T.C
NAMIK KEMAL ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ KOORDİNASYON BİRİMİ (NKÜBAP)
BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ SONUÇ RAPORU
NKUBAP.00.20.AR.12.02 nolu proje
UTERİN MYOMLARDA IL-1 VE IL-6 mRNA EKSPRESYON DÜZEYLERİ
Yürütücü: Doç. Dr. Cem Çelik
2014
2
ÖNSÖZ
Uterin myomlar jinekolojide rastlanılan en sık sağlık problemlerinden biridir. Üreme çağındaki bayanların yaklaşık olarak % 20-50’inde uterin myom gelişmektedir. Amerika Birleşik Devletlerinde yılda yaklaşık bu nedenle 600.000 histerektomi yapılmaktadır.
Çalışmamızda ilk kez myoma uteri tanısı alan hastalarda uterus myomlarında IL-1 ve IL-6 mRNA düzeylerinin saptanması amaçlandı.
Çalışmamız Namık Kemal Üniversitesi Tıp Fakültesi Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı ve İstanbul Teknik Ünivesitesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı Laboratuvarında yapılmıştır. NKUBAP.00.20.AR.12.02 no’lu ‘ Uterin myomlarda IL-1 ve IL- 6 mRNA ekspresyon düzeyleri’ adlı proje Namık Kemal Üniversitesi Bilimsel Araştırma Proje Birimi tarafından desteklenmiştir. Çalışmamızı bilimsel araştırma projesi olarak kabul edip destekleyen Namık Kemal Üniversitesi Rektörlüğü’ne içten teşekkürlerimizi sunarız.
3
İÇİNDEKİLER
TABLO LİSTESİ……… 4
ÖZET... 5
ABSTRACT... 6
GİRİŞ... 7
GEREÇ VE YÖNTEM... 7
BULGULAR VE TARTIŞMA ... 8
SONUÇ ………... 9
KAYNAKLAR... 13
4
TABLO LİSTESİ
Tablo 1. RNA miktarı
Şekil 1. Agaroz jel elektroforezi ( IL-6 ve IL-6R).
Şekil 2. Agaroz jel elektroforezi (IL-1b ve IL-1bR).
5 ÖZET
Amaç: Uterus myomları üreme çağındaki bayanlarda rastlanılan en sık iyi huylu jinekolojik tümördür. Çoğunlukla myometriumdan kaynaklanmaktadırlar. Interlökin 6 (IL-6) proenflamatuar bir sitokin olup IL-6 geni tarafından kodlanmaktadır. Farklı hücreler interlökin sentezleyebilmektedir. örn. Endotel, makrofaj ve tümör hücreleri. Bu çalışmanın amacı normal ve myomlu uterus dokudan IL-6 ve IL-1b ekspresyonları ortaya koymak ve karşılaştırmaktır.
Materyal Metod: Çalışma Namık Kemal ve İstanbul Teknik Üniversitesinde gerçekleştirilmiştir. Myom ve endometriyal doku örnekleri oniki farklı hastalardan alınmış olup RNA later ile saklanmıştır. RNA ambition kiti ile izolasyon yapılmıştır. IL-6 ve IL-1b ekspresyonları karşılaştırılmıştır.
Sonuçlar: Jel görüntülerinde IL-6 ekspresyon düzeylerinin myomlu dokuda normal dokuya göre daha yüksek olduğu gözlenmiştir. Buna rağmen IL-1b ve IL-6 seviyerinde fark gözlenmemiştir. Buna rağmen IL-1b ve IL-6 ekspresyonlarında anlamlı bir fark izlenmemiştir.
Tartışma: Bu çalışmanın sonucu üreme çağındaki bayanlarda üterim myom tedavisi için yeni tedavi alternatifleri olabileceğini ortaya koymuştur.
Anahtar kelimeler: Interlökin, uterus myom, mRNA
6
ABSTRACT
Aim: Uterine leiomyoma, also called fibroids, are the most commonly seen benign neoplasms and are the major health problem of women. They originate from the myometrium.
Interleukin 6 (IL-6) is also a pro-inflammatory cytokine from interleukin family and encoded by IL-6 gene. Different cell types can secrete this interleukin including endothelium cells, macrophages, T cells and tumor cells. The aim of this study is to compare the expression levels of IL-6 and IL-1b, aslo their receptor levels, from isolated RNA between normal myometrium tissues and myoma tissues.
Materials and Method: This study conducted in Namık Kemal and İstanbul Technical University. Myoma and endometrium tissue samples which were obtained from twelve different patients were obtained fresh and kept in RNA Later (RL) . RNA from tissue was isolated with Ambion RNA kit. IL-6 and IL-1b expression levels were compared.
Results: In the gel images, it is observed that there is a difference in IL-6 expression levels due to tissue characteristics. IL-6 expression in myoma tissues are higher than control tissues of normal myometrium.. However, there are not seen any notable difference in IL-1b receptor and IL-6 receptor.
Conclusions: The conclusion of the study can be lead the research group to the foundation of new treatments of uterine leiomyoma disease in reproductive woman.
Key words: Interleukin, myoma uteri, mRNA
7 GİRİŞ
Uterus myomları üreme çağındaki bayanlarda rastlanılan en sık iyi huylu jinekolojik tümördür. Çoğunlukla myometriumdan kaynaklanmaktadırlar. [1] Myomlar bağ dokusu ve uterus düz kası içermektedirler.[2] Uterus myomlarının çok küçük bir oranı leimyosarkom ismi verilen habis olan forma dönüşmektedir. [3]
Interlökin 6 (IL-6) proenflamatuar bir sitokin olup IL-6 geni tarafından kodlanmaktadır.
Farklı hücreler interlökin sentezleyebilmektedir örn. Endotel, makrofaj ve tümör hücreleri.
Makrofaj ve T hücreleri IL-6’nın asıl kaynağı olup bağışıklık yanıtının oluşmasında rol almaktadırlar. İnterlökin ve uterus myomları arasında ilişki bazı çalışmalarda ortaya konulmuştur. Fakat bu ilişkinin genetik ve immünolojik altyapısı hala net olarak ortaya konulmamıştır. [4-8]
Bu ilişkinin ortaya konulması için öncelikle bazı özel sitokinlerin düzeyleri belirlenmelidir.
Daha sonra çalışmalar ile IL’lerin karakterizasyonu, belirlenmeleri için yöntemler ve uterus myomları için yeni tedavi modaliteleri ortaya konulabilir.
Bu çalışmanın amacı normal ve uterus myomlu dokudan IL-6 ve IL-1b ekspresyonları ortaya koymak ve karşılaştırmaktır.
GEREÇ VE YÖNTEM
Bu çalışmaya, Namık Kemal Üniversitesi Tıp Fakültesi Sağlık Uygulama ve Araştırma Hastanesi Kadın Hastalıkları ve Doğum poliklinğine başvuran ve ilk kez myoma uteri tanısı alan oniki bayan dahil edildi.
Uterin myom tanısı öykü ve fizik muayene özelliklerine göre klinik olarak konuldu.
Histopatolojik tanı operasyon sırasında alınan patolojik spesmen ile doğrulandı. Kontrol grubu uterin myom tanısı dışında histerektomi endikasyonu almış ve operasyon sırasında myometrium örneklemesi yapılmış bayanlardan oluşturuldu.
8
RL9, RL11, RL12 myom tanısı konulmuş aynı hastadan alındı. RL9, 11 myom dokusundan , RL12 normal uterin dokudan alınmıştır. RNA izolasyonu için Ambion RNA Isolasyon Kiti kullanılmıştır.
cDNA Sentezi
Uygulanan biyosistemler;
10XRTRandom Primerler
5X Transcription Reverse Transcriptase Reaction Buffer
Protector RNase Inhibitor, 40 U/µl
Deoxynucleotide Mix, 10 mM each
Transcription Reverse Transcriptase, 20 U/µl
PCR Assay
Geneon and iStar Taq tarafından sağlanmıştır;
10X PCR Buffer
2.5 mM dNTP
MgCl2
Taq Polymerase
Forward/ Reverse Primers (Sacem)
ddH2O Jel Electroforezi
Agaroz (Lonza) kullanılmıştır
RNA izolasyonu
Normal myometrium ve Uterin myom dokusu sağlandıktan sonra RNA later içerisinde saklanmış olup dokudan RNA izolasyonu için Ambion RNA kit kullanılmıştır.
.
9
BULGULAR 3.1 RNA Isolation
Çalışmanın amacı IL düzeylerinin ve reseptör ekspresyonlarının karşılaştırılmasıdır. Bu nedenle biz öncelikle cDNA sentezi için RNA isolasyonu gerçekleştirdik. İzolasyon sonrasında nanodrop kullanılarak konsantrasyonlar belirlenmiştir. (Tablo 1)
Jel Electroforezi
cDNA sentezinden sonra cDNA yapıda görev alan genler tarafından PCR ile kontrol edildi.
Yapı geni GAPDH ‘di. cDNA GAPDH primerleri için kontrol edildikten sonra spesifik bazı IL primerleri kullanılarak ekspresyon seviyeleri belirlenmiştir. Jel görüntülerinde IL-6 ekspresyon düzeylerinin myomlu dokuda normal dokuya göre daha yüksek olduğu gözlenmiştir. Buna rağmen IL-1b ve IL-6 seviyerinde fark gözlenmemiştir. (Şekil 1, 2)
TARTIŞMA
Biz bu çalışmada proenflamatuvar sitokin IL-6’ nın normal ve myomlu uterus dokusunda farklı seviyelerde eksprese edildiğini gösterdik. Bu spesifik olarak IL-6 için dizayn edilmiş primerler aracılığıyla PCR ile gösterilmiştir. Jel elektroforez sonuçları myom dokusunda IL-6 ekspresyonun kontrol ile karşılaştırıldığında daha yüksek olduğunu saptadık. IL-6 bir proenflamatuvar interlökin olup myom dokusundada ekspresyonun daha yüksek olacağını tahmin ettik. Miura ve arkadaşlarının daha öncede belirttiği gibi zarar geren gören dokuda makrofajların sayısının artması nedeniyle IL-6 seviyelerininde normal dokuya oranla myom dokusunda daha fazla eksprese olması açıklanabilmektedir. [8-12]
Çalışmamızda IL-6 ve IL-1 reseptör seviyelerinin jel elektroferezinde benzer seviyelerde olduğuna rastladık. Myometrium düz kas hücreleri içermektedir ve leiomyomlarda bu myometrium dokusundan gelişmektedir. Bu nedenle reseptörlerin myometriumda eksprese edilmesi uterin myomlardada rastlanmasına neden olmaktadır. Buna rağmen IL-1b seviyelerinde myom ve kontrol grubu arasında bir fark izlenmemiştir.
10
Çalışmanın kısıtlayıcı faktörü RNA izolasyonu için etkin bir homojenizatörün olmamasıdır.
Sonuç olarak bazı örneklerde yeterli RNA miktarı elde edilememeiş olup cDNA sentezi yapılamamıştır.
SONUÇ
Bu çalışma interlökin lokalizasyonu ve uterin myom patogenezinin açıklanması için gelecek çalışmalara ışık tutmakta olup gelecek çalışmalar Real Time PCR ile gerçekleştirilmesi gerekliliğini ortaya koymuştur. Bu çalışma özellikle üreme çağındaki bayanlarda rastlanılan uterin myomlarda yeni tedavi modaliteleri gerçekleştirilebileceği sonucunu çıkarmıştır.
KAYNAKLAR
1. Wallach EE, Vlahos NF (2004)Uterine Myomas: An Overview of Development,Clinical Features, and Management. Gynecology and Obstetrics, 104(2):393-406
2. Flake, G., Andersen, J., Dixon, D. (2003) Etiology and Pathogenesis of Uterine Leiomyomas: A Review. Environmental Health Perspective.111(8): 1037–1054.
3. Litovkin K.V. et al. (2008) MICROARRAY STUDY OF GENE EXPRESSION IN UTERINE LEIOMYOMA. Experimental Oncology. 30(2):106-11
4. Miura S., et al (2006) Differential infiltration of macrophages and prostaglandin production by different uterine leiomyomas. Human Reproduction. Volume 21, Issue 10 Pp. 2545-2554.
5. Pietrowski D., et al (2009) Uterine Leiomyoma is Associated with a Polymorphism in the Interleukin 1-b Gene. American Journal of Reproductive Immunology. Volume 62, Issue 2, pages 112–117.
6. Retrieved from http://www.alternativesurgery.com/education/fibroid-tumors/ website on 1 May, 2012.
11
7. Grings AO, Lora V, Ferreira GD, Brum IS, Corleta Hv, Capp E. (2012) Protein Expression of Estrogen Receptors α and β and Aromatase in Myometrium and Uterine Leiomyoma. Gynecologic and obstetric investigation. 73(2):113-7
8. Peddada S. D., Laughlin S. K. et al( 2008) Growth of uterine leiomyomata among premenopausal black and white women. The National Academy of Sciences of the USA. 105(50): 19887–19892.
9. Ishikawa H, Ishi K et al (2010) Progesterone Is Essential for Maintenance and Growth of Uterine Leiomyoma. Endocrinology. 151(6): 2433–2442.
10. Fuchs-Young R, Howe S, Hale L, Miles R, Walker C (1996) Inhibition of estrogen- stimulated growth of uterine leiomyomas by selective estrogen receptor modulators.
Molecular Carcinogenesis. 17(3):151-9
11. Matsuoka, R. Et al (2002). Regulation of estrogen activity in human endometrium:
Effect of IL-1_ on steroid sulfatase activity in human endometrial stromal cells.
Steroids. 655–659
12. Akdis, M. (2011) Interleukins, from 1 to 37, and interferon-g: Receptors,functions, and roles in diseases. J Allergy Clin Immunol 2011;127:701-21.
Tablo 1. RNA Miktarları
Örnek Myom/kontrol RNA miktarı saflık (260/280)
S1 myoma 65.5 ng / μL 2,13
RL2a control 174.5 ng / μL 2,12
RL9 myoma 131.14 ng / μL 2,06
RL11 myoma 173.3 ng / μL 2,03
RL12 control 285 ng / μL 2,05
12
IL-6(S1,RL2a,RL9,RL11,RL12,negative control) IL-6R (6R,RL2a,RL9,RL11,RL12,negative control)
200 bp 100 bp
Şekil 1. Agaroz jel electrophorezi( IL-6 and IL-6R).
IL-1b(S1,RL2a,RL9,RL11,RL12,negative control) IL-1bR (S1,RL2a,RL9,RL11,RL12,negative control)
200 bp 100 bp
Şekil 2 Agaroz jel elektroforezi (IL-1b ve IL-1bR).
