Üriner Enterokok İzolatlarının Antibiyotik Direnci ile
Virülans Faktörleri Arasındaki İlişki
The Relationship Between Antibiotic Resistance and
Virulence Factors in Urinary Enterococcus Isolates
Orhan BAYLAN1, Hasan NAZİK2, Bayhan BEKTÖRE1, Burak Ekrem ÇİTİL1, Deniz TURAN2, Betigül ÖNGEN2, Mustafa ÖZYURT1, Cengiz Han AÇIKEL3, Tunçer HAZNEDAROĞLU1 1 Gülhane Askeri Tıp Akademisi, Haydarpaşa Eğitim Hastanesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Servisi, İstanbul.
1Gulhane Military Medical Academy, Haydarpasa Training Hospital, Department of Medical Microbiology, Istanbul, Turkey. 2 İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İstanbul.
2Istanbul University Faculty of Istanbul Medicine, Department of Medical Microbiology, Istanbul, Turkey. 3 Gülhane Askeri Tıp Akademisi, Halk Sağlığı Anabilim Dalı, Ankara.
3Gulhane Military Medical Academy, Department of Public Health, Ankara, Turkey.
ÖZET
Son yıllarda tüm dünyada nozokomiyal enterokok suşlarında artan çoklu antimikrobiyal direnç ge-lişimi, özellikle virülans faktörleri olmak üzere enterokokların daha iyi incelenmesi gerektiğini ortaya koymuştur. Klinik izolatların virülans faktörleri konusunda halen pek çok şey bilinmemektedir. Bu çalış-mada, hastanemizde Ocak 2008-Haziran 2010 ayları arasında yatan hastaların idrar kültürlerinden izo-le ediizo-len toplam 91 enterokok izolatının (59 E.faecalis, 31 E.faecium ve 1 E.gallinarum) çeşitli antibiyo-tiklere direnç durumları ve potansiyel virülans faktörlerinin araştırılması amaçlanmış ve aralarında bir ilişkinin var olup olmadığı irdelenmiştir. Bu amaçla, enterokokların virülans faktörlerinden agregasyon faktörü (AF), enterokok yüzey proteini (ESP) ve hiyalüronidazı (HYL) kodlayan genler (sırasıyla asa1,
esp, hyl) moleküler yöntemlerle, hemolizin üretimi ve jelatinaz aktivitesi ise fenotipik yöntemlerle
araş-tırılmıştır. Vankomisine dirençli bulunan enterokoklar, ayrıca vanA ve vanB genlerinin varlığı açısından incelenmiştir. E.faecium suşlarından 8 (%25.8)’inin glikopeptidlere dirençli olduğu saptanmış, bunların yedisinin vanA, birinin ise vanA-vanB dışı direnç tipinde olduğu belirlenmiştir. Yüksek düzey gentami-sin ve yüksek düzey streptomigentami-sin direnci, E.faecium suşlarında sırasıyla %74.2 ve %61.3 iken, E.faecalis suşlarında %22 ve %27.1 olarak tespit edilmiştir. İncelenen suşların hiçbirisinde beta-laktamaz üretimi ve linezolid direnci tespit edilmemiştir. Tetrasiklin, minosiklin, doksisiklin ve streptogramin dışında test edilen antibiyotiklere E.faecium izolatlarının, E.faecalis izolatlarına göre daha dirençli (p< 0.001-0.013), bu dört antibiyotiğe ise daha duyarlı (p< 0.001) oldukları saptanmıştır. E.faecalis izolatlarında esp (p= 0.003) ve asa1 (p< 0.001) gen pozitifliğinin yanı sıra hemolizin üretimi (p= 0.014) ve jelatinaz
aktivi-Geliş Tarihi (Received): 06.01.2011 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 06.04.2011
tesi (p= 0.029), E.faecium izolatlarında ise hyl gen pozitifliği (p< 0.001) anlamlı düzeyde yüksek bulun-muştur. AF ve ESP, sırasıyla %26.7 ve %25.6 pozitiflik oranları ile çalışmamızda en sık saptanan virülans faktörleri olmuştur. İzolatlarımızdan 5 (%5.6)’inin üçer, 16 (%17.8)’sının ikişer ve 37 (%41.1)’sinin ise sadece birer virülans faktörü içerdiği, 32 (%35.6) izolatın ise herhangi bir virülans faktörü içermediği belirlenmiştir. İncelenen virülans faktörlerinden tümünü veya dördünü bir arada içeren izolat saptan-mamıştır. Çalışmamızda ayrıca asa1 geni pozitif E.faecalis izolatlarının siprofloksasin (p= 0.001), norf-loksasin (p= 0.006) ve levofnorf-loksasine (p= 0.001), esp geni pozitif E.faecalis izolatlarının doksisikline (p= 0.043) ve hyl geni pozitif E.faecium izolatlarının ise nitrofurantoine (p= 0.011), söz konusu genleri içer-meyen izolatlara göre anlamlı düzeyde daha dirençli oldukları saptanmıştır. Bu çalışma, üriner entero-kok izolatlarının antibiyotik direnci ile virülans faktörleri arasındaki ilişkinin incelendiği ülkemizdeki ilk hasta kaynaklı çalışma olma özelliğini taşımaktadır.
Anahtar sözcükler: Yatan hasta; üriner sistem enfeksiyonu; Enterococcus türleri; antimikrobiyal direnç;
vi-rülans faktörü.
ABSTRACT
Increasing multidrug resistance in nosocomial Enterococcus strains from all over the world recently enhances the need for further investigation of enterococci, especially their virulence factors. There are still many lacking parts about virulence factors of clinical enterococcus isolates. In this study, it was ai-med to investigate the antibiotic resistance and the presence of potential virulence factors of 91
Ente-rococcus strains (59 E.faecalis, 31 E.faecium and 1 E.gallinarum) isolated from urine cultures of
inpati-ents between January 2008-June 2010 in our hospital and also to evaluate whether a correlation exis-ted between antibiotic resistance and potential virulence factors. The genes which encoded virulence factors of enterococci; aggregation substance (AS), enterococcal surface protein (ESP) and hyaluroni-dase (HYL) (asa1, esp, hyl respectively) were studied by molecular methods and haemolysin producti-on and gelatinase activity were studied by phenotypic methods. Vancomycin-resistant strains were checked for the presence of vanA and vanB genes. Eight (25.8%) E.faecium isolates were found glyco-peptide resistant. In seven of these isolates resistance type was vanA and in one it was neither vanA nor vanB. High-level gentamicin and high-level streptomycin resistance rates were 74.2% and 61.3% in E.faecium strains and were 22% ve 27.1% in E.faecalis strains, respectively. Beta-lactamase produc-tion and linezolid resistance were not detected in any of the strains. E.faecium isolates were more re-sistant (p< 0.001-0.013) than E.faecalis isolates to all tested antibiotics except tetracycline, minocycli-ne, doxycycline and streptogramin (p< 0.001). hyl gene positivity (p< 0.001) was found higher in
E.fa-ecium isolates whereas esp (p= 0.003) and asa1 (p< 0.001) gene positivity, haemolysin production (p=
0.014) and gelatinase activity (p= 0.029) were higher in E.faecalis isolates. AS and ESP were the most frequent virulence factors, with the rates of 26.7% and 25.6%, respectively. There were 32 (35.6%) strains without any of the investigated virulence factors. We have also detected that asa1 gene positi-ve E.faecalis isolates were more resistant to ciprofloxacin (p= 0.001), norfloxacin (p= 0.006) and levof-loxacin (p= 0.001) than asa1 gene negative isolates; esp gene positive E.faecalis isolates were more re-sistant to doxycycline (p= 0.043) than esp gene negative isolates and hyl gene positive E.faecium iso-lates were more resistant to nitrofurantoine (p= 0.011) than hyl gene negative isoiso-lates. This was the first clinical sample originated study, investigating the corelation between antibiotic resistance and vi-rulence factors in urinary Enterococcus isolates in Turkey.
Key words: Enterococcus spp.; inpatients; urinary tract infection; antimicrobial resistance; virulence
GİRİŞ
İnsan ve hayvanlarda doğal flora üyesi olarak bulunan enterokoklar, günümüzde, baş-ta üriner sistem enfeksiyonu (ÜSE) olmak üzere birçok nozokomiyal enfeksiyonun en yaygın görülen etkenlerindendir1-14. Enfeksiyonlardan sorumlu en az 12 enterokok türü-nün varlığına rağmen en sık E.faecalis ve E.faecium türlerine rastlanmaktadır2.
Enterokokların nozokomiyal ÜSE olan hastalardan izolasyon oranı yıllar içerisinde düzen-li artış göstermekte olup son yıllarda saptanma sıklıkları ikinci sıraya yükselmiştir1,2,10,12,15. Tüm dünyada özellikle nozokomiyal enterokok suşlarında giderek artan çoklu antimikrobi-yal direnç gelişimi, ciddi sorunlara neden olmaya başlamıştır1,2,8,10,11,14,15. Enterokoklar, birçok beta-laktam antibiyotiğe ve aminoglikozidlere intrinsik olarak ya dirençli ya da tole-ranslıdırlar13,14. Antibiyotiklere karşı direnç gelişimi, direnç genlerini içeren transpozon ve-ya plazmidlerin kazanılmasıyla veve-ya mutasyonlarla olmaktadır13. Enterokokların antibiyotik direnci ile ilgili konularda yapılan çok sayıdaki çalışmaya rağmen, virülans faktörleri ve pa-tojenite mekanizmaları konularında yapılan çalışmalar yetersiz kalmaktadır2,6,8,10-15.
Enterokokların virülansında, genomda bulunan patojenite adaları ve plazmidlerde kodlanan virülans genleri rol oynar. Bu bakterilerin başlıca virülans faktörleri arasında; agregasyon faktörü (AF), enterokok yüzey proteini (ESP), hiyalüronidaz (HYL), hemolizin ve jelatinaz yer almaktadır1-4,9-14,16,17. AF, plazmidlerdeki asa1 geni tarafından kodlanan ve E.faecalis’lerin yüzeyinde eksprese edilen bir glikoproteindir. E.faecalis enfeksiyonları-nın başlangıcında rol oynadığı düşünülen AF, bakterinin nötrofil, kalp endokard ve böb-rek tübüler hücreleri gibi çeşitli hücre yüzeylerine adezyonunu artırmaktadır1,3,7-10. Kro-mozomal esp geni tarafından kodlanan ve hücre duvarı ile ilişkili bir protein olan ESP, esas olarak E.faecalis’in hücre yüzeyinde yer alır. Bakteriyi, konağın bağışıklık sisteminden koruduğu düşünülen ESP, enterokokların üriner sistemde persistansı, kolonizasyonu ve artmış virülansı ile ilişkili bulunmuştur1-3,5-7,9,10,12,14-16. Kromozomal hyl geni tarafından kodlanan ve özellikle E.faecium tarafından sentezlenen HYL, hyalüronik asidi etkileyerek doku hasarına yol açmakta, bağ dokusunun mukopolisakkarid kısmını depolimerize et-mekte, böylece enterokokların olduğu kadar toksinlerinin de konak dokusunda yayılma-sını kolaylaştırmaktadır10. Ancak HYL’nin ÜSE patogenezindeki rolü tam olarak anlaşıla-mamıştır10,14,16. Hemolizin, insan, tavşan ve at eritrositlerini parçalayan ve birçok gram-pozitif bakteriye karşı bakterisidal olan bir toksindir7,10,13. Hemolizin, hem ökaryotik hem de prokaryotik hücrelerde lizise neden olmasından dolayı daha çok sitolizin olarak adlan-dırılır7,9,12. Hemolizin genleri (cyl), genellikle feromona duyarlı plazmidler üzerinde taşı-nırlar; ancak patojenite adaları içinde bakteriyel kromozoma da entegre olabilir-ler1,3,9,10,12. Kromozomal gelE geni tarafından kodlanan jelatinaz (metalloproteaz) enzi-mi ise, kollajen, jelatin, kazein, hemoglobin ve diğer biyoaktif küçük peptidleri hidrolize eden ve hayvan modellerinde endoftalmit ve endokarditi şiddetlendiren hücre dışı bir çinko-endopeptidazdır1,3,5,9,10,13,14,16.
faktörle-rinin belirlenmesi ve antibiyotik direnç durumları ile virülans faktörleri arasında bir ilişki-nin irdelenmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla, enterokokların virülans faktörlerinden asa1, esp ve hyl genleri moleküler yöntemlerle, hemolizin üretimi ve jelatinaz aktivitesi ise fe-notipik yöntemlerle araştırılmıştır. Çalışmamızda aynı zamanda vankomisine dirençli bu-lunan enterokoklar, vanA ve vanB genlerinin varlığı açısından incelenmiştir.
GEREÇ ve YÖNTEM Hastalar
Çalışmaya, hastanemizin farklı servislerinde ≥ 3 gün yatan, üriner sistem şikayetleri nede-niyle yapılan idrar kültürlerinde saf kültür olarak ≥ 105cfu/ml enterokok cinsi bakteri üreyen ve klinik olarak komplike olmamış alt ÜSE tanısı konan 91 hasta (53 erkek, 38 kadın) alındı.
Bakterilerin İzolasyonu ve Tanımlanması
Yatan hastaların uygun koşullarda alınarak laboratuvarımıza gönderilen orta akım idrar örnekleri, %5’lik koyun kanlı agar (Salubris, Türkiye) ve eozin metilen mavisi agar (Salub-ris, Türkiye) besiyerlerine ekildi ve 37°C’de 24 saat inkübe edildi. Gram-pozitif kok mor-folojisinde, katalaz testi negatif kolonilerden alınarak %40’lık safra tuzu içeren eskülin agar (Merck, Almanya) ve %6.5’lik NaCl eklenmiş beyin kalp infüzyon buyyona (HiMedia, Hin-distan) ekimler yapıldı. Ayrıca suşlara pirolidonil arilamidaz (PYR) (Oxoid, İngiltere) testi uygulandı. Eskülin besiyerini karartan, %6.5’lik NaCl içeren besiyerinde üreyebilen ve PYR testi pozitif bakteriler, enterokok cinsi olarak tanımlandı. İzolatların tür düzeyinde tanım-lanması, VITEK 2 Compact otomatize sisteminin (bioMerieux, Fransa) GP kolorimetrik ta-nımlama kartları kullanılarak yapıldı.
Duyarlılık Testi
Tür düzeyinde tanımlanan 91 enterokok suşunun antibiyotiklere direnç durumları, “Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)”18önerileri doğrultusunda Kirby-Ba-uer disk difüzyon yöntemi ile Mueller Hinton agar (Salubris, Türkiye) besiyeri kullanıla-rak araştırıldı. Duyarlılık testlerinde, vankomisin (30 µg), tetrasiklin (30 µg), rifampin (5 µg), penisilin G (10 µg), siprofloksasin (5 µg), levofloksasin (5 µg), norfloksasin (10 µg), teikoplanin (30 µg), ampisilin (10 µg), minosiklin (30 µg), doksisiklin (30 µg), nitrofu-rantoin (300 µg), yüksek düzey gentamisin (120 µg) ve yüksek düzey streptomisin (300 µg) diskleri (Bioanalyse, Türkiye) ile linezolid (30 µg), kinopristin/dalfopristin (streptog-ramin) (15 µg), fosfomisin trometamin (200 µg fosfomisin + 50 µg glikoz–6-fosfat) disk-leri (Oxoid, İngiltere) kullanıldı. Beta-laktamaz aktivitesi, kromojenik nitrosefin diski (Ce-finase, Becton Dickinson BBL, ABD) ile araştırıldı.
Moleküler Testler
Enterokok izolatlarının esp, asa1 ve hyl virülans genlerinin amplifikasyonu, ısı döngü cihazı (TP 600 Takara, Japonya) kullanılarak gerçekleştirildi. esp gen bölgesinin [954 baz çifti (bç)] amplifikasyonu, Shankar ve arkadaşlarının12 tarif ettiği şekilde esp11 (5’-TTGCTAATGCTAGTCCACGACC-3’) ve esp12 (5’-GCGTCAACACTTGCATTGCCGAA-3’) primerleri kullanılarak; asa1 (375 bç) ve hyl (276 bç) genlerinin amplifikasyonu ise Van-kerckhoven ve arkadaşlarının3 tarif ettiği multipleks polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemi ile sırasıyla asa11 (5’-GCACGCTATTACGAACTATGA-3’)/asa12 (5’-TAAGAAAGA-ACATCACCACGA-3’) ve hyln1 (5’-ACAGAAGAGCTGCAGGAAATG-3’)/hyln2 (5’-GACT-GACGTCCAAGTTTCCAA-3’) primerleri kullanılarak yapıldı. vanA geni (732 bç), vanA1 (5’GGGAAAACGACAATTGC3’) ve vanA2 (5’-GTACAATGCGGCCGTTA-3’); vanB geni (1145 bç) ise vanB (5’-GTGCTGCGAGATACCACAGA-3’) ve vanBrev (5’-CGAACAC-CATGCAACATTTC-3’) primerleri kullanılarak araştırıldı11. vanA ve vanB genleri için PCR, 94°C’de 5 dakika başlangıç denatürasyonunu takiben 94°C’de 1 dakika denatürasyon, 54°C’de 1 dakika bağlanma, 72°C’de 1 dakika uzama döngülerinin 30 kez tekrarlanma-sıyla ve 72°C’de 10 dakika son bir uzama döngüsü şeklinde gerçekleştirildi.
Amplifikasyon sonrası PCR ürünlerinin 12 µl’si alınarak 5 µl jel yükleme tamponuyla karıştırıldı ve %1.5’lik jel içerisine yüklenerek 90 V akım altında 45 dakika süreyle elekt-roforez uygulandı. Moleküler belirteç olarak 100 bç’lik DNA (Biomatik Corp., Kanada) kullanıldı (Şekil 1A).
Fenotipik Testler
Suşlar, %5 defibrine taze insan kanı eklenmiş Colombia kanlı agar (Oxoid, İngiltere) plaklarına ekildi. Suşlardaki hemolizin varlığı, plaklar 37°C’de, 48 saat inkübe edildikten sonra kolonilerin etrafında beta-hemolitik reaksiyon oluşumu ile belirlendi (Şekil 1B). Je-latinaz aktivitesi ise %1.5 “skim milk” ile zenginleştirilmiş triptik soy agarda (Oxoid, İn-giltere) üreyen koloniler etrafında berrak bir halo görülmesi ile saptandı (Şekil 1C).
Kalite Kontrol
Aynı hastaya ait farklı idrar örneklerinden izole edilmiş benzer antibiyotik duyarlılık pa-terni gösteren enterokok suşları değerlendirmeye alınmadı. Kalite kontrol amacıyla Staphylococcus aureus ATCC 25923 ve E.faecalis ATCC 29212 standart suşları kullanıldı.
İstatistiksel Analiz
Bu çalışmada E.gallinarum izolatı, tek olarak izole edildiğinden istatistiksel analizlere da-hil edilmedi. İstatistiksel analiz, SPSS for Windows Version 17.0 (SPSS Inc., ABD) kullanı-larak yapıldı. Direnç oranları ve virülans faktörlerinin dağılımı, ki kare ve Fisher kesin testi ile karşılaştırıldı ve p< 0.05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
BULGULAR
bakımından istatistiksel bir farklılık tespit edilmemiştir. Tetrasiklin, minosiklin, doksisik-lin ve streptogramin dışında test edilen antibiyotiklere E.faecium izolatlarının E.faecalis izolatlarına göre daha dirençli (p< 0.001-0.013), bu dört antibiyotiğe ise daha duyarlı (p< 0.001) oldukları saptanmıştır. İzolatların hiçbirisinde beta-laktamaz üretimi saptan-mamıştır.
Sekiz (%25.8) E.faecium suşunun fenotipik olarak hem vankomisin hem de teikopla-nine dirençli olduğu saptanmış; moleküler çalışma sonunda yedisinin vanA, birinin ise vanA-vanB dışı direnç tipinde olduğu belirlenmiştir. Glikopeptidlere dirençli E.faecium izolatlarının tamamının penisilin G, ampisilin, siprofloksasin, levofloksasin, rifampin, yük-sek düzey streptomisin (YDS) ve yükyük-sek düzey gentamisin (YDG)’e dirençli; linezolid ve streptogramine ise duyarlı oldukları saptanmıştır. İzole edilen 59 E.faecalis suşunun ise ta-mamının vankomisine ve teikoplanine duyarlı olduğu tespit edilmiştir.
E.faecium izolatlarında YDG ve YDS direnci sırasıyla %74.2 ve %61.3 iken, E.faecalis izolatlarında %22 ve %27.1 olarak belirlenmiştir. Hem YDG hem de YDS direnci göste-ren izolatların oranı, E.faecium ve E.faecalis izolatları içinde sırasıyla %54.8 (17/31) ve %13.6 (8/59) olarak saptanmıştır.
Şekil 1. A. 1 ve 9 esp geni (954 bç) pozitif enterokok suşları; 2, 5 ve 7 asa1 geni (375 bç) pozitif suşlar; 3,
4, 8 ve 10 hyl geni (276 bç) pozitif suşlar; 6 ve 11 negatif suşlar; MM: Moleküler belirteç. B. Hemolizin üre-timi pozitif ve negatif iki enterokok suşu. C. Jelatinaz aktivitesi pozitif ve negatif iki enterokok suşu.
İzole edilen tek E.gallinarum suşunun ampisilin, tetrasiklin, doksisiklin, minosiklin, fos-fomisin, vankomisin, teikoplanin, YDS, linezolid ve streptogramine duyarlı; penisilin G, rifampin, nitrofurantoin, YDG, siprofloksasin, norfloksasin ve levofloksasine ise dirençli olduğu tespit edilmiştir. Bu tek E.gallinarum izolatının araştırılan hiçbir virülans faktörü-nü içermediği tespit edilmiş, diğer izolatlarda virülans faktörlerinin dağılımı ise Tablo II’de verilmiştir. AF ve ESP, sırasıyla %26.7 ve %25.6 pozitiflik oranları ile en sık saptanan virülans faktörleri olmuştur. İstatistiksel analizde, E.faecalis izolatlarında esp (p= 0.003) ve asa1 (p< 0.001) gen pozitifliğinin yanı sıra hemolizin üretimi (p= 0.014) ve jelatinaz ak-tivitesi (p= 0.029), E.faecium izolatlarında ise hyl gen pozitifliği (p< 0.001) anlamlı dü-zeyde yüksek bulunmuştur. İncelenen virülans faktörlerinden tümünü veya dördünü içe-ren herhangi bir enterokok izolatı saptanmamıştır. İzolatlardan 5 (%5.6)’inin üçer, 16 (%17.8)’sının ikişer ve 37 (%41.1)’sinin sadece birer virülans faktörü içerdiği, 32 (%35.6)’sinin ise herhangi bir virülans faktörü içermediği izlenmiştir.
Tablo I. E.faecalis ve E.faecium İzolatlarının Çeşitli Antibiyotiklere Direnç Durumları E.faecalis (n= 59) E.faecium (n= 31) S I R S I R n % n % n % n % n % n % p P 54 91.5 0 5 8.5 1 3.2 0 30 96.8 < 0.001 AMP 51 86.4 0 8 13.6 7 22.6 0 24 77.4 < 0.001 CIP 24 40.7 17 28.8 18 30.5 3 9.7 0 28 90.3 < 0.001 NOR 24 40.7 15 25.4 20 33.9 3 9.7 2 6.4 26 83.9 < 0.001 LEV 41 69.5 2 3.4 16 27.1 4 12.9 0 27 87.1 < 0.001 FOS 36 61 10 16.9 13 22 24 77.4 2 6.4 5 16.1 0.240 TE 17 28.8 0 42 71.2 22 71 0 9 29 < 0.001 DOK 18 30.5 25 42.4 16 27.1 23 74.2 2 6.5 6 19.4 < 0.001 MIN 19 32.2 8 13.6 32 54.2 23 74.2 4 12.9 4 12.9 < 0.001 GN 46 78 0 13 22 8 25.8 0 23 74.2 < 0.001 STR 41 69.5 2 3.4 16 27.1 11 35.5 1 3.2 19 61.3 0.006 RIF 6 10.2 11 18.6 42 71.2 1 3.2 0 30 96.8 0.013 NIT 57 96.6 1 1.7 1 1.7 11 35.5 3 9.7 17 54.8 < 0.001 QDF 6 10.2 8 13.6 45 76.3 26 83.9 4 12.9 1 3.2 < 0.001 VA 59 100 0 0 23 74.2 0 8 25.8 < 0.001* TEI 59 100 0 0 23 74.2 0 8 25.8 < 0.001* LNZ 59 100 0 0 31 100 0 0 NA
* Fisher’s exact test.
İzolatların antibiyotiklere direnç durumları ile içerdikleri virülans faktörleri arasındaki istatistiksel ilişki, E.faecalis için Tablo III, E.faecium için ise Tablo IV’de sunulmuştur. An-tibiyotiklere orta duyarlı olarak saptanan suşların düşük sayıda olmaları nedeniyle Tab-lo III ve IV’ün istatistiksel analizinde duyarlı suşlarla birlikte değerlendirilmiştir. Çalışma-mızda, asa1 geni pozitif E.faecalis izolatlarının siprofloksasin (p= 0.001), norfloksasin (p= 0.006) ve levofloksasine (p= 0.001); esp geni pozitif E.faecalis izolatlarının doksisik-line (p= 0.043) söz konusu genleri içermeyen izolatlara göre anlamlı düzeyde daha di-rençli oldukları saptanmıştır. Aynı şekilde hyl geni pozitif E.faecium izolatlarında nitrofu-rantoin (p= 0.011) direncinin, hyl geni negatif olanlara göre anlamlı düzeyde yüksek bulunduğu tespit edilmiştir. Geri kalan enterokok türlerinin diğer antibiyotiklere direnç-lilik durumları ile içerdikleri virülans faktörleri arasında istatistiksel bir ilişki (p> 0.05) ku-rulamamıştır.
Tablo II. İzole Edilen Enterokok Türlerine Göre Virülans Faktörlerinin Dağılımı
E.faecalis E.faecium Toplam
(n= 59) (n= 31) (n= 90) Virülans faktörleri n % n % n % p AF 24 40.7 0 24 26.7 < 0.001 ESP 21 35.6 2 6.5 23 25.6 0.003 HYL 1 1.7 12 38.7 13 14.4 < 0.001* Jelatinaz aktivitesi 13 22 1 3.2 14 15.6 0.029* Hemolizin üretimi 10 16.9 0 10 11.1 0.014* Sadece AF 4 6.8 0 4 4.4 NA Sadece ESP 14 23.7 1 3.2 15 16.7 NA Sadece HYL 0 11 35.5 11 12.2 NA
Sadece jelatinaz aktivitesi 5 8.5 1 3.2 6 6.7 NA
Sadece hemolizin üretimi 1 1.7 0 1 1.1 NA
ESP + AF birlikteliği 3 5.1 0 3 3.3 NA
ESP + HYL birlikteliği 0 1 3.2 1 1.1 NA
Hemolizin + AF birlikteliği 6 10.2 0 6 6.7 NA
Jelatinaz + AF birlikteliği 6 10.2 0 6 6.7 NA
Hemolizin + ESP + AF birlikteliği 3 5.1 0 3 3.3 NA
Jelatinaz + AF + HYL birlikteliği 1 1.7 0 1 1.1 NA
Jelatinaz + ESP + AF birlikteliği 1 1.7 0 1 1.1 NA
Negatif 15 25.4 17 54.8 32 35.6 NA
* Fisher’s exact test.
Tablo III. Enterococcus faecalis (n= 59) İzolatlarının Antibiyotiklere Direnç Durumları ile Virülans
Faktörle-rinin İlişkisi
n esp asa1 hyl J H n esp asa1 hyl J H
Penisilin G Ampisilin S+I 54 21 21 1 12 10 51 18 21 1 11 9 R 5 0 3 0 1 0 8 3 3 0 2 1 T 59 21 24 1 13 10 59 21 24 1 13 10 p 0.150* 0.388* 1.000* 1.000* 0.577* 1.000* 1.000* 1.000* 1.000* 1.000* Siprofloksasin Norfloksasin S+I 41 13 11 0 8 7 39 12 11 0 8 7 R 18 8 13 1 5 3 20 9 13 1 5 3 T 59 21 24 1 13 10 59 21 24 1 13 10 p 0.347 0.001 0.305* 0.509* 1.000* 0.280 0.006 0.339* 0.746* 1.000* Levofloksasin Tetrasiklin S+I 43 13 12 0 9 7 17 4 5 0 6 2 R 16 8 12 1 4 3 42 17 19 1 7 8 T 59 21 24 1 13 10 59 21 24 1 13 10 p 0.159 0.001 0.271* 0.735* 1.000* 0.218 0.262 1.000* 0.166* 0.708* Doksisiklin Minosiklin S+I 43 12 18 1 12 7 27 7 8 0 9 3 R 16 9 6 0 1 3 32 14 16 1 4 7 T 59 21 24 1 13 10 59 21 24 1 13 10 p 0.043 0.762 1.000* 0.090* 1.000* 0.154 0.113 1.000* 0.054 0.319* Gentamisin Streptomisin S+I 46 15 16 0 9 10 43 13 17 0 11 8 R 13 6 8 1 4 0 16 8 7 1 2 2 T 59 21 24 1 13 10 59 21 24 1 13 10 p 0.513* 0.083 0.220* 0.455* 0.098* 0.159 0.770 0.271* 0.481* 0.713* Rifampin Nitrofurantoin S+I 17 8 8 0 2 4 58 21 23 1 13 10 R 42 13 16 1 11 6 1 0 1 0 0 0 T 59 21 24 1 13 10 59 21 24 1 13 10 p 0.242 0.526 1.000* 0.310* 0.453* 1.000* 0.407* 1.000* 1.000* 1.000* Fosfomisin Streptogramin S+I 46 18 20 1 10 9 14 2 3 0 3 3 R 13 3 4 0 3 1 45 19 21 1 10 7 T 59 21 24 1 13 10 59 21 24 1 13 10 p 0.344* 0.410 1.000* 1.000* 0.432* 0.108* 0.093 1.000* 1.000* 0.688* Vankomisin Teikoplanin S+I 59 21 24 1 13 10 59 21 24 1 13 10 R 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 T 59 21 24 1 13 10 59 21 24 1 13 10 p NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA
*Fisher’s exact test.
Tablo IV. Enterococcus faecium (n= 31) İzolatlarının Antibiyotiklere Direnç Durumları ile Virülans
Faktörle-rinin İlişkisi
n esp asa1 hyl J H n esp asa1 hyl J H
Penisilin G Ampisilin S+I 1 0 0 0 0 0 7 1 0 2 0 0 R 30 2 0 12 1 0 24 1 0 10 1 0 T 31 2 0 12 1 0 31 2 0 12 1 0 p 1.000* NA 1.000* 1.000* NA 0.406* NA 0.676* 1.000* NA Siprofloksasin Norfloksasin S+I 3 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 R 28 2 0 12 1 0 26 2 0 12 1 0 T 31 2 0 12 1 0 31 2 0 12 1 0 p 1.000* NA 0.265* 1.000* NA 1.000* NA 0.128* 1.000* NA Levofloksasin Tetrasiklin S+I 4 0 0 0 0 0 22 2 0 11 0 0 R 27 2 0 12 1 0 9 0 0 1 1 0 T 31 2 0 12 1 0 31 2 0 12 1 0 p 1.000* NA 0.139* 1.000* NA 1.000* NA 0.101* 0.290* NA Doksisiklin Minosiklin S+I 25 2 0 11 1 0 27 2 0 12 1 0 R 6 0 0 1 0 0 4 0 0 0 0 0 T 31 2 0 12 1 0 31 2 0 12 1 0 p 1.000* NA 0.363* 1.000* NA 1.000* NA 0.139* 1.000* NA Gentamisin Streptomisin S+I 8 0 0 2 0 0 12 1 0 4 0 0 R 23 2 0 10 1 0 19 1 0 8 1 0 T 31 2 0 12 1 0 31 2 0 12 1 0 p 1.000* NA 0.433* 1.000* NA 1.000* NA 0.717 1.000* NA Rifampin Nitrofurantoin S+I 1 0 0 0 0 0 14 1 0 2 1 0 R 30 2 0 12 1 0 17 1 0 10 0 0 T 31 2 0 12 1 0 31 2 0 12 1 0 p 1.000* NA 1.000* 1.000* NA 1.000* NA 0.011 0.452* NA Fosfomisin Streptogramin S+I 26 2 0 10 1 0 30 2 0 12 1 0 R 5 0 0 2 0 0 1 0 0 0 0 0 T 31 2 0 12 1 0 31 2 0 12 1 0 p 1.000* NA 1.000* 1.000* NA 1.000* NA 1.000* 1.000* NA Vankomisin Teikoplanin S+I 23 2 0 10 0 0 23 2 0 10 0 0 R 8 0 0 2 1 0 8 0 0 2 1 0 T 31 2 0 12 1 0 31 2 0 12 1 0 p 1.000* NA 0.433* 0.258* NA 1.000* NA 0.433* 0.258* NA
* Fisher’s exact test.
TARTIŞMA
İnsan enterokok enfeksiyonlarının baskın türü E.faecalis olup, klinik enfeksiyonların yaklaşık %75-90’ından sorumlu tutulmakta; geri kalanın çoğunluğunu ise E.faecium oluş-turmaktadır2,4,5,8,10,12,19. Hareketli enterokokların (E.gallinarum, E.casseliflavus) izolasyon oranları ise oldukça düşüktür (< %2)2. Çalışmamızda izole edilen enterokokların %64.8’ini E.faecalis, %34.1’ini E.faecium ve %1.1’ini E.gallinarum oluşturmuştur. Antibi-yotiklere E.faecalis’ten daha dirençli olan E.faecium’un hastanemizde yüksek oranda izo-le edilmiş olması, uygun enfeksiyon kontrol önizo-lemizo-lerinin alınabilmesi için enterokokların tür düzeyinde tanımlanması gerekliliğini ortaya koymaktadır.
Klasik bir virülans faktörü olmamasına rağmen, enterokokların çoklu antimikrobiyal ajanlara geliştirdiği direnç, hayatta kalmalarını ve çoğalmalarını kolaylaştırır2. Enterokok türlerinin, antibiyotikleri hücre içine alabilmeleri için gerekli olan enerjiyi üretecek sitok-rom enzimlerine sahip olmamaları, aminoglikozidlerin düşük konsantrasyonlarına doğal direnç göstermelerine neden olur10. Çalışmamızda, tetrasiklin, minosiklin, doksisiklin ve streptogramin dışında test edilen antibiyotiklere E.faecium izolatlarının E.faecalis izolatla-rına göre daha dirençli (p< 0.001-0.013), bu dört antibiyotiğe ise daha duyarlı (p<0.001) oldukları saptanmıştır (Tablo I). Fosfomisine direnç bakımından türler arasın-da istatistiksel bir farklılık saptanmamıştır. İzolatlarımızın hiçbirisi, olasılıkla yeni ruhsat al-ması ve sınırlı kullanılmaları nedeniyle linezolide dirençli bulunmamıştır. E.faecium suşla-rının, ampisilin (%77.4), penisilin (%96.8) ve vankomisinin (%25.8) yanı sıra yüksek dü-zey gentamisin (%74.2) ve yüksek düdü-zey streptomisine (%61.3) değişik oranlarda di-rençli oldukları saptanmıştır. Beta-laktam ve glikopeptidler gibi hücre duvarına etkili an-tibiyotiklere karşı gelişen direncin sıklıkla yüksek düzey aminoglikozid direnci ile birlikte bulunması, aralarındaki sinerjik etkinin kaybolmasına ve sonuçta ciddi enterokok enfek-siyonlarında tedavi seçeneklerinin azalmasına neden olmaktadır4,9. Bu bakımından söz-konusu direnç oranlarımız uyarı niteliğindedir. Mato ve arkadaşlarının19 ampisiline di-rençli 97 izolatın hiçbirisinde beta-laktamaz üretimi saptamamalarına benzer olarak, ça-lışmamızda incelenen 91 enterokok suşunun hiçbirisinde beta-laktamaz üretimi tespit edilmemiştir.
Nozokomiyal enterokok enfeksiyonlarının gelişiminde iki basamaklı bir süreçten söz edil-mektedir. Yatan hastalarda, öncelikle antibiyotik direnci olan ve çeşitli virülans faktörlerini barındıran hastane kaynaklı enterokoklar ile asemptomatik gastrointestinal kolonizasyon gelişmekte; daha sonra enterik floranın antibiyotiklerle baskılanması sonucu söz konusu di-rençli suşlar, hastaların gastrointestinal sisteminde yaygınlaşmaktadır. Bir grup hastada, doğrudan ya da dolaylı olarak doku invazyonu ile sistemik yayılım gelişebilmektedir. Bu sü-reçlerde virülans faktörlerinin işlev gördükleri sanılmaktadır2. Sonuçta enterokok enfeksi-yonlarının gelişiminde, adezyon, translokasyon ve bağışıklık sisteminden kaçışı içeren çeşit-li virülans özelçeşit-likleri etkin olmaktadır4. Çalışmamızda, üriner E.faecalis izolatlarının %40.7’sinde asa1, %35.6’sında esp ve %1.7’sinde hyl geni pozitifliği saptanmış; %22’sinin jelatinaz ve %16.9’unun hemolizin ürettiği belirlenmiştir (Tablo II). E.faecium klinik izolat-ları dikkate alındığında ise; hyl ve esp gen pozitifliği sırasıyla %38.7 ve %6.5 olarak bulun-muş; suşların %3.2’sinde jelatinaz aktivitesi saptanmış; asa1 gen pozitifliği ve hemolizin üretimi tespit edilmemiştir (Tablo II). Çalışmamızda asa1 (p< 0.001) ve esp (p= 0.003) gen pozitifliğinin yanı sıra jelatinaz aktivitesi (p= 0.029) ve hemolizin üretimi (p= 0.014) E.fa-ecalis izolatlarında, hyl geni pozitifliği (p< 0.001) ise E.faecium izolatlarında anlamlı düzey-de yüksek bulunmuştur. Bu durum, diğer çalışmalar ile paralellik göstermektedir7-9,19.
Guzman ve arkadaşları20ÜSE’li hastalardan izole edilen E.faecalis’lerin in vitro ortam-da üriner sistem epitel hücrelerine yapıştığını göstermişler ve bu yapışmaortam-dan bakteri hücre duvarında bulunan AF gibi karbonhidrat antijenlerinin sorumlu olduğunu ileri sür-müşlerdir. Çalışmamızda asa1 gen pozitifliği E.faecium izolatlarında saptanmazken, ecalis izolatlarında %40.7 gibi yüksek bir oranda bulunmuştur. Bu durum asa1’in E.fa-ecalis için önemli bir virülans faktörü olduğunu düşündürmekte, yapılan diğer çalışmalar da bu görüşü desteklemektedir7,9,21,22.
Hallgren ve arkadaşları7, esp geni pozitifliğini E.faecium izolatlarında %71 (15/21), E.faecalis izolatlarında %73 (69/94) olarak bildirmişler; Jankoska ve arkadaşları23 da, ESP’nin E.faecalis suşlarında en sık (38/50; %76) saptanan virülans faktörü olduğunu ifa-de etmişlerdir. Çalışmamızda esp geni pozitifliği E.faecalis ve E.faecium suşlarında sırasıy-la %35.6 ve %6.5 osırasıy-larak tespit edilmiştir. E.faecalis izosırasıy-latsırasıy-larında saptadığımız oran, esp geni varlığını %26.5-60 arasında belirleyen çalışmalar8,9,24,25ile uyumlu iken; E.faecium izolatlarında bulduğumuz oran, esp geni varlığını %21-58 arasında bildiren diğer bazı çalışmalara8,9,24göre düşüktür. Ancak literatürde klinik E.faecium izolatlarında esp genini saptamayan bir çalışma12da mevcuttur. Sonuçta, gerek enfeksiyonlardan gerekse çevre-den ve sağlıklı insanların florasından izole edilen E.faecalis suşlarında esp geni varlığı, yay-gın görülen bir özellik olarak karşımıza çıkmaktadır6,9,21,22,24,26.
Çalışmamızda E.faecalis suşlarında saptadığımız %1.7’lik hyl gen pozitifliği oranına göre E.faecium suşlarında tespit ettiğimiz %38.7’lik yüksek oran dikkat çekmektedir. E.fa-ecium suşlarında hyl gen sıklığının Avrupa’da %3-71 oranları arasında değiştiği belirtil-mektedir3,16,26.
rast-lanmadığı belirtilmektedir7,22. Çalışmamızda E.faecalis suşlarında saptadığımız %16.9’luk hemolizin üretimi, diğer çalışmalarda9,22,27 elde edilen veriler ile (%11-33) uyumludur. E.faecium izolatlarımızın hiçbirisinde hemolizin üretiminin tespit edilmemiş olması da, di-ğer çalışmalar7,9,22ile benzerlik göstermektedir. Çoğu sitolitik suş, aynı zamanda AF de üretmektedir; dolayısıyla büyük olasılıkla bu iki virülans faktörü, sinerjik olarak davran-maktadır2. E.faecalis izolatlarımızdaki asa1 geni pozitifliği %40.7 bulunurken, hemolizin üretimi bulunan 10 E.faecalis izolatımızın dokuzunun asa1 geni içermesi (%90), bu gö-rüşü destekler niteliktedir.
Kommensal E.faecium suşları ile kıyaslandığında klinik izolatlarda gelE gen pozitifliği-nin belirgin olarak daha sık saptandığını bildiren çalışmaların6,25yanı sıra, sebze kaynak-lı E.faecium izolatlarının %45.5’inde, su kaynakkaynak-lı izolatların %33.3’ünde gelE geninin bu-lunduğunu, klinik örneklerden izole edilen izolatların ise hiçbirisinde gelE geni saptanma-dığını ileri süren bir çalışma22da bulunmaktadır. Bir çalışmada3ise, gelE geninin 12 E.fa-ecalis endokardit suşunun tamamında (%100), 19 dışkı suşunun ise ancak 10’unda (%52.6) saptanmış olması, virülans ve hastalıkta jelatinazın önemini göstermekte ve bi-yofilm oluşumunda etkin olabileceğini düşündürmektedir. Klibi ve arkadaşları9, jelatinaz aktivitesini E.faecalis izolatlarının %65 (22/36)’inde saptarken, 12 E.faecium izolatının hiçbirisinde tespit edememişlerdir. Çalışmamızda E.faecalis izolatlarında saptanan %22’lik jelatinaz aktivitesinin E.faecium izolatlarında düşük olması (%3.2), diğer çalışma-lardaki8,9,14,16,17,21veriler ile uyumludur.
AF ve ESP gibi virülans faktörlerinin, konjugasyon sırasında verici ve alıcı bakteriler ara-sında virülans ve antibiyotik direnç genlerini içeren konjugatif plazmidlerin transferini kolaylaştırdıkları düşünülmekte, esp ve asa1 gen pozitifliği ile plazmidlerle kazanılan an-timikrobiyal direnç arasındaki bir ilişkiden kuşkulanılmaktadır3,7,9,10,13-15. Sekiz Avrupa ül-kesindeki 13 farklı hastanede yatan hastaların çeşitli klinik örneklerinden izole edilen 135’i vankomisine dirençli toplam 271 E.faecium izolatı ile yapılan bir çalışmada, multip-leks PCR yöntemi ile esp pozitifliği %65, hyl pozitifliği ise %17 oranında saptanmış; asa1, gelE ve cylA genleri tespit edilememiştir3. Söz konusu çalışmada, esp gen pozitifliği ile vankomisin direnci (duyarlı suşların %53’ünde, dirençli suşların %77’sinde) arasında an-lamlı bir ilişkinin bulunduğu belirlenmiştir3. Klibi ve arkadaşları9, esp gen pozitifliği ile gentamisin direnci arasında; Billström ve arkadaşları14da esp gen pozitifliği ile ampisilin, siprofloksasin ve imipenem direnci arasında bir ilişkiden bahsetmişler, Vergis ve arkadaş-ları13ise jelatinaz aktivitesi ile yüksek düzey gentamisin direnci arasında anlamlı bir ilişki tespit etmişlerdir.
İtalya ve İngiltere izolatlarından farklı olarak VS suşlarda (sırasıyla %48 ve %18), VR suş-lara göre (sırasıyla %18 ve %9) daha yüksek bulunduğu açıklanmıştır. Literatürde VS E.faecium suşlarının dirençli suşlardan daha fazla esp geni içerdiğini vurgulayan başka ça-lışmalar8,28,29olduğu gibi, eşit düzeyde bulunduğunu ileri süren çalışmalar da26,30 mev-cuttur.
Bazı çalışmalarda esp ve hyl gen sıklığının, hem ampisilin hem de vankomisine direnç-li (AR-VR) E.faecium suşlarında, ampisidirenç-line duyarlı vankomisine dirençdirenç-li (AS-VR) suşlardan daha fazla görüldüğü vurgulanmıştır3,28,29. Vankerckhoven ve arkadaşları3, esp gen pozi-tifliğini AS-VR suşların %42’sinde, AR-VR suşların ise %85’inde (p< 0.05) tespit etmişler-dir. Aynı çalışmada3hyl gen pozitifliği, AS-VR suşların %2’sinde ve AR-VR suşların %15’in-de (p< 0.05) saptanmıştır. Çalışmamızda izole edilen vankomisine dirençli sekiz E.faeci-um suşunun tamamı ampisiline dirençli bulunduğundan bu özellik incelenememiştir. Bulgularımız, asa1 geni pozitif E.faecalis izolatlarının siprofloksasin (p= 0.001), norflok-sasin (p= 0.006) ve levofloknorflok-sasine (p= 0.001); esp geni pozitif E.faecalis izolatlarının dok-sisikline (p= 0.043); hyl geni pozitif E.faecium izolatlarının ise nitrofurantoine (p= 0.011), söz konusu genleri taşımayan izolatlara göre anlamlı düzeyde daha dirençli olduklarını ortaya koymuştur. Çalışmamız kapsamında yer alan enterokok suşlarının, diğer antibiyo-tiklere dirençlilik durumları ile içerdikleri virülans faktörleri arasında istatistiksel bir ilişki (p> 0.05) tespit edilememiştir.
Sonuç olarak, virülans faktörlerinin yaygınlığı ve antibiyotik direnci ile ilişkilerinin, ça-lışılan örneklerin kaynağına (klinik, fekal veya çevresel), enterokokların tür dağılımına ve çalışmanın yapıldığı ülkelere göre değişkenlik gösterdiği anlaşılmaktadır3,9,13,14. Bu çalış-ma, araştırmalarımıza göre üriner enterokok izolatlarının antibiyotiklere direnç durumla-rı ile virülans faktörleri arasındaki ilişkisinin incelendiği ülkemizdeki hasta kaynaklı ilk ça-lışmadır. Enterokok türlerinin nozokomiyal patojen olarak artan önemi ve özellikle gliko-peptidler olmak üzere antibiyotiklere direncin artan sıklığı göz önüne alındığında, ente-rokokların invazifliği ve hastalığın şiddeti ile ilişkili virülans faktörlerin tanımlanması ve bu virülans faktörlerinin antibiyotiklerle ilişkilerinin ortaya konması, gelecek araştırmaların önemli konusu olacaktır.
KAYNAKLAR
1. Seno Y, Kariyama R, Mitsuhata R, Monden K, Kumon H. Clinical implications of biofilm formation by
Ente-rococcus faecalis in the urinary tract. Acta Med Okayama 2005; 59(3): 79-87.
2. Sood S, Malhotra M, Das BK, Kapil A. Enterococcal infections & antimicrobial resistance. Indian J Med Res 2008; 128(2): 111-21.
3. Vankerckhoven V, Van Autgaerden T, Vael C, et al. Development of a multiplex PCR for the detection of
asa1, gelE, cylA, esp, and hyl genes in enterococci and survey for virulence determinants among European
hospital isolates of Enterococcus faecium. J Clin Microbiol 2004; 42(10): 4473-9.
4. Vankerckhoven V, Huys G, Vancanneyt M, et al. Genotypic diversity, antimicrobial resistance, and virulen-ce factors of human isolates and probiotic cultures constituting two intraspecific groups of Enterococcus
fa-ecium isolates. Appl Environ Microbiol 2008; 74(14): 4247-55.
6. Creti R, Imperi M, Bertuccini L, et al. Survey for virulence determinants among Enterococcus faecalis isola-ted from different sources. J Med Microbiol 2004; 53(1): 13-20.
7. Hallgren A, Claesson C, Saeedi B, Monstein HJ, Hanberger H, Nilsson LE. Molecular detection of aggrega-tion substance, enterococcal surface protein, and cytolysin genes and in vitro adhesion to urinary catheters of Enterococcus faecalis and E.faecium of clinical origin. Int J Med Microbiol 2009; 299(5): 323-32. 8. Dupre I, Zanetti S, Schito AM, Fadda G, Sechi LA. Incidence of virulence determinants in clinical Enterococcus
faecium and Enterococcus faecalis isolates collected in Sardinia (Italy). J Med Microbiol 2003; 52(6): 491-8.
9. Klibi N, Ben Slama K, Saenz Y, et al. Detection of virulence factors in high-level gentamicin-resistant
Enterococ-cus faecalis and EnterococEnterococ-cus faecium isolates from a Tunisian hospital. Can J Microbiol 2007; 53(3): 372-9.
10. Fisher K, Phillips C. The ecology, epidemiology and virulence of Enterococcus. Microbiology 2009; 155(6): 1749-57.
11. Ozmen Toğay S, Celebi Keskin A, Açık L, Temiz A. Virulence genes, antibiotic resistance and plasmid profi-les of Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium from naturally fermented Turkish foods. J Appl Micro-biol 2010; 109(3): 1084-92.
12. Shankar V, Baghdayan AS, Huycke MM, Lindahl G, Gilmore MS. Infection-derived Enterococcus faecalis stra-ins are enriched in esp, a gene encoding a novel surface protein. Infect Immun 1999; 67(1): 193-200. 13. Vergis EN, Shankar N, Chow JW, et al. Association between the presence of enterococcal virulence factors
gelatinase, hemolysin, and enterococcal surface protein and mortality among patients with bacteremia due to Enterococcus faecalis. Clin Infect Dis 2002; 35(5): 570-5.
14. Billström H, Lund B, Sullivan A, Nord CE. Virulence and antimicrobial resistance in clinical Enterococcus
fa-ecium. Int J Antimicrob Agents 2008; 32(5): 374-7.
15. Shankar N, Lockatell CV, Baghdayan AS, Drachenberg C, Gilmore MS, Johnson DE. Role of Enterococcus
fa-ecalis surface protein Esp in the pathogenesis of ascending urinary tract infection. Infect Immun 2001;
69(7): 4366-72.
16. Worth LJ, Slavin MA, Vankerckhoven V, Goossens H, Grabsch EA, Thursky KA. Virulence determinants in van-comycin-resistant Enterococcus faecium vanB: clonal distribution, prevalence and significance of esp and hyl in Australian patients with haematological disorders. J Hosp Infect 2008; 68(2): 137-44.
17. Coque TM, Patterson JE, Steckelberg JM, Murray BE. Incidence of hemolysin, gelatinase, and aggregation substance among enterococci isolated from patients with endocarditis and other infections and from feces of hospitalized and community-based persons. J Infect Dis 1995; 171(5): 1223-9.
18. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. 18thInformational Supplement, 2009. CLSI Document M100-S19. CLSI, Wayne, PA.
19. Mato R, Almeida F, Pires R, Rodrigues P, Ferreira T, Santos-Sanches I. Assessment of high-level gentamicin and glycopeptide-resistant Enterococcus faecalis and E.faecium clonal structure in a Portuguese hospital over a 3-year period. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2009; 28(7): 855-9.
20. Guzman CA, Pruzzo C, Plate M, Guardati MC, Calegari L. Serum dependent expression of Enterococcus
fa-ecalis adhesins involved in the colonization of heart cells. Microb Pathog 1991; 11(6): 399-409.
21. Eaton TJ, Gasson MJ. Molecular screening of Enterococcus virulence determinants and potential for genetic exchange between food and medical isolates. Appl Environ Microbiol 2001; 67(4): 1628-35.
22. Abriouel H, Omar NB, Molinos AC, et al. Comparative analysis of genetic diversity and incidence of viru-lence factors and antibiotic resistance among enterococcal populations from raw fruit and vegetable foods, water and soil, and clinical samples. Int J Food Microbiol 2008; 123(1-2): 38-49.
23. Jankoska G, Trajkovska-Dokic E, Panovski N, Popovska-Jovanovska K, Petrovska M. Virulence factors and an-tibiotic resistance in Enterococcus faecalis isolated from urine samples. Prilozi 2008; 29(1): 57-66. 24. Di Rosa R, Creti R, Venditti M, et al. Relationship between biofilm formation, the enterococcal surface
pro-tein (Esp) and gelatinase in clinical isolates of Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium. FEMS Micro-biol Lett 2006; 256(1): 145-50.
26. Rice LB, Carias L, Rudin S, et al. A potential virulence gene, hylEfm, predominates in Enterococcus faecium of clinical origin. J Infect Dis 2003; 187(3): 508-12.
27. Huycke MM, Spiegel CA, Gilmore MS. Bacteremia caused by hemolytic, high-level gentamicin-resistant
En-terococcus faecalis. Antimicrob Agents Chemother 1991; 35(8): 1626-34.
28. Leavis HL, Willems RJ, Top J, et al. Epidemic and non-epidemic multidrug-resistant Enterococcus faecium. Emerg Infect Dis 2003; 9(9): 1108-15.
29. Coque TM, Willems R, Canton R, Del Campo R, Baquero F. High occurence of esp among ampicillin-resis-tant and vancomycin-susceptible Enterococcus faecium clones from hospitalized patients. J Antimicrob Che-mother 2002; 50(6): 1035-8.
