• Sonuç bulunamadı

Hastane İnfeksiyonları ve Mikrobiyoloji Laboratuvarı. Barış Otlu İnönü Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2022

Share "Hastane İnfeksiyonları ve Mikrobiyoloji Laboratuvarı. Barış Otlu İnönü Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı"

Copied!
83
0
0

Yükleniyor.... (view fulltext now)

Tam metin

(1)

Hastane İnfeksiyonları ve Mikrobiyoloji Laboratuvarı

Barış Otlu

İnönü Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı

(2)

“Hasta oluyordum ve sen hemen geldin Yanında yüz öğrenciyle, ah Simmakus Yüz soğuk el bana dokundu

Hiç ateşim yoktu, ah Simmakus, şimdi var”

Kurtuluş Töreci, Hastane İnfeksiyonlarının tarihçesi Hastane İnfeksiyonları Kirabı, 2003

3. Yüzyıl Roma Şiiri, Bir hastanın Dr. Simmakus’a seslenişi

Hastane İnfeksiyonları Tarihi

(3)

Hastane İnfeksiyonları Tarihi

• Hastane, hastane infeksiyonları ve mikrobiyolojik tanı kavramlarının birlikte geliştiği düşünülebilir.

18.yy’ da Hotel Dieu;

ampütasyonlardan ölüm oranı %60

salgın sırasında lohusalık hummasından ölüm oranı 19/20

Aygün G, Klinik Gelişim

(4)

Hastane İnfeksiyonları Tarihi

• 1840 Hastane İnfeksiyonlarının tespiti ve önlenmesi ile ilgili ilk bilimsel yaklaşım.

Ignaz Semmelweis

(5)

from Notes on Hospitals published in 1863

Hastane İnfeksiyonları Tarihi

(6)

• 1952

Hastane İnfeksiyonları Tarihi-Yoğun Bakımlar

(7)

Hastane İnfeksiyonları Tarihi-Yoğun Bakımlar

(8)

Yoğun Bakım ve Salgınlar

(9)

imipenem (MK0787)

PubMed’de son 35 yılda 200 den fazla Acinetobacter spp.

salgını yayın haline gelmiş !!!

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34

1980 1985 1990 1995 2000 2005 2010 2013

(10)

Hastane İnfeksiyonları ve Mikrobiyoloji Laboratuvarı

• İnfeksiyona neden olan etkenin belirlenmesi

• İzolatlar arasındaki klonal ilişkinin ve bulaş kaynağının araştırılması

₋ Etkenin hızla tespiti

₋ Antimikrobiyal duyarlılığın belirlenmesi

₋ Antibiyotik direnç genlerinin tespit edilmesi

₋ Virülans genlerinin belirlenmesi

₋ Hastane salgınlarının araştırılması

₋ Salgının kaynağının belirlenmesi

₋ Dirençli bakterilerin izlenmesi

₋ Re-aktivasyonun yeni bulaştan ayırt edilmesi

(11)

Enfeksiyon etkenin tespiti

• Etkenin hızla tespiti

(12)

PCR

Multiplex PCR

Nested PCR

Seminetested PCR

Broad Range PCR

Hot Start PCR

Touchdown PCR

Reverse Transcription PCR

Real-time PCR

Enfeksiyon etkenin tespiti

• Moleküler yöntemlerle etkenin tespiti

(13)

• Özgül saptama; sekans spesifik florojenik oligonükleotid problarla

• Özgül olmayan saptama; florojenik boyalarla

Enfeksiyon etkenin tespiti

• Moleküler yöntemlerle etkenin tespiti

(14)

• Real-time PCR cihazları laboratuvarlarda yerini aldılar.

Enfeksiyon etkenin tespiti

• Moleküler yöntemlerle etkenin tespiti

(15)

Enfeksiyon etkenin tespiti

• Moleküler yöntemlerle etkenin tespiti

(16)

Enfeksiyon etkenin tespiti

• Moleküler yöntemlerle etkenin tespiti

(17)

• Yüksek multipleks kapasiteye sahip cihazlar (Biofire, Filmarray)

Enfeksiyon etkenin tespiti

• Moleküler yöntemlerle etkenin tespiti

(18)

• Yüksek multipleks kapasiteye sahip cihazlar. Biofire, Filmarray

Enfeksiyon etkenin tespiti

• Moleküler yöntemlerle etkenin tespiti

(19)

Gr am negative bacter ia Gr am positive bacter ia Y east Antimicr obial r esistance genes Acinetobacter baumannii

Haemophilus influenzae Neisseria meningitidis Pseudomonas aeruginosa Enterobacter cloacae complex Escherichia coli

Klebsiella oxytoca Klebsiella pneumoniae Proteus spp.

Serratia marcescens

Enterococcus spp.

Listeria monocytogenes Staphylococcus spp.

Staphylococcus aureus Streptococcus spp.

Streptococcus agalactiae Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes

Candida albicans Candida glabrata Candida krusei Candida parapsilosis Candida tropicalis

· mecA - methicillin resistance gene

· vanA/B - vancomycin resistance gene

· KPC - carbapenem resistance gene

Enfeksiyon etkenin tespiti

• Moleküler yöntemlerle etkenin tespiti

(20)

average 14.5 hours Positive blood culture

• Ortalama kan kültür pozitiflik süresi: 14.5 saat

Enfeksiyon etkenin tespiti

• Moleküler yöntemlerle etkenin tespiti

(21)

 10 minutes

average 14.5 hours Positive blood culture

Gram stain result

• Gram boyama

Enfeksiyon etkenin tespiti

• Moleküler yöntemlerle etkenin tespiti

(22)

 10 minutes

average 14.5 hours

 18 hours Positive blood culture

Gram stain result

Solid agar icubation

Subkültür?

Saf kültür

• Kültür sonucu

Enfeksiyon etkenin tespiti

• Moleküler yöntemlerle etkenin tespiti

(23)

 10 minutes

average 14.5 hours

 18 hours Positive blood culture

Gram stain result

Solid agar icubation

 1-2 day Standart microbiology

Procedurs

• Kültür sonucu ve tanımlama

Enfeksiyon etkenin tespiti

• Moleküler yöntemlerle etkenin tespiti

(24)

• Kültür sonucu

Enfeksiyon etkenin tespiti

• Moleküler yöntemlerle etkenin tespiti

(25)

 10 minutes

average 14.5 hours

 18 hours Positive blood culture

Gram stain result

Solid agar icubation

Standart microbiology Procedurs avarage

6.5 hours Vitek 2 Compact

• Kültür sonucu

Enfeksiyon etkenin tespiti

• Moleküler yöntemlerle etkenin tespiti

(26)

 10 minutes

average 14.5 hours

 18 hours Positive blood culture

Gram stain result

Solid agar icubation

Standart microbiology Procedurs avarage

6.5 hours Vitek 2 Compact

 1-2 day

 5 minutes Vitek MS result

• Kültür sonucu

Enfeksiyon etkenin tespiti

• Moleküler yöntemlerle etkenin tespiti

(27)

 10 minutes

average 19.5 hours

 18 hours Positive blood culture

Gram stain result

Solid agar icubation

Standart microbiology Procedurs avarage

6.5 hours Vitek 2 Compact

 1-2 day 2 hours FilmArray result

• Kültür sonucu

Enfeksiyon etkenin tespiti

• Moleküler yöntemlerle etkenin tespiti

(28)

Enfeksiyon etkenin tespiti

• Moleküler yöntemlerle etkenin tespiti

(29)

 10 minutes

average 19.5 hours

 18 hours Positive blood culture

Gram stain result

Solid agar icubation

Standart microbiology Procedurs avarage

6.5 hours Vitek 2 Compact

 1-2 day blood

2 hours FilmArray result

The LightCyclerSeptiFast Test

Enfeksiyon etkenin tespiti

• Moleküler yöntemlerle etkenin tespiti

(30)

Enfeksiyon etkenin tespiti

• Moleküler yöntemlerle etkenin tespiti

(31)

Enfeksiyon etkenin tespiti

(32)

Enfeksiyon etkenin tespiti

(33)

• Genomik, biyoinformatik ve mikroelektronik alanında yaşanan hızlı gelişmelerin en göze çarpan sonuçları,

- Biyosensörlerdir ve

- DNA mikroçip teknolojileri

(34)

Acinetobacter spp.

Biyosensörler

(35)

Biyosensörler

(36)

• DNA mikroçip teknolojileri, çevresel ve

klinik örneklerden mikroorganizmaların tanısı için giderek artan oranda kullanılmaktadır.

Mikroskopi Kültür

Seroloji

PCR

Geleneksel Mikrobiyolojik Tanı Yöntemleri

DNA Mikroçip Teknolojileri

(37)

• PCR ile elde edilen floresanla işaretli amplikonların

çok sayıda farklı oligonükleotid prob içeren katı yüzeylerde, kendisine uyan probla hibridize olması temeline dayanmaktadır.

DNA Mikroçip Teknolojileri

(38)

Virochip 1500 virüse ait 36.000 prob içermektedir.

Figure 2. Steps in the Virochip assay. After amplification by random PCR, a smear of 200 - 1000 bp can be visualized by gel electrophoresis (A). (B) Three Virochip microarrays out of the 8 arrays / glass slide are shown, with a small region of one microarray blown-up in the inset on the bottom right corner. (C) Automated microarray viral analysis using E-Predict revealing the presence of influenza A virus in the clinical sample.

DNA Mikroçip Teknolojileri

(39)

• Toplam 157 prob kullanılarak Enterobacteriaceae ailesi üyeleri hem tür düzeyinde tanımlanmış hem de, önemli antimikrobiyallere karşı direnç genleri araştırılmıştır.

DNA Mikroçip Teknolojileri

(40)

Antibiyotik Direncini Tespit Etmek

• Antibiyotik direncini tespit etmek için genel olarak iki yaklaşım mevcuttur.

• Fenotipik yöntemler

(41)

• Antibiyotik direncini tespit etmek için genel olarak iki yaklaşım mevcuttur.

• Genotipik yöntemler

mecA

Antibiyotik Direncini Tespit Etmek

(42)

• Antibiyotik duyarlılığı ancak fenotipik yöntemlerle belirlenebilir !

Bakteri üremesi

duyarlı dirençli

mikroorganizma ile antibiyotik

karşılaştırılmadan duyarlılık sonucundan bahsedilemez

S. aureus Penisilin

Antibiyotik Direncini Tespit Etmek

(43)

Tek bir bakteri

• Fenotipik yöntemlerde üremenin/inhibisyonun gösterilmesi zaman alıcı.

16-18 saat

6-8 saat 8-10 saat 18-24 saat

• Yeni fikirler, yeni sistemler

Antibiyotik Direncini Tespit Etmek

(44)

• Fenotipik testlerdeki gelişmeler;

mikroorganizma üremesinin ya da üremenin inhibisyonunun hızla tespit edilmesi temeline dayanmaktadır.

• Kolorimetrik

• Biolüminesans

• Kemilüminesans

• Nefelometrik

• Spektrometrik cihazlar

• Zaman-atlamalı mikroskop

• Raman-spektrometresi

• Atomik güç mikroskobu

Antibiyotik Direncini Tespit Etmek

(45)

• Hücrelerin canlı kalarak çoğalabildikleri bir ortamda, belirli zamana aralıklarında çekim yapabilen mikroskoplar.

Antibiyotik Direncini Tespit Etmek

Zaman Atlamalı Mikroskobik Yöntemler

(46)

• Mikroorganzimalar üzerine antibiyotik etkisi 6 – 30 dakikada tespit edilebiliyor.

Antibiyotik Direncini Tespit Etmek

Zaman Atlamalı Mikroskobik Yöntemler

(47)

Zaman Atlamalı Mikroskobik Yöntemler

Antibiyotik Direncini Tespit Etmek

(48)

Floresans Mikroskobik Yöntemler

• Bacterial cytological profilling (BCP), bakterilerin morfolojik analizi ile antibiyotik duyarlılık

FM4-64 DAPI

Antibiyotik Direncini Tespit Etmek

(49)

• Bacterial cytological profiling, %100 doğrulukla 1-2 saat için metisilin

30 dakikada daptomisin direnci tespiti Florens Mikroskobik Yöntemler

Antibiyotik Direncini Tespit Etmek

(50)

• SYTOX, DAPI, WGA, FM-64 gibi floresan boyalar Optikal Difüzometri

Antibiyotik Direncini Tespit Etmek

(51)

• Parçacıkların difüzyon katsayılarını ölçmek için tasarlanmış bir sistemdir.

Optikal Difüzometri

Antibiyotik Direncini Tespit Etmek

(52)

• Optikal difüsometri ve bead-based immunoassays yöntemlerinin kombine edildiği yöntemde, P. aeruginosa’da gentamisin direnci iki saat içerisinde tespit edilebilmiştir.

Optikal Difüzometri

Antibiyotik Direncini Tespit Etmek

(53)

• Antikorun aktive edilmesinde EDC-NHS kimyasalları kullanılarak antikorun polystyrene matrikse bağlanması.

Amine-modified polystyrene particles

Optikal Difüzometri

Antibiyotik Direncini Tespit Etmek

(54)

Optikal Difüzometri

Boncuklar üzerinde yakalanmış P. aeruginosa.

(55)

Optikal Difüzometri

(56)

Optikal Difüzometri

(57)

Ticari sistem- Accelerate Diagnostics Pheno System

• Accelerate Diagnostics; direkt örnekten hızlı tanımlama ve duyarlılık

(58)

1 saat 8-48 saat

• Örnekteki bakteriyi saflaştırma ve çoğaltmak

Accelerate Diagnostics - Pheno System

(59)

• Bakteri hücrelerin örnek muayene maddesinden saflaştırılması için elektroforez ve filtreleme sistemi (elektrofiltrasyon).

Accelerate Diagnostics - Pheno System

(60)

1 saat 8-48 saat

• Mikroorganizmanın tanımlanması

Accelerate Diagnostics - Pheno System

(61)

• Multiplexed Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

FISH basmakları Enzim ile lizis

Hibridizasyon

Stringent Wash Otomatik resim

işleme

Otomatik veri analizi elektrokinetik

yoğunlaştırma Bakteri hücrelerinin

sabitlenmesi

Accelerate Diagnostics - Pheno System

(62)

Multiplexed Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Accelerate Diagnostics - Pheno System

(63)

4-5 saat 24-48 saat

• Antimikrobial duyarlılıklarının belirlenmesi

Accelerate Diagnostics - Pheno System

(64)

• Antimikrobial duyarlılık testi; zaman-atlamalı mikroskop ile üreme/inhibisyonun takibi

Accelerate Diagnostics - Pheno System

(65)

• Antimikrobial duyarlılık testi; zaman-atlamalı mikroskop ile üreme/inhibisyonun takibi

Accelerate Diagnostics - Pheno System

(66)

Accelerate Diagnostics - Pheno System

(67)

Ne ?

Nez ama n ?

Niçin?

Nasıl?

Moleküler

Epidemiyoloji

Moleküler Epidemiyoloji

(68)

Moleküler Epidemiyoloji

• Bugün için ise moleküler epidemiyoloji terimi;

genellikle “moleküler biyolojik yöntemlerle suş tiplendirme”

çalışmalarına verilen ortak bir isim gibi kullanılmaktadır.

(69)

Moleküler Epidemiyoloji

Moleküler epidemiyolojinin sınırlarını;

- etken mikroorganizmanın tespiti - bulaşma yollarının araştırılması

- virülanslarından sorumlu genlerin belirlenmesi ve - izolatlar arası klonal ilişkilerin araştırılmasını

kapsayan geniş bir yelpazede çizilmiştir.

(70)

• Hastane infeksiyonuna neden olan etkenlerin izini sürebilmek için;

1. izolatların moleküler karekterizasyonu yapılmalı ve

2. izolatlar arasındaki klonal ilişkiler genotiplendirme yöntemleriyle araştırılmalıdır.

Moleküler Epidemiyoloji

(71)

İzolatların Moleküler Karakterizasyonu

• İzole edilen mikroorganizmaların moleküler karakterizasyonu için;

• antimikrobiyal direnç genleri

• virülans genleri

• mobil genetik elemanları

 plazmid

 transpozon

 İntegron

• hücre duvar yapıları araştırılmalıdır.

(72)

İzolatlar Arasındaki Klonal İlişkilerin Araştırılması

PFGE

AP-PCR

MLST AFLP RFLP

RAPD

Dizi analizi

(73)

- Pulsed field gel electrophoresis (PFGE)

- PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) - Random amplified polymorphic DNA (RAPD)

- Arbitrarily primed polymerase chain reaction (AP-PCR) - Repetitive extragenic palindromic element-PCR (rep-PCR) - Amplified ribozomal DNA restriction analysis (ARDRA)

Moleküler epidemiyoloji için yöntemler

• Hastane infeksiyonları ile ilişkili mikroorganizmaların moleküler tiplendirilmesinde;

kromozomal DNA polimorfizmine dayalı olan yöntemler, hızlı ve güvenilir olmalarıyla ön plana çıkmaktadırlar.

Infect Genet Evol. 2010 Oct;10(7):866-75. Epub 2010 Aug 6.

(74)

• Sonuçların analizi ve yorumlanması

• Bu amaçla en çok kullanılan bilgisayar programları;

- Gel-Compar (Applied Maths, Kortfijk, Belgium) - Dendron (Solltech, Oakdale, Iowa)

- Diversity Database Fingerprinting Software (Bio-Rad) - Gene Profiler (Scanlytics, Fairfaz, Va)

- Phoretix 1-D (Nonlinear USA, Durham, N.C.)

- Quantar Pro (KeyGene Producrts, Wageningen, Netherlands) - Taxotron (Taxolab, Institut Pasteur, Paris, France)

Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)

(75)

Genotip P-VIII

-Suşlar anestezi-reanimasyon yoğun bakım ünitesinden, bir aylık bir dönemde, entübe hastaların trakeal

aspiratlarından izole edilmiştir.

• Sonuçların analizi ve

yorumlanması

Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)

(76)

Moleküler Epidemiyoloji Ne Zaman Kullanılmalı ?

• Her zaman

(77)

Moleküler Epidemiyoloji Ne Zaman Kullanılmalı ?

Yoğun bakım hastaları

kültürde üreme ve identifikasyon

Rep-PCR/AP-PCR ile tiplendirme ve izolatlarla karşılatırma

Komiteye bilgi ver ve ilişkiyi PFGE ile

doğrula Karbapenemaz aktivitesi

Direnç genlerini

OXA-48, NDM1, VIM, IMP, GES Mobil genetik elementler

Hastane infeksiyon kontrol komitesi

Hastane infeksiyonu

İzolatın moleküler karakterizayonu İzolatın genotiplendirilmesi

Kümeleşme yok

İzolatlar “ayrı” Kümeleşme var İzolatlar “benzer”

(78)

Moleküler Epidemiyoloji Ne Zaman Kullanılmalı ?

(79)

Eldeki tüm imkanlar kullanılmalı

(80)

Eldeki tüm imkanlar kullanılmalı

• Yeni Nesil Dizileme Sistemleri

(81)

Eldeki tüm imkanlar kullanılmalı

(82)

Eldeki tüm imkanlar kullanılmalı

(83)

• Hastane infeksiyon kontrol komitesine anlık bilgi verdik ve haftalık toplantılarına katıldık.

• Yoğun bakımlarda salgınlardan etkilenen hasta sayısı artmadan müdahale edilmesine katkıda bulunduk.

• Hastane infeksiyon kontrol komitesinin elini güçlendirdik.

Moleküler Epidemiyoloji Ne Zaman Kullanılmalı ?

Referanslar

Benzer Belgeler

** E ğitim veren kamuya ait sağlık kurum/kuruluşlarının adresi içindeki yeri/konumu farklı olan, aynı uzmanlık dalında birden fazla tıbbi laboratuvar bulunması

 preparatta PMNL ve gram negatif basiller görülmüş; kültür için aşağıdaki besiyeri.. seçeneklerinden hangisini

Çalışmamızda, çiğ süt için en yüksek aerobik mezofilik bakteri sayısı ve koliform grubu bak- teri sayıları sırasıyla 5,5x10⁴ kob/ml ve 1,5x103 kob/ml

albicans suşlarında standart suşa ve duyarlılara göre CDR1 ve CDR2 genlerinin fazla eksprese edildiği, MDR1 geninin ise bir suşta çok fazla olmak üzere üç suşta yüksek

Amaç: Bu çalışmada, sağlık çalışanlarının burunlarında metisilin dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) ve koagülaz negatif stafilokok taşıyıcılık oranı ve bu

MRSA izolatlarının mupirosin duyarlılıkları, 5 µg’lık mupirosin diski kullanılarak, Kirby-Bauer disk difüzyon yöntemi ile araştırıldı ve inhibisyon zon

antikorları, iğsi cisim iplikleri [spindle fibre] antikorları, orta cisim [mid-body] antikorları, anti-CENP-F proteini antikorları).. • HEp-20-10 hücre hattı: mitotik aktivitesi

Hastane Salgınlarının Önlenmesinde Moleküler Epidemiyolojik Yaklaşım... “Hasta oluyordum ve sen hemen geldin Yanında yüz öğrenciyle, ah Simmakus Yüz soğuk el