Biyoteknoloji ve Genetik I Hafta 9
Prokaryotlarda Gen İfadesinin Düzenlenmesi
Prof. Dr. Hilal Özdağ
A.Ü Biyoteknoloji Enstitüsü Merkez Laboratuvarı Tel: 2225826/125
Eposta: hilalozdag@gmail.com
Gen İfadesi
DNA
RNA
PROTEİN
Transkripsiyon
Translasyon
Prokaryotik Hücre
Nükleoid Bölge
Ribozom Besin Granülü Flagellum
Plazmid DNA
Sitoplazma
Plazma membranıHücre duvarı
Kapsül
Gen İfadesi
• 20. yy’ın başından beri organizmaların metabolizmalarının nasıl düzenlediğine dair araştırmalar sürmektedir.
• Sınırlı bilgi ve teknolojinin varlığında başlayan bu araştırmalarda bakteriler en baştan beri (ve bugüne kadar) en iyi model organizmalar olmuştur.
• Gen ifadesine dair veriler öncelikle biyokimyasal
analizlerden elde edilmiştir.
Gen İfadesi
• 1900’lerin başında bakterilerin ortamda laktoz varken gerekli enzimleri sentezlediğini, ortamda laktoz yokken bu enzimlerin sentezlenmediği tespit edilmiş ve bu durum adaptif (fakültatif) enzim kavramını ortaya çıkarmıştır.
• Bu enzimlere daha sonraları durumu daha iyi açıkladığı düşünülen indüklenebilir enzimler denmiştir.
• Sürekli sentezlenen enzimlere ise konstitütif
denmektedir.
Gen İfadesi
• Araştırmalar en önemli sonuçlarını 1946’da Jacques Monod’nun çalışmaları ile vermeye başlıyor.
• Ardından Joshua Lederberg, François Jacob ve Andre L’woff’un katkıları sürecin deşifre edilmesinde önemli rol oynuyor.
• Bu araştırmalarla şekillenen operon modelinde
aynı süreçte beraber çalışan çalışan enzimleri
kodlayan genler (poli sistronik) kümeler halinde
organize olur.
Gen İfadesi
• Bu genler tek bir düzenleyici birim tarafından koordine edilir.
• Bu düzenleyici bölge düzenledikleri genlerin üst kısımlarında yer alır (cis-acting bölge).
• Bu bölgenin regülatör işlevi bu bölgeye bağlanan
moleküllerin etkisi (trans-acting elements) ile
devreye girer.
Operon
www.nature.com
Operon
Operon
Gen İfadesi
• 1900’lerin başında bakterilerin ortamda laktoz varken gerekli enzimleri sentezlediğini, ortamda laktoz yokken bu enzimlerin sentezlenmediği tespit edilmiş ve bu durum adaptif (fakültatif) enzim kavramını ortaya çıkarmıştır.
• Bu enzimlere daha sonraları durumu daha iyi açıkladığı düşünülen indüklenebilir enzimler denmiştir.
• Sürekli sentezlenen enzimlere ise konstitütif
denmektedir.
PCR ve DNA Dizi Analiz Öncesi Dönemde Araştırma Yaklaşımları
• Biyokimyasal bulgular
• Haritalama çalışmaları
• Mutant suşların oluşturulması ve fonksiyonel sonuçların irdelenmesi
• Sahte uyarıcıların bulunuşu (laktozun kükürtlü
analoğu izopropiltiyogalaktozit_IPTG) ile
substrat olmaksızın uyarılma mekanizmasının
çalışılmasını sağlamıştır.
PCR ve DNA Dizi Analiz Öncesi Dönemde Araştırma Yaklaşımları
• Regülatör bölgeler tanımlanırken yine mutantlardan ve haritalamadan yararlanılmıştır.
• Laktoz ortamda olmasa da enzimlerin sentezlenmesine yol açan mutasyonların bulunduğu bölgelerin (lacI
-) yapısal genlerin yakınında ancak farklı bir bölgede olduğu tanımlanmıştır.
• lacI geni baskılayıcı gen olarak adlandırılır.
PCR ve DNA Dizi Analiz Öncesi Dönemde Araştırma Yaklaşımları
• Benzer etki gösteren diğer konstitütif mutasyonların yine yapısal genlerin hemen yakınındaki operatör bölgede yer aldığı tespit edilmiştir (lacO
c).
• E. coli hücresinde 10 kopyadan fazla bulunmayan baskılayıcı molekülün izolasyonu kolay olmamıştır. 1966’da Gilbert ve Müller-Hill bu molekülü kısmen saflaştırmış ve dansite gradient çalışması ile DNA’ya bağlandığını da göstermişlerdir.
• 1996 yılında Lewis, Lu ve ark, baskılayıcı komplekslerin
kristal yapılarını açıklayarak operon modelini yapısal
olarak doğrulamışlardır.
Lac Operonu
wikimedia.org
Yüksek ve konstitütif ifade
Düşük glukoz Laktoz +
Yüksek glukoz Laktoz - Düşük glukoz Laktoz - Yüksek glukoz Laktoz +
Düşük bazal seviyede ifade
Lac Operonu
www.nature.com
Klonlamada Pratik Bir Belirteç
Mavi Beyaz Seçimi
Klonlamada Pratik Bir Belirteç Mavi Beyaz Seçimi
TA Klonlama
lacZ geni içinde çoklu klonlama bölgesi ve antibiyotik direnç geni içeren plazmid
PCR Ürünü
Plazmidin ligasyon sonrası bakteri hücresine transformasyonu
+
Triptofan Operonu
Triptofan Operonu
http://pathmicro.med.sc.edu/mayer/genreg7.jpg
Triptofan Operonu
www.nature.com
