitokininler 3. Gibberellinler 4. Etilen

5. Absisik asit

• Oksin ve sitokininler doku kültürlerinde gelişme için en önemli bileşiklerdir.

• Doğal olanlarla aynı veya yüksek etki yapan sentetik oksin ve sitokinler keşfedilmiştir.

• Doğal gibberellin ve absisik asite alternatif sentetik formları keşfedilmemiştir.

(14)

Oksinler

• Oksinler in vitro besin ortamlarının vazgeçilmezidir.

• Oksinler (sitokininlerlerle birlikte kullanılarak) kallus gelişimini, hücre süspansiyonunu ve organ gelişimini teşvik ederler.

• Morfogenesizin yönünü belirlerler

• Hücresel seviyede; oksinler hücre bölünmesi ve uzaması gibi temel işlemleri kontrol eder.

• Hücre bölünmesini başlatma kapasitesine sahip oldukları için, belirli organ veya organize olmayan dokulara dönüşen

meristemlerin oluşumunda rol alırlar.

• Oksin biyosentezinin meristematik bölge, hızlı büyüyen

yapraklar, kök uçları, koltuk altı meristemleri, ve gelişen

çiçeklerde daha yoğun olduğu düşünülmektedir.

(15)

Oksinler

• Oksin çeşidi ve miktarını etkileyen nedenler;

• İhtiyaç duyulan gelişme ve büyüme

• Oksinin alım ve hedef dokuya ulaşma hızı

• Yapay besin ortamında ve eksplant içerisinde oksinin inaktivasyonu (oksidasyon veya konjugasyon ile).

• Eksplantta oksinin doğal seviyesi ve sentezi

• Bitki dokularının oksine hassasiyeti

• Varsa, uygulanan oksin ile doğal endogenik (içsel)

bileşikler arasındaki ilişki.

(16)

Oksinler:

– İndol-3- bütrik asit (IBA), – indol-3- asetik asit (IAA), – naftalen asetik asit (NAA),

– 2,4-diklorofenoksi asetik asit (2,4-D), – Picloram,

– Dicamba

• Genel olarak, Kök ve kallus gelişimini teşvik ederler

• Bitki büyüme düzenleyicileri genellikle besin

ortamlarına 0.1-10 mg/l oranlarında ilave edilirler.

(17)

Sitokininler:

• Sitokininler özellikle protein sentezini teşvik eder ve hücre döngüsünde rol alırlar.

• Oksinlerle beraber hücre bölünmesi ve morfogenesizi (farklılaşmayı) teşvik ederler.

• Besin ortamına ilave edildiğinde apikal dominansiyi kırarak koltuk altı meristemlerin gelişimini sağlar.

En önemli sitokinler

– Benzilamino pürin (BAP), – Zeatin,

– Kinetin,

– Thidiazuron (TDZ)

• Genel anlamda Sürgün oluşumunu teşvik ederler.

(18)

Doku kültürlerinde oksin ve sitokinin birlikte kullanım etkisi

OKSİN SİTOKİNİN

Yüksek

Yüksek Düşük

Düşük Çelik/sürgünlerde kök oluşumu

Tek çeneklilerde (monokot) kallus oluşumu Embriyogenesizin ilk safhası

Kallustan anventik kök oluşumu

İki çeneklilerde (dikot) kallus başlangıcı Adventik sürgün/gövde oluşumu

Sürgün kültürlerinde yan sürgünlerin çoğalması

(19)

Gibberellinler

• 100’den fazla gibberellin grubu (GA) hormon bilinmektedir.

• GA

₁

hücre uzaması için en etkili olanıdır.

• Ticari olarak çok az gibberellin bulunmaktadır.

• GA

₃

(gibberellik asit) bitki doku kültürlerinde en fazla kullanılanıdır.

Gibberellinler birçok gelişme safhasında rol alırlar – Buğdaygillerde gövde ve yaprak uzaması,

– Tohum çimlenmesinin teşvik edilmesi, – Meyve gelişmesi

– Tazeliğin korunması

Doku kültürnde genel olarak hücre ve bitki uzamasını

teşvik ederler

(20)

Absisik asit (ABA)

• ABA yüksek oranlarda kullanıldığında genellikle kallus ve bitki bitki gelişimini engellemektedir.

• Ancak, düşük oranlarda kullanıldığında kallus ve bitki gelişimini teşvik etmektedir.

• Özellikle normal embriyo gelişiminde ABA gerekli

olmaktadır.

(21)

Etilen

• Atmosferde bulunan çok düşük oranlardaki etilenin bitki gelişimi ve büyümesini etkilediği uzun süredir

bilinmektedir.

• Etilen tüm canlı bitki dokuları tarafından üretilmekte ve büyümeyi düzenlemektedir.

• Temelde etilen gazı meyve olgunlaşmasında, yaşlanma ve yaprak dökülmesinde rol almaktadır.

• Doku kültürü sırasında kültür kaplarında etilen gazı üretilmekte ve bitki gelişimini olumsuz

etkileyebilmektedir.

(22)

Özgen vd.

(23)

After 12 months After 2 months

After 20 months After 8 months

Bulblet regeneration from immature embriyos of M. muscarimi

on MS + 4 mg/l BA +0.5 NAA Özcan Vd.

(24)

Komponentl er

Kültür Ortamlarındaki Konsantrasyon (mg/l)

MS B5 SH LS White

S-3 NN Nitsch's H KM LM SI

KNO3 1900 2500 2500 1900 80.0 950 950 1900 1900 -

NH₄NO₃ 1650 - - 1650 - 720 720 600 1650 -

NH₄H₂PO₄ - - 300 - - - - - - -

(NH4)2SO4 - 134 - - - - - - - -

MgSO4.7H2O 370 250 400 370 720 185 185 300 1850 370

CaCl2.2H2O 440 150 200 440 - 220 166 600 22 440

Ca(NO3)2.4H2O - - - - 300 - - - - -

KCl - - - - 65 - - 300 - 1400

KH₂PO₄ 170 - - 170 68 68 68.0 170 340 170

NaH2PO4.H2O - 150 - - - - - - - -

NaH2PO4 - - - - 16.5 - - - - -

Na2SO4 - - - - 200 - - - - -

MnSO₄.H₂O - 10 10 16.89 - - - 10 21 -

MnSO4.4H2O 22.3 - - - 7.0 25 25.0 - - 22.3

KI 0.83 0.75 1.0 0.83 0.75 - - 0.75 4.15 0.83

H3BO3 6.2 3.0 5.0 6.2 1.5 10 10.0 3.0 31 6.2

ZnSO4.7H2O 8.6 2.0 1.0 10.58 3.0 10 10.0 2.0 43 8.6

CuSO4.5H2O 0.025 0.025 0.2 0.025 - 0.025 0.025 0.025 0.50 0.025

Na₂MoO₄.2H₂O 0.25 0.25 0.1 0.25 - 0.25 0.25 0.25 1.25 0.25

CoCl2.6H2O 0.025 0.025 0.1 0.025 - - - 0.025 0.125 0.025

FeSO4.7H2O 27.8 27.8 15.0 27.85 - 27.8 - - 27.8 27.8

Fe2(SO4)3 - - - - 2.5 - - - - -

Sequestrene 330 Fe - - - - - - - 28 - -

Na2EDTA 37.3 37.3 20.0 - - 37.3 - - 37.3 37.3

Nikotinik asit 0.5 1.0 5.0 - - 5 - - 0.5 0.5

Pridoksin-HCl 0.5 1.0 0.5 - - 0.5 - 1.0 0.1 0.5

Thiamin-HCl 0.1 10.0 5.0 0.4 - 0.5 - 1 0.1 0.1

Biotin - - - - - 0.05 - 0.01 - -

Folik asit - - - - - 0.5 - 0.4 - -

myo-inositol 100 100 1 000 - - 100 - 100 100 100

l-inositol - - - 100.0 - - - - - -

Glisin 2.0 - - - - 2.0 - 0.1 - 2.0

Glutamin - - - - - - - - - 1462

Sakkaroz 30 000 20 000 30 000 - - 20 000 - 20 000 30 000 10 000

(25)

Sterilizasyon

• Çalışma ortamının sterilizasyonu Steril kabin kullanımı

• Besin ortamlarının sterilizasyonu

Besin ortamlarının sterilizasyonu için otoklavda 20 dakika boyunca 2 atm basınçta 121

^o

C’de tutulması yeterli olmaktadır.

• Alet ve ekipmanların sterilizasyonu

180

^o

C’de 2 saat kuru hava fırınında

(26)

(27)

Sterilizasyon

• Bitki materyallerinin yüzey sterilizasyonu

1. En fazla kullanılan yöntem ticari çamaşır suyu (sodyum hipoklorit-NaOCl)’dur. örnek: Axion, Domestos.

Ticari çamaşır suyu ve alkol kullanılırken bitki dokularına zarar vermeyecek, ancak bitki yüzeyinde bulunun bütün mikroorganizmaları öldürecek bir doz kullanılmalıdır.

Yeşil bitki aksamının (yaprak, petiol ve kök gibi) yüzey sterilizasyonunda %20-25’lik çamaşır suyu ile 15-20 dakika

Tohum yüzey sterilizasyonunda %75’lik çamaşır suyu 25- 30 dakika kullanılabilir.

2. Alkol (genellikle %75 oranında)

(28)

Kültür Şartları

• Yapay besin Ortamının pH değeri: 5.6-5.8

• Nem

• Işık : 15.000 luks

• Fotoperiyod: 16 saat aydınlık, 8 saat karanlık

• Sıcaklık : Genellikle 22-25

^o

C

(29)