NKUBAP.00.10.AR.15.05 nolu Proje
TÜRK TOPLUMUNDA PAPİLER TİROİD KANSERLERİNDE D-LOOP
MUTASYONLARININ İNCELENMESİ
Proje Yürütücüsü: Doç. Dr. Rıfat Bircan
2016
i ÖZET
Mitokondriyal DNA (mtDNA) kusurlarının kanser dâhil birçok hastalıkla ilişkili olduğu literatürde yer almaktadır. Buna ilişkin olarak, serviks, meme, gastrik, kolorektal, akciğer ve renal kanserlerde mitokondriyal DNA D-loop bölgesindeki değişimlerin sıklıkla gözlemlendiği bildirilmiş ve özellikle, D-loop bölgesinde yer alan D310 bölgesi olarak adlandırılan polisitozin dizisinin elektrofilik ve oksidatif hasara daha yatkın olduğu öne sürülmüştür. Sunulan bu projenin amacı, Türk toplumunda, papiller tiroid karsinomlarında (PTK) mitokondriyal genom üzerinde yer alan D-loop instabilitesine bakılarak, mtDNA mutasyon birikiminin malign tiroid nodüllerindeki prevalansının tespit edilmesi ve bir önceki projede elde edilen benign tiroid nodüllerindeki bulgularla karşılaştırılarak tümörogenez gelişimde rolünün bulunup bulunmadığının araştırılmasıdır.
Çalışmaya 47 PTK olgusu alınmış olup, hastalara ait tümör ve çevre doku örneklerinde mtDNA D-loop bölgesinin tamamı (16024-576. nt) polimeraz zincir reaksiyonu (PZR ) ile çoğaltılmış ve Sanger metodu ile DNA dizi analizi gerçekleştirilmiştir. Benign tiroid nodüllerinden ve PTK olgularından elde edilen veriler, web tabanlı mitomaster biyoinformatik programı kullanılarak değerlendirilmiş ve istatistiksel analizler pearson ki-kare testi kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
Çalışmaya alınan PTK hastalarının %40’nda (27/47) somatik mutasyon, PTK ile ilişkili olarak 4 SNP (T152C, C295T, G16129A, C16192T) tespit edilmiştir.
Bununla beraber, D310 polisitozin dizisinde; C7 tekrarı frekansının Türk popülasyonunun yapılan çalışmaların aksine soğuk nodüller ve PTK örneklerinde arttığı bulunmuştur (p=0,005). Ayrıca, T16189C ve D514 CA dinükleotit tekrar dizilerinin yeraldığı MSI bölgelerinde somatik mutasyon oranının PTK örneklerinde arttığı(p=0,0001, p=0,027); D310 MSI bölgesinde ise somatik mutasyon frekansının sıcak nodüle sahip bireylerde artarken PTK hastalarında nispeten düşük kaldığı saptanmıştır(p=0,024).
Sonuç olarak, yapılan bu çalışma ile mtDNA D310 polisitozin insitabilitesinin papiller tiroid kanser gelişiminde, tümörogenezde rolü olmadığı, diagnostik veya prognostik belirteç olamayacağı belirlenmiştir. Bununla beraber, D514CA insitabilitesi tiroid tümörlerinde tümör progresyonu ile ilişkili olabileceği öngörülmektedir.
Anahtar kelimeler: Mitokondriyal DNA, D-Loop, Tiroid Nodülü, Papiller Tiroid Kanseri, Polimorfizm, Mutasyon
2016, 46 sayfa
ii ABSTRACT
It is currently present in the literature that mitochondrial DNA (mtDNA) defects are associated with a great number of diseases including cancer. With regard to this, one reports that alterations of mtDNA D-loop region are often observed in cervical, breast, gastric, lung and renal cancers, and suggests that in particular a polycytidine stretch termed D310 within D-loop region is more susceptible to electrophile and oxidant damage. The aim of this study is to determine the prevalance of mtDNA D- loop mutations and mt DNA D-loop insitability at papillary thyroid cancers (PTC) in Turkish population. Also it is aimed that to compare the findings with the previous study to clarify the role of mtDNA D-loop mutations in thyroid tumorogenesis.
For this purpose, 47 PTC cases enrolled the study and entire mtDNA D-loop region (16024-576. nt) was amplified at tumour and surrounding tissue samples.
DNA sequencing was performed by using Sanger methodology. The data obtained from benign and malign thyroid tissue samples were evaluated with web-based bioinformatics programme called mistomaster. Statistical analyses were applied by using Pearson chi square test.
mtDNA somatic mutations were detected in 40% (27/47) of PTC patients.
Also four single nucleotide polymorphism (SNP)(T152C, C295T, G16129A, C16192T) were associated with the occurance of PTC. By contrast with the previous studies on Turkish population, frequence of C7 repeats in D310 polycytosine sequence was found higher in cold thyroid nodules and PTC samples (p=0,005).
Beside this, the frequency of somatic mutations in MSI regions including T16189C and D514 CA dinucleotide repeats were found higher in PTC samples than the benign thyroid nodules (p=0,0001, p=0,027). Conversely, the frequency of somatic mutaions in D310 MSI was detected higher in hot thyroid nodules than cold thyroid nodules and PTK (p=0,024).
As a result, this study shows that mtDNA D310 insitability do not play a rol in tumorogenesis in PTC and it could not be used as a diagnostic or prognostic biomarker in tumorogenesis. But D514 CA insitability could be associated with tumour progression in thyroid.
Key words: Mitochondrial DNA, D-Loop, Thyroid Nodule, Papillary Thyroid Cancers, Polymorphism, Mutation
2016, 46 pages
iii İÇİNDEKİLER
Sayfa
ÖZET ... i
ABSTRACT ... ii
ÇİZELGE DİZİNİ ... iv
ŞEKİLLER DİZİNİ ... v
SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ... vi
1. GİRİŞ... 1
2. MATERYAL ve YÖNTEM ... 5
2.1. Materyal ... 5
2.1.1. Kullanılan cihazlar ... 5
2.1.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler ... 5
2.1.3. Kullanılan kitler ... 6
2.1.4. Kullanılan ticari çözelti ve tamponlar ... 6
2.1.5. Kullanılan çözeltiler ... 6
2.1.6.Primerler ... 7
2.1.7. Kullanılan bilgisayar programları ve web tabanlı programlar ... 8
2.1.8. Hasta grubu ... 8
2.2. Yöntem ... 9
2.2.2. Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ... 9
2.2.3. Agaroz jel elektroforezi ... 10
2.2.4. PZR ürünlerinin saflaştırılması ... 10
2.2.5. DNA dizileme reaksiyonu ... 10
2.2.6. DNA dizi analizi örneklerinin çöktürülmesi (etanol presipitasyonu) ... 11
2.2.7. Kapiller elektroforez için örneklerin cihaza yüklenmesi ... 11
2.2.8. DNA dizi analizi sonuçlarının değerlendirilmesi ... 11
3. ARAŞTIRMA BULGULARI ... 13
3.1. Hasta Grubu ... 13
3.2. PZR Sonuçları ... 13
3.3. Saflaştırma Sonuçları ... 14
3.4. DNA Dizi Analizi Sonuçları ... 15
3.4.1. MtDNA D-Loop bölgesi DNA dizi analizi sonuçları ... 17
3.4.2. MtDNA D-Loop bölgesinde mikrosaletellit insitabiltesi (MSI) ve MSI dizilerinde somatik mutasyonlar ... 24
3.4.2.1. D310 mikrosatelllit insitabilitesi ... 24
3.4.2.2. D310 polisitozin dizisinde somatik mutasyonlar ... 24
3.4.2.3. T16189C mikrosatelllit insitabilitesi ... 26
3.4.2.4. T16189C mikrosatelit dizisinde somatik mutasyonlar ... 26
3.4.2.5. D514 mikrosatelit dizisi ... 27
3.4.2.6. D514 mikrosatelit dizisinde somatik mutasyonlar ... 29
3.4.2.7. mtDNA D-loop bölgesinde mikrosatelit dizileri dışında belirlenen somatik mutasyonlar ... 30
4. TARTIŞMA ve SONUÇ ... 31
5. KAYNAKLAR ... 35
TEŞEKKÜR ... 38
iv ÇİZELGE DİZİNİ
Sayfa Çizelge 1.1:Tiroid Tümörlerinin Sınıflandırılması (Özata 2005) 2 Çizelge 1.2:Papiller Karsinoma Varyantları (Özata 2005) 3 Çizelge 2.1:PZR ve DNA dizi analizi için kullanılan primerler 8 Çizelge 3.1:PTC hastalarına ait demografik bilgiler 13 Çizelge3.2:PTC hastalarında saptanan MtDNA D-loop bölgesi ve 12S rRNA gen
polimorfizmleri 17
Çizelge 3.3:Soğuk nodül ve sıcak nodül taşıyan beningn tiroid lezyonu bulunan hastalar ile PTC hastalarının haplogrup dağılımları 21 Çizelge 3.4: mtSNP’lerin benign ve malign tiroit lezyonları üzerine etkisi 23 Çizelge 3.5: D310 bölgesinde çevre doku ile karşılaştırıldıklarında benign tiroid lezyonları ve PTC dokularında meydana gelen somatik mutasyonlar 26 Çizelge 3.6:T16189C bölgesinde çevre doku ile karşılaştırıldıklarında benign tiroid lezyonları ve PTC dokularında meydana gelen somatik mutasyonlar 26 Çizelge 3.7:D514 CA MSI bölgesinde benign tiroid lezyonları ve PTC dokularında
4CA, 6CA ve 7CA tekrarlarının dağılımı 28
Çizelge 3.8:D514 CA dinükleotid tekrar bölgesinde çevre doku ile
karşılaştırıldıklarında benign tiroid lezyonları ve PTC dokularında meydana gelen
somatik mutasyonlar 30
Çizelge 3.9. PTC hastalarında çevre doku ile karşılaştırıldıklarında tümör dokusunda
saptanan somatik mutasyonlar 30
v ŞEKİLLER DİZİNİ
Sayfa Şekil 3.1: a) 15- 484. nt arası mtDNA D-loop bölgesine ait PEG ile çöktürülmüş PZR
ürünleri; b) 15971-16411. nt arası mtDNA D-loop bölgesine ait PEG ile çöktürülmüş PZR ürünleri c) 361-921. nt arası mtDNA D-loop bölgesine ait PEG ile çöktürülmüş PZR ürünleri d) 16301-134. nt arası mtDNA D-loop bölgesine ait PEG ile çöktürülmüş PZR ürünleri; belirteç olarak 100 bç DNA ladder kullanılmıştır……….………...17 Şekil 3.2: A; %2 ’lik agaroz jelin fotodansimetrik olarak görüntülenmesi, B; Marker bantlarının değerlendirilmesi, C; 1. Kuyudaki örneğin değerlendirilmesi ... 18 Şekil 3.3: Dizi analizi sonuçlarının referans dizi ile karşılaştırılması ... 19 Şekil 3.4: 11366 nolu hastaya ait çevre doku (a) ve tümör doku (b) DNA'sından elde edilen dizi analizi örnekleri……….19 Şekil 3.5: D-310 bölgesina ait DNA dizi analizi kromotogramları. A: C7TC6 tekrarına
sahip çevre doku; B: C7TC6/C8TC6 heteroplazmisine sahip PTC C:
C8TC6 tekrarına sahip çevre doku; D:C8TC6/C9TC6 heteroplazmisine sahip PTC; E-F:C9TC6/C10TC6 heteroplazmisine sahip çevre doku ve PTC……….………28 Şekil 3.6: a) homoplazmik yabanıl tip (16189T) taşıyan bireye ait DNA dizi analizi
örneği, b) heteroplazmik T16189C polimorfizmi taşıyan nodüler dokuya ait DNA dizi analizi örneği, c) homoplazmik olarak C16186T, T16189C ve T16192C polimorfizmlerini taşıyan nodüle ait DNA dizi analizi sonucu, d) homoplazmik olarak 16189C polimorfizmi taşıyan PTC örneğine ait DNA dizi analizi örneği……….30 Şekil 3.7:a) D514 4CA dinükleotid taşıyan bireye ait DNA dizi analizi örneği, b)
heteroplazmik D514 4CA/5CA dinükleotid varyantı taşıyan PTC dokusuna ait DNA dizi analizi örneği, c) D514 5CA dinükleotid varyantı olan bireye ait DNA dizi analizi örneği, d) heteroplazmik D514 6CA/5CA dinükleotid varyantı taşıyan soğuk nodül dokusuna ait DNA dizi analizi örneği, e) D514 6CA dinükleotid varyantı olan PTC dokusuna ait DNA dizi analizi örneği, f) D514 7CA dinükleotid varyantı olan sıcak nodül dokusuna ait DNA dizi analizi örneği………31
vi SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ
A : Adenin
ABD : Amerika Birleşik Devletleri ATP : Adenozin-3-fosfat
Bç : Baz çifti
C : Sitozin
CN : Soğuk nodül
dATP : Deoksiadenozin trifosfat dCTP : Deoksisitidin trifosfat dGTP : Deoksiguanozin trifosfat dH2O : Distile su
DNA : Deoksiribonükleik asit
dNTP : Deoksiribonükleikasit trifosfat dTTP : Deoksitimidin trifosfat
EDTA : Etilendiamintetraasetik asit EtBr : Etidyum bromür
FTK :Foliküler tiroid karsinom
G : Guanin
HCl : Hidrojen klorür
HN : Sıcak nodül
KCl : Potasyum klorür MgCl2 : Magnezyum klorür MNG : Multinodüler guatr mtDNA : Mitokondriyal DNA
MSI : Mikrosatelit İnsitabilitesi
NaAC : Sodyum asetat
NaCl : Sodyum klorür
nt : Nükleotid
PEG : Polietilenglikol
PTK : Papiller tiroid karsinom PZR : Polimeraz zincir reaksiyonu RNA : Ribonükleik asit
RPM : Devir/dak.
rRNA : Ribozomal RNA
SLS : Örnek yükleme tamponu
T : Timin
TBE : Tris borik asit EDTA TMNG : Toksik multinodüler guatr tRNA : Taşıyıcı RNA
U : Ünite
V : Ultraviyole
vii ÖNSÖZ
T.C. Namık Kemal Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenen “Türk Toplumunda Papiller Tiroid Kanserlerinde D-LOOP Mutasyonlarının İncelenmesi” isimli, NKUBAP.00.10.AR.15.05 numaralı projemize ait sonuç raporudur.
1 1. GİRİŞ
Tiroid bezi kanserleri endokrin organlarda saptanan malign tümörler içerisinde en sık görülen kanserlerdir ve tüm kanserlerin %2.9’unu oluşturur (Barbaro ve ark. 2014, Fayaz ve ark. 2014). Tiroid kanserleri genel popülasyonda kadınlarda en sık görülen 7. kanser türü, erkeklerde ise en sık görülen 14. kanser türüdür (Fayaz ve ark. 2014). Tiroid kanserleri, tiroid dokusunun epitelyel ve non- epitelyel kısımlarından gelişir. Tiroid foliküler epitelinden; papiller, foliküler ve anaplastik kanserler köken alır. Parafoliküler epitelinden ise medüller kanser köken alır. Tiroid kanserleri, iyi differansiye karsinomlar, medüller karsinom, anaplastik karsinom ve diğerleri olarak ayrılabilir (Çizelge 2.1). Papiller, papiller mikrokarsinom, foliküler ve Hürthle hücreli karsinomları foliküler epitel hücre kökenli iyi differansiye karsinom tipleridir. Buna karşın insüler karsinom, anaplastik tiroid karsinom, foliküler hücre kökenli az differansiye tiroid karsinom tiplerini oluştururlar (Özata 2005).
Papiller tiroid karsinomu (PTK), tiroid kanseri arasında toplumda en sık rastlanan tiroid kanseridir ve tiroid kanseri vakalarının %80’inini kapsar (Boila ve ark. 2012). PTK, tiroid kanserleri içerisinde prognozu en iyi olan tiroid kanseridir.
Ancak PTK hastalarının yaklaşık %10’nunda lenf nod nüksleri ve akciğer metaztazları gibi yeniden nüks görülebilir. Bilinen kötü prognostik faktörler arasında yaş >45, büyük tümör boyutu, tiroid dışı invazyon, uzak metaztaz ve vasküler invazyon sayılabilir (Katoh ve ark. 2015). Bununla beraber, çocukluk çağında aşırı radyasyon almış olma papiller tiroid kanserine yatkınlıkta en önemli risk faktörüdür (Adaş ve ark. 2012). Papiller tiroid kanseri lenfatik yayılıma eğilimlidir ve metastazın sağ kalım üzerine olumsuz etkisi azdır (Erhan ve ark. 1999).
Dünya Sağlık Örgütünün (WHO) sınıflandırılmasına göre; PTK’ nun foliküler, makrofoliküler, onkositik hücre, tall hücre, columnar hücre, sklerozan ve solid varyantları gibi alttipleri bulunmaktadır (Çizelge 2.2) (Erşen ve ark. 2013). Bu alt tiplerden solid varyant ve (tall) hücre varyantları daha kötü prognoz gösterirken diğerleri daha iyi prognostik özelliklere sahiptir.
Bununla beraber, geniş bir literatür taraması yapıldığında tiroid tümörlerinin;
farklı etnik grup, cinsiyet ve yaşa sahip vaka serilerinde farklı insidansta bulunan yaygın olarak karşılaşılan bir hastalık olduğu RET, TRK, RAS, RAF, Bcl-2 gibi nükler genleri içeren genetik faktörler tiroid tümörlerinin oluşumunda yer aldığı göze çarpmaktadır.
2
Çizelge1.1. Tiroid Tümörlerinin Sınıflandırılması (Özata 2005) I.PRİMER TÜMÖRLERİ
1.EPİTELYAL TÜMÖRLERİ
Folliküler Hücre Kaynaklı Tümörler a.Bening Olanlar
Folliküler Adenomlar 1.Klasik
2.Varyantlar b.Malign Olanlar 1.Diferansiye
Folliküler Karsinoma Papiller Karsinoma a.Klasik b.Varyantlar
2.Az Diferansiye Karsinomlar İnsüler Karsinoma Diğerleri
3.Anaplastik Karsinoma 2. C HÜCRE KAYNAKLI TÜMÖRLER Medüller Tiroid Karsinoma
3.MALİGN LENFOMA 4.ÇEŞİTLİ TÜMÖRLER
Sarkom, Fibrosarkom, Epidermoid, Mukoepidermoid karsinoma II.SEKONDER TÜMÖRLER (METASTATİK)
III. TÜMÖR-BENZERİ LEZYONLAR
3
Çizelge 1.2. Papiller Karsinoma Varyantları (Özata 2005) A-İyi Prognozlu Papiller Kanser Varyantları
1-Mikrokarsinoma 2-Enkapsüle Varyant 3-Solid Varyant 4-Foliküler Varyant
B-Kötü Prognozlu Papiller Kanser Varyantları 1-Uzun Hücreli (Tall hücreli) Varyant
2-Onkositik (oksifil) Varyant 3-Kolumnar Hücreleri Varyant 4-Diffüz Sklerozan
Diğer taraftan kanser gelişimi esnasında, nükleer genomda meydana gelen kusurların yanısıra artan hücre proliferasyonu ve mitokondriyal defektlerin kombinasyonu sonucu oluşan yetersiz enerji tedarikinin tetiklediği Warburg etkisini de göz önüne almak gerekir. Warburg etkisi, kısaca kanser hücrelerinde oksijen varlığında bile yüksek düzeyde glikoliz ile ispatlanmış metabolik yeniden programlanma olarak tanımlanabilir(Su X ve ark. 2016). Dolayısıyla, mitokondriyal kusurların ve mitokondriyal genom kopya sayısı değişimlerinin kanser dahil birçok hastalıkla ilişkili olduğu literatürde yer almaktadır (Larman ve ark. 2012).
Mitokondriyal DNA (mtDNA) yapısının kromatin yapısından yoksun oluşu ve histon protein korumasının bulunmaması mtDNA’yı oksidatif hasarlara yatkın hale getirdiği bilinmektedir. Bununla beraber meme, prostat, serviks , kolorektal , akciğer ve renal kanserlerde mitokondriyal DNA üzerinde yer alan D-loop bölgesinde meydana gelen mitokondriyal DNA (mtDNA) değişimlerinin sıklıkla gözlemlendiği bildirilmiş ve özellikle, D-loop bölgesinde yer alan D310 bölgesi olarak adlandırılan polisitozin dizisinin elektrofilik ve oksidatif hasara daha yakın olduğu öne sürülmüştür (Santos ve ark. 2012).
Literatürde malign ve bening tiroit nodüllerinde mtDNA mutasyonlarını ele alan çalışmalar mevcuttur. Ancak bu çalışmaların büyük kısmının çok az sayıda örnek üzerinde gerçekleştirilmiş olması, analizde kulanılan yöntemlerin yeterince hassas olmaması gibi nedenlerle elde edilen sonuçlar çelişkilidir.
Ebner ve ark. (1991) onkositik tiroit tümörlerinde mtDNA' da büyük değişimlerin varlığını restriksiyon enzim kesimleri ile incelemişler ve bu hücrelerde büyük değişimler ve heteroplazminin gözlenmediğini ve tümör gelişimde rolü olmadığını belirtmişlerdir. Buna karşın, Maximo ve ark, (2002) mtDNA sık delesyonunun inceledikleri tüm tiroit Hürthle hücre tümörlerinde görüldüğünü bildirmişlerdir. Diğer taraftan mtDNA sık delesyonunun varlığını tiroit hastalıklarında ele alan diğer çalışmalarda böyle bir ilişkinin bulunmadığı gösterilmiştir (Tallini ve ark.
1994, Aral ve ark. 2010).
4
Mitokondriyal DNA D-loop bölgesi, D310 değişimlerinin incelediği bir çalışmada Çernobil faciası sonrası radyasyona maruz kalan Belarus kökenli 126 tiroit kanseri olgusu ile Münih, Almanya kökenli sporadik 40 tiroit kanseri olgusu incelenmiş ve bu bölgede görülen değişimlerin radyasyona maruz kalmamış sporadik tümörlerde daha sık gözlendiği, ancak her iki grup içinde tümörogenezde bir rolü olmadığı vurgulanmıştır (Lohrer ve ark. 2002). Diğer taraftan bu çalışmaya yönelik yayımlanan editöre mektupda, çalışmanın tiroit kanseri dışındaki sağlıklı dokuları ele almaması nedeniyle elde edilen verilerin güvenilir olamayacağı vurgulanmıştır (Lima ve ark. 2003). Bir başka yayında ise 72 tiroit kanseri olgusunda D310 değişimlerinin
%5,7 düzeyinde görüldüğü ve tiroit kanserleri ile bir ilişkisi bulunmadığı bildirilmiştir (Tong ve ark. 2003). Araştırmacılar elde edilen bu değerin epitelyal kökenli kanserlere kıyasla çok düşük olduğu bildirmişve beklenen D-loop mutasyon frekansının son derece azalmış olduğunu vurgulamışlardır. Elde edilen bu verilerin aksine Maximo ve ark. (2002) 79 benign ve malign tiroit olgusunda D-loop instabilitesinin %68,5 gibi yüksek bir oranda görüldüğünü ancak benign ve malign olgular arasında bir fark bulunmadığını göstermişlerdir. Aynı araştırma grubu daha sonra yaptıkları çalışmada 66 benign ve malign tiroit olgusunda D310 ve D568 mononükleotid tekrar dizileri ile D514 dinükleotid tekrar dizilerinde instabilite varlığını incelemişler ve D310 ve D514 tekrarlarının sayıca fazlalığının mutagenezde bir rolü olabileceğini düşündürdüğünü belirtmişlerdir (Maximo ve ark. 2005). İlginç olarak 19 nodüler guatr ve 77 malign tiroit karsinomunu ele alan bir diğer çalışmada sadece 8 olguda D310 mikrosatellit instabilitesi belirlenmiş olmasına rağmen yazarlar bu değişimlerin heteroplazmik olması nedeniyle erken tümörogenezde rol oynadığını bildirmişlerdir (Ding Z ve ark. 2009). Su X ve ark. (2016) 66 PTK (64 klasik, 2 foliküler varyant) hastasına ait tümör ve çevre doku ile birlikte 376 sağlıklı bireye ait DNA örnekleri üzerine yaptıkları tüm mitokondriyal genom çalışmalarında, tümör dokularının neredeyse %50’sinde heteroplazmi saptamışlar, ayrıca D-loop bölgesinde yeralan A16164G, C16266T, T16362C mtSNP’leri ile 12S rRNA kodlayan gen bölgesinde yeralan G709A mtSNP’inin PTK oluşumu ile ilişkili olduğunu saptamışlardır.
Sonuç olarak, literatür özetinden de görüleceği gibi tiroit patolojileri ile mtDNA değişimleri arasındaki ilişki halen kesin değildir ve çok sayıda sağlıklı ve hasta bireyi kapsayan, farklı populasyonlarda yapılacak çalışmalara gereksinim vardır. Sunulan bu proje ile Türk toplumunda, papiller tiroit karsinomlarında mitokondriyal genom üzerinde yer alan hiper değişken I ve II bölge instabilitesine bakılarak, mtDNA mutasyon birikiminin malign tiroid nodüllerindeki prevalansının tespit edilmesi ve bir önceki projede elde edilen benign tiroid nodüllerindeki bulgularla karşılaştırılarak tümörogenez gelişimde rolünün bulunup bulunmadığının araştırılması amaçlanmıştır.
5 2. MATERYAL ve YÖNTEM
2.1. Materyal
2.1.1. Kullanılan cihazlar Buzdolabı +40C, Bosch, Türkiye Derin dondurucu -200C, Uğur, Türkiye Distile su cihazı, GFL, Almanya
Ultrasaf su cihazı, Millipore, ABD
Elektroforez güç kaynağı, Cleaver, İngiltere Elektroforez güç kaynağı, Thermo, İngiltere Fotoğraf makinesi, Canon, Japonya
Hassas terazi, Ohaus, ABD
Isı döngü cihazı, Techne TC Plus, İngiltere Isı döngü cihazı, ABI Proflex, Endonezya Isıtıcılı manyetik karıştırıcı, WiseStir, Kore Isı Bloğu (Thermoshaker), Biosan, Güney Kore Kar buz makinası, Bluewave BW, Çin
Mikrosantrifüj, Cleaver, İngiltere Mikrosantrifüj, Sigma, Almanya Otoklav, Tek Bal, Türkiye
Otomatik dizi analizi cihazı, Genomelab GeXP genetic analysis system Beckman Coulter, ABD
Otomatik pipet seti, Axygen, ABD pH metre, Hanna HI221, Romanya Soğutmalı santrifüj, Nüve, Türkiye Transillüminatör, VilberLourmat, Fransa Vorteks, WiseMix, Kore
Yatay elekroforez tankı, Thermo, ABD Yatay elektroforez tankı, Cleaver, İngiltere
2.1.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler
33 cm x 75 µm Kapiler dizi, BeckmanCoulter, ABD Agaroz, Sigma, ABD
Borik asit, Sigma, ABD
Dizi analizi seperasyon jeli, BeckmanCoulter, ABD
Dizi analizi kapillerelektroforez tamponu, BeckmanCoulter, ABD Deoksiribonükleik asit trifosfat (dNTP) set, MBI Fermentas, Litvanya DNA belirteç (100 bç'lik), Thermo, Almanya
EDTA (Etilendiamintetra asetik asit), Sigma, ABD Etidyum bromür, Sigma, ABD
Etil alkol, Sigma, ABD Glikojen, Roche, Almanya Magnezyum klorür, Sigma, ABD Mineral yağ, Sigma, ABD
6 PEG (polietilenglikol) 4000, Merck, Almanya
SLS (örnek yükleme tamponu), BeckmanCoulter, ABD Sodyum asetat, Merck, Almanya
Taq DNA polimeraz enzim seti, MBI Fermentas, Litvanya Hotstart Polimeraz Mix, Qiagen, ABD
Tris, Sigma, ABD
Yükleme tamponu, MBI Fermentas, Litvanya 2.1.3. Kullanılan kitler
DNA dizi analizinde kullanılan GenomeLab DTCS – Quick Start DNA Sequencing Kit, Beckman Coulter, (ABD) firmasından elde edilmiştir. Kit dizileme için gerekli olan glikojen, dizileme primeri, quick start mix, kontrol kalıp, mineral yağ, SLS içermektedir.
2.1.4. Kullanılan ticari çözelti ve tamponlar Yükleme tamponu (Fermantas, Litvanya) Tris-HCl pH 7,6
% 0,03 bromfenol mavisi
% 0,03 ksilen siyanol FF
% 60 gliserol 60 mM EDTA
10X reaksiyon tamponu (Fermantas, Litvanya)
Taq DNA polimeraz enzim seti içerisinde hazır olarak alındı.
100 mM Tris-HCl (pH 8,8) 500 mM KCl
0,8% Nonidet P40 2 mM MgCl2
25 mM MgCl2 (Fermantas, Litvanya)
Polimeraz zincir reaksiyonunda kullanılan 25 mM MgCl2 Taq DNA polimeraz enzim kiti içerisinde hazır olarak alındı.
10 mM dNTP (Fermantas, Litvanya)
Her biri 100 mM olan dATP, dGTP, dCTP ve dTTP solüsyonlarından 10’ar µl ve steril dH2O’dan 60 µl alınarak 500 µl’lik steril ependorf tüp içerisinde karıştırılarak hazırlandı.
2.1.5. Kullanılan çözeltiler Etidyum bromür çözeltisi
10 mg/mL etidyum bromür distile su içerisinde hazırlandı.
7 5X Tris-Borik asit-EDTA (TBE) tamponu 54 g Tris baz
27,5 g Borik asit
20 mL 0,5 M EDTA (pH 8,0)
Çözelti 1 litre’ye dH2O ile tamamlandı.
1X TBE hazırlamak için 5X TBE stoğundan 200 ml alındı ve distile su ile 1000 ml'ye tamamlandı.
%26 PEG solüsyonu 13 g PEG 4000
67 mg Magnezyum klorür (MgCl2)
25 ml 1.2 M Sodyum asetat (NaAC) (pH 5.2) Çözelti 50 ml’ye dH2O ile tamamlandı.
DNA dizileme reaksiyonu durdurma solüsyonu
Her bir örnek için 5 µl olacak şekilde 0,1 M EDTA (pH 8,0)'dan 2 µl, 3 M NaAc (pH 5,2)'tan 2 µl, 20 mg/ml Glikojen'den 1 µl alınarak 0.2ml'lik eppendorf tüpte kullanım öncesi taze olarak hazırlandı.
2.1.6.Primerler
Çalışmada PZR ve DNA dizi analizi esnasında kullanılan primerler Iontek Ltd Şti, Türkiye'den temin edilmiştir. Primerlerin dizileri Çizelge 3.1'de belirtilmiştir (Levin ve ark. 1999).Ancak, mtF16301 ve mtR134 kodlu primer çifti bu çalışma için tarafımızdan dizayn edilmiştir.
Liyofilize olarak temin edilen primerler 100 pmol olacak şekilde sulandırılarak ana stok elde edildi. Ana stoktan 10 µl alınıp üzerine 90 µl distile su ilave edildive 10 pmol ara stok elde edildi. Ara stoklar -200C'de saklandı.
8
Çizelge 2.1. PZR ve DNA dizi analizi için kullanılan primerler Primerler Tm (0C) Primer dizileri (5' 3')
mtHV2F15 57,3 CACCCTATTAACCACTCACG
mtHV2R484 53,2 TGAGATTAGTAGTATGGGAG
mtHV1F15971 55,3 TTAACTCCACCATTAGCACC mtHV1R16411 61,8 GCGAGGAGAGTAGCACTCTTG
mtF361 57,9 ACAAAGAACCCTAACACCAGC
mtR921 57,9 ACTTGGGTTAATCGTGTGACC
mtF16301 54,7 CAGTACATAGTACATAAAGCCA
mtR134 53,2 AAGACAGATACTGCGACATA
2.1.7. Kullanılan bilgisayar programları ve web tabanlı programlar
GenomeLab GeXP Genetic Analysis System, DNA sekanslama analiz programı version 10.2, Beckman Coulter, ABD
Infinity jel görüntüleme sistemi, Vilber Lourmat, Fransa Microsoft word, excel, ABD
SPSS 15.0, ABD
Mitomaster (www.mitomap.org), Leipzig, Almanya 2.1.8. Hasta grubu
Çalışmaya 2004-2011 tarihleri arasında Kartal Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Genel Cerrahi Kliniğine başvuran ve papiller tiroid kanseri (PTC) tanısı konulan 50 hasta dahil edilmiş olup bu hastaların ait 50 karsinom ve çevre dokusu çalışmaya alınmıştır. Çalışma sonucunda elde edilen veriler, 2015 yılında tamamlanan NKUBAP.00.10.AR.14.07 nolu projemizde yeralan 105 toksik multinodüler guatr (TMNG) ve multinodüler guatr (MNG) hastasına ait 91 çevre, 108 sıcak nodül (HN) ve 87 soğuk nodüle ait veri ile karşılaştırılmıştır. Tüm DNA örnekleri daha önce başka çalışmalar için kullanılmış olup 2008 yılından bu yana Namık Kemal Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Moleküler Biyoloji ve Genetik Laboratuvarında arşivlenmektedir.
9 2.2. Yöntem
2.2.1. Parafine gömülü dokudan DNA izolasyonu
Kartal Eğitim ve Araştırma Hastanesi’nde papiller tiroid kanser tanısı almış hastalara ait formalin fiske parafine gömülü dokulardan mikrotom ile 10 μm kalınlığında kesitler alınarak steril eppendorf tüplere konuldu. Çalışmaya dahil edilen dokulardan DNA izolasyonu QIAGEN marka DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak üretici firmanın kullanım kılavuzuna uygun olarak gerçekleştirildi.
2.2.2. Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR)
Polimeraz Zincir Reaksiyonu ( PZR ) in vitro koşullarda belirli bir DNA bölgesinin amplifkasyonunu sağlayan ve 1985’te geliştirilen bir metottur. Temel olarak PZR üç basamak içermektedir. Bunlar: Hedef DNA’nın termal denatürasyonu (yaklaşık≈ 94oC);17-35 nükleotidden oluşan özgül sentetik oligonükleotidprimerlerin hedef bölgeye bağlanması (anneling); ve termostabil bir DNA polimeraz tarafından hedef bölgeye bağlanan primerlere uygun nükleotidlerin takılması ( sentez ≈ 72 oC ) (Mullis ve ark 1986)
Yapılan bu çalışmada, bölümümüzde arşivlenen papiller tiroit dokularına ait DNA örneklerinden mtDNA D-loop bölgesine ait 15971.-574. nükleotidlerarasındaki mitokondriyal genom bölgesinin çoğaltılması amacıyla Barbara C. Levin ve arkadaşlarınca belirlenen kriterlere göre PZR reaksiyonları gerçekleştirildi (Levin ve ark. 1999).
Mitokondriyal DNA D-loop bölgesine ait 15971-574 . nt'ler arası DNA dizileri için 50 µl'lik reaksiyon karışımı;
0,1-1 µg kalıp DNA
25 µl hot start polimeraz karışımı 20 pmol ileri ve geri primer dH2O ile hazırlandı.
Bu işlem 0,2 ml'lik eppendorf tüpünde ve buz içerisinde gerçekleştirildi.
Örnekler ısı-döngü cihazına yerleştirilerek, aşağıda belirtilen program uygulandı.
95oC'de 15 dakika ön denatürasyon 94°C'de 30 saniye... denatürasyon
56°C'de 30 saniye...bağlanma 40 döngü 72°C'de 30saniye...sentez
72°C'de 7 dakikalık son uzama
Polimeraz zincir reaksiyonu uygulamalarında kontaminasyonun takibi için ek olarak negatif kontrol de çalışmaya eklendi. Negatif kontrol için PZR bileşenleri, örnekler ile aynı miktarda olup kalıp DNA kullanılmadı, son hacim ise distile su ile tamamlandı.
10 2.2.3. Agaroz jel elektroforezi
DNA parçalarının ayrılması, tanımlanması, ve saflaştırılması için standart bir metot olarak agaroz jel elektroforezi kullanılmaktadır. Agaroz jel elektroforezi ile yaklaşık 60 - 0.1kb uzunluğunda DNA parçaları ayrılabilmektedir. Jeldeki DNA bantları jelin bir floresan boya olan etidyum bromür ile boyanması ve jelin mor ötesi ışık altında incelenmesi ile saptanabilir. Çoğunlukla jel elektroforezinde bilinen büyüklükteki bir belirteç DNA kullanılarak moleküler büyüklüğü bilinmeyen DNA’ların boyları kolayca saptanabilir (2). Yapılan bu çalışmada PZR ile amplifiye edilen ürünlerin doğruluğunun ve kalitesinin belirlenmesi için agaroz jel elektroforezi uygulandı. Elde edilen ürünlerin boylarını tanımlayabilmek için %1,5’ luk jel kullanıldı.
Agaroz jel 1 X TBE tamponunda kaynatılarak hazırlandı. Çözeltiye DNA’nın UV ışık altında görüntülenebilmesi için 0.25 μg / ml EtBr ilave edildi. Elektroforez 90 V / 45 mA olacak şekilde uygulandı. Yaklaşık kırkbeş dakika sonra güç kaynağı kapatıldı.
Jel UV ışını altında incelendikten sonra fotoğrafı çekildi.
2.2.4. PZR ürünlerinin saflaştırılması
Dizi analizi reaksiyonu öncesi PZR karışımındaki primer, dNTP gibi kimyasal artefaktların ortamdan uzaklaştırılması için PZR ürünleri PEG ile çöktürme yöntemi kullanılarak saflaştırıldı. İlk olarak PZR ürünleri eşit miktarda PEG çözeltisi ile karıştırıldı ve vortekslendi. Daha sonra karışım oda ısısında 20 dakika bekletildi.
Bunu takiben örnekler 4oC’de 15000 dakika/devirde 30 dakika santrifüj edildi.
Santrifüj sonrası Üst sıvı dikkatli bir şekilde ortamdan uzaklaştırıldı. Çökelti 100 µl
%70’lik etanol ile yıkandı ve 4oC’de 15000 rpm’de 10 dakika santrifüj edildi.
Süpernatant tekrar dikkatli bir şekilde ortamdan uzaklaştırılarak çökelti kurutuldu. 20 µl dH2O ile çözülen 64 PZR ürünlerinden 4 µl alınarak %1.5’likagaroz jelde yürütüldü ve UV ışık altında görüntülendi.Jel üzerinde her bir örneğin konsantrasyonu belirteç DNA ile kıyaslanarak Bio1D programında fotodansitometrik olarak belirlendi (Rosenthal ve ark. 1993).
2.2.5. DNA dizileme reaksiyonu
Yapılan bu çalışmada da PTC hastalarınaait karsinom ve çevre dokularında mtDNA D-loop bölgesine ait DNA dizilerinin tespiti için Sanger metoduna dayanan otomatik dizi analizi yöntemi kullanıldı. Bu amaçla dizileme reaksiyon karışımı hazırlandı.
10 μl'lik reaksiyon karışımı:
• 35-50ng (100fmol) saflaştırılmış PZR ürünü
• 1,5 μl dizileme reaksiyon karışımı (Sequencing mix)
• 5 pmolprimer (ileri veya geri)
• dH2O içermektedir.
Bu işlem 0,2 ml'lik eppendorf tüplerinde ve buz içerisinde gerçekleştirildi ve tüpler ısı döngü cihazına yerleştirilerek aşağıda belirtilen program uygulandı.
11 96°C'de 20 saniye...denatürasyon
50 °C'de 20 saniye...bağlanma 30 döngü 60°C'de 4 dakika...sentez
2.2.6. DNA dizi analizi örneklerinin çöktürülmesi (etanol presipitasyonu)
Dizileme reaksiyonu sonrası presipitasyon üretici firmanın direktifleri doğrultusunda gerçekleştirildi.
Polimeraz zincir reaksiyonu tüpleri içerisinde bulunan reaksiyon ürünleri 0,5 ml'lik sterileppendorf tüplerine aktarıldı. Herbir örneğin üstüne hazırlanan durdurma solüsyonundan 5 µl ve soğuk absolu etanolden 60 µl ilave edilip vortekslendi. +4
0C'de 14000 rpm'de 15 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonrası oluşan üst faz uzaklaştırıldı. Pellet üzerine %70'lik soğuk etanolden 90 µl ilave edilip +4 0C'de 14000 rpm'de 3 dakika santrifüj edildi. Oluşan üst faz uzaklaştırıldıktan sonra örnekler karanlıkta 10 dakika kurumaya bırakıldı. Örnekler, otomatik dizi analizi cihazına yüklenene kadar -200C'de saklandı.
2.2.7. Kapiller elektroforez için örneklerin cihaza yüklenmesi
Presipite dizi analizi ürünleri üre ve formamid içeren 30 µl SLS tamponu içerisinde çözündürülerek üzerine buharlaşmayı önlemek amacıyla bir damla mineral yağ eklendi ve cihaza yüklendi. Kapillerelektroforez üretici firma tarafından belirtilen koşullara göre BackmanCoulterGenomeLabGeXPGenetic Analysis System (ABD) marka otomatik dizi analizi cihazında gerçekleştirildi.
2.2.8. DNA dizi analizi sonuçlarının değerlendirilmesi
Elde edilen dizi analizi sonuçları GenomeLab GeXP Genetic Analysis System Version 10.2 DNA dizi analizi programı kullanılarak değerlendirildi.Hastalara ait sağlıklı dokular ve karsinom örneklerinden elde edilen diziler değerlendirilip FASTA formatına çevrildi. Her bir çevre ve karsinom dokusu için FASTA formatına çevrilen DNA dizi analizi sonuçları web üzerinde bulunan BLAST biyoinformatik programı (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) kullanılarak Cambridgereferans dizisi (NC- 012920.1) ile karşılaştırıldı. Bunu takiben FASTA formatındaki DNA dizi analizi
sonuçları MİTOMASTER biyoinformatik programı
(http://www.mitomap.org/foswiki/bin/view/MITOMASTER/WebHome) kullanılarak, bireylere ait haplogruplar ve polimorfizmlerin genbank frekanslarına ait veriler elde edildi.
2.2.9. İstatistiksel analizler
Yapılan çalışma kapsamındaki hastaların dizi analizi sonuçlar ile bir önceki projemizde multinodular guatr (MNG) ve toksik MNG hastalarından elde edilen dizi analizi sonuçları arasındaki farklılıkların anlamlı olup olmadığı Ki-kare testi, fischer
12
exact test kullanılarak değerlendirildive “p” değerinin 0,05’den küçük olduğu durumlar anlamlı olarak kabul edildi. İstatistik hesapları için SPSS 15.0 bilgisayar programı kullanıldı.
13 3. ARAŞTIRMA BULGULARI
3.1. Hasta Grubu
Çalışmaya, klinik ve patolojik tanısı konulmuş 50 PTC hastası dahil edilmiştir.
Ancak PZR reaksiyonu gerçekleştirilemeyen 3 hasta ise çalışma dışı bırakılmıştır.
Hastalara cerrahi müdahale öncesi kanser tanısı konmamış ve radyoaktif iyot tedavisi uygulanmamıştır. Çalışmaya alınan hastalara, dünya sağlık örgütünün (WHO) kriterlerlerine göre patolojik tanı konulmuş olup, sınıflandırma bu kriterlere göre pataloji uzmanlarınca yapılmıştır. Hastalara ait demografik bilgiler tablo 3.1’de sunulmuştur. Çalışmaya ait elde edilen veriler daha önce de belirtildiği üzere NKUBAP.00.10.AR.14.07 nolu projemizdeki hastalara ait veriler ile karşılaştırılmıştır.
3.2. PZR Sonuçları
Hasta dokulardan ve sağlıklı dokulardan elde edilen DNA örnekleri Yöntem 3.2.1.'de belirtildiği şekilde mtDNA–D Loop bölgesi için 4 farklı PZR reaksiyonu ile ayrı ayrı amplifiye edilmiş ve PEG kullanılarak PZR ürünlerinin saflaştırılması gerçekleştirilmiştir (Şekil 3.1).
Çizelge 3.1. PTC hastalarına ait demografik bilgiler
PTC Varyant n(%)
Kişi sayısı n(%)
Yaş Ort±Std
sapma
Cinsiyet n(%)
Kadın Erkek
Papiller Karsinom Klasik Varyant 7 40,4±13,94 5 2
Papiller Karsinom Foliküler Varyant 13 51,0±11,77 7 6
Papiller Karsinom Onkositik Varyant 6 57,7±9,8 2 4
Papiller Mikrokarsinom Klasik Varyant 11 49,4±10,0 9 2 Papiller Mikrokarsinom Foliküler Varyant 10 50±9,64 8 2
14
a) b)
b) d)
Şekil 3.1. a) 15- 484. nt arası mtDNA D-loop bölgesine ait PEG ile çöktürülmüş PZR ürünleri; b) 15971-16411. nt arası mtDNA D-loop bölgesine ait PEG ile çöktürülmüş PZR ürünleri c) 361-921. nt arası mtDNA D-loop bölgesine ait PEG ile çöktürülmüş PZR ürünleri d) 16301-134. nt arası mtDNA D- loop bölgesine ait PEG ile çöktürülmüş PZR ürünleri; belirteç olarak 100 bç DNA ladder kullanılmıştır.
3.3. Saflaştırma Sonuçları
Yöntem 3.2.3.'te belirtilen şekilde saflaştırılan PZR örnekleri %2'lik jel elektroforezini takiben fotodansimetrik olarak değerlendirildi ve örnek konsantrasyonu 25 ng/µl-65 ng/µl arasında olacak şekilde hesaplandı (Şekil 3.2.).
469 bç 440 bç
560 bç
402 bç
15
Şekil 3.2. A; % 2'lik agaroz jelin fotodansimetrik olarak görüntülenmesi, B; Marker bantlarının değerlendirilmesi, C; 1. kuyudaki örneğin değerlendirilmesi
3.4. DNA Dizi Analizi Sonuçları
Saflaştırılan çevre doku ve karsinom örnekleri Yöntem 2.2.6.'da belirtildiği gibi kapiller elektroforez için cihaza yüklendi. Cihazdan elde edilen dizi analizi sonuçları GenomeLab GeXP Genetic Analysis System Version 10.2 DNA dizi analizi pogramı kullanılarak değerlendirildi.
Hastalara ait dizileme sonuçları hem hasta ve sağlıklı dokular arasında hem de Cambridge referans dizisi (NC-012920.1) ile blast programı kullanılarak karşılaştırıldı.(Şekil 3.3. ve Şekil 3.4.).
.
16
Şekil 3.3. Dizi analizi sonuçlarının referans dizi ile karşılaştırılması
Şekil 3.4.11366 nolu hastaya ait çevre doku (a) ve tümör doku (b) DNA'sından elde edilen dizi analizi örnekleri
a)
b)
17
3.4.1. MtDNA D-Loop bölgesi DNA dizi analizi sonuçları
Yapılan bu proje kapsamında mtDNA D-loop bölgesinin tamamı(16024-576.
nt), tRNA phe(577-647. nt) tamımı ile 12S rRNA kodlayan mt DNA dizilerinin bir kısmı (647-921) incelenmiştir. Cambridge referans dizisi (NC-012920.1) ile karşılaştılan tümör doku ve çevre dokulara ait FASTA formatındaki DNA dizileri
MİTOMASTER biyoinformatik programı
(http://www.mitomap.org/foswiki/bin/view/MITOMASTER/WebHome) kullanılarak veri tabanındaki dizilerle ile kıyaslanmış, haplogruplar belirlenmiş ve karşılaştırma sonucu DNA dizisi üzerinde gözlemlenen homoplazmik değişimler teyit edilmiştir. Tümör ve Çevre dokularda gözlemlenen tüm homoplazmik polimorfizmler çizelge 3.2’de özetlenmiştir. Bununla beraber, çalışma grubunda tanımlanan tüm olası haplogruplar çizelge 3.3’te sunulmuştur.
Çizelge 3.2. PTC hastalarında saptanan MtDNA D-loop bölgesi ve 12S rRNA gen polimorfizmleri
Polimorfizm Sıklığı Haplogrup Subhaplogrup Genebank Frekansı (%)
PTC Grubundaki
Frekans (%)
C64T 1 H H57 2,81 2,13
A73G 36
B, C,H, HV, I, J, K, L, M, N, R, T,
U, W
B4b, C4a, H1e, H5a, HV14, I1a, J1b, J1c, J2a, J2b, K1a, K1b, L3h, M5, M18a, N, R8, R8a, T, U1a, U2e, U3,
U3a, U4a, U5b, U8b, U8c, W3b
73,72 76,60
A93G 1 M M18a 3,00 2,13
G143A 1 J J1b 2,06 2,13
T146C 1 B B4b 19,69 2,13
C150T 7 J, U J2a, J2b, U1a, U3,
U3a, U5b, HV14 11,56 14,89
C151T 1 U U8c 3,25 2,13
T152C 17 H, J, N, R, T, U, W
H1a, H1e, H5a, H20a, H41a, J2a, J2b, N, R8a, T, U3,
U4a, U5b, U8c,,HV14, W3b
25,88 36,17
A153G 1 R R8, 3,58 2,13
G185A 1 J J1c 4,00 2,13
C186A 1 H H28 1,51 2,13
A188G 1 J J1c 1,11 2,13
A189G 1 I, H, N I1a, H3s, N 5,69 2,13
C194T 4 H, N M, R,T, W H3s, N M18a,
R8a,T, W3b 1,76 8,51
18
Polimorfizm Sıklığı Haplogrup Subhaplogrup Genebank Frekansı (%)
PTC Grubundaki
Frekans (%) T195C 10 J, H, HV, L, N R,
T, U, W
J2a, H3s,H57, HV14 L3h, R8, R8a, T1a, U1a, U8b, U4a, W3b
20,66 21,27
C198T 1 H H3s Bilinmiyor 2,13
T199C 2 H, I, U H3s, I1a; U3a 5,04 4,26
G203A 1 I I1a 0,43 2,13
T204C 3 H, HV, N, I, R, W H3s, HV!+ N I1a,
R8a, W3b 6,02 6,39
G207A 3 H, HV, N, B,R, W H3s; HV14 N, B4b,
R8a, W3b 4,67 6,39
A215G 1 J J2a 0,81 2,13
T217C 1 U U2e 0,93 2,13
G228A 2 J, R J1c, R8a 2,78 4,26
T246C 1 M M18a 0,28 2,13
Del248A 1 C C4a 5,32 2,13
T250C 1 I I1a 1,41 2,13
C262T 1 H H41a 0,09 2,13
A263G 47 All of
theSamples All of theSamples 93,36 100
C285T 1 L, U L3h, U1a 0,30 2,13
C295T 6 J, M J1b, J1c,J2a, J2b,
M5 4,65 12,76
T318C 1 U U2e 0,37 2,13
T319C 1 J J2a 0,48 2,13
C340T 1 U U2e 0,43 2,13
A385G 1 U U1a 0,31 2,13
T408C 1 B B4b 0,21 2,13
C456T 2 H H5a 2,87 4,26
C462T 2 J J1b, J1c 3,68 4,26
T480C 1 HV HV14 0,07 4,26
T489C 6 J, M, U J1c, J2a, J2b, M5,
M18a, U8c 24,91 12,76
C497T 2 K K1a, K1b 2,56 4,26
G499A 2 B, U B4b, U4a 3,39 4,26
A508G 1 U U2e 0,81 2,13
G513A 1 J J2a 0,01 2,13
C569T 1 J J2b 0,05 2,13
A574C 1 H, I, M H57, I1a, M5 0,15 2,13
G709A 14 C, H, L, N, R, T, W
C4a, H3s, H1j, L3h,
R8a, T, T1a, W3b 13,08 29,78
19
Polimorfizm Sıklığı Haplogrup Subhaplogrup Genebank Frekansı (%)
PTC Grubundaki
Frekans (%)
A750G 46
B, C, H, HV, I, J,K, M, N, R,T, U, W
B4b, C4a, H1a, H1e, H1j, H3s, H5a, H7h, H20a, H28, H41a, H57, I1a, J1b, J1c, J2a, J2b, K1a, K1b, L3h,
M5, M18a, R8, R8a, T, T1a, U1a, U2e, U3, U3a, U4a,
U5b, U8b, W3b,
98,58 97,87
A16051G 1 U U2e 2,59 2,13
C16069T 4 J J1b, J1c, J2a, J2b 4,93 8,52
A16077T 1 K K1a 0,16 2,13
A16078G 1 K K1a 0,04 2,13
T16086C 1 B B4b 2,06 2,13
T16093C 3 J, K, R, U J1b, K1a, K1b,
R8a, U8c 5,66 6,39
T16126C 8 H, J, R, T, U
H1e, H57, J1b, J1c, J2a, J2b, R8a,T, T1a, U5b,
U8c
11,57 17,02
G16129A 12 C, H, I, L, M,N, U, W
C4a, H1e, H3s, H57, I1a, L3h, M5,
N, U3, U5b, U8b, U1a, W3b
13,06 25,53
G16129C 1 U U2e 0,70 2,13
C16134T 1 U U4a 0,41 2,13
T16136C 1 B B4b 0,85 2,13
C116142T 1 H H57 0,05 2,13
G16145A 1 H, J, M, U5b, H1e, J1b, M5, U5b 2,77 2,13
C16148T 1 M M5 2,69 2,13
A16163G 1 N, T N, T1a 1,40 2,13
T16172C 1 L, I, N L3h, I1a, N 7,03 2,13
C16173T 1 U U3a 0,25 2,13
A16180C 2 R, U R8, U8b 0,01 2,13
A16183C 3 R, U R8, U1a, U2e 12,31 6,39
C16186T 1 T T1a 1,25 2,13
T16189C 7 B, H, J, L, M, R, T, U, W
B4b, H1a,H1e, H57, J2a, J2b,L3h,
M5, M18a, R8,R8a,T1a, U1a,
U5b, U8b, U8c, W3b
25,64 14,89
20
C16192T 1 H H28 4,19 2,13
C16193T 1 J J2b 1,09 2,13
T16209C 1 U U2e 2,74 2,13
Polimorfizm Sıklığı Haplogrup Subhaplogrup Genebank Frekansı (%)
PTC Grubundaki
Frekans (%)
G16213A 1 H H7h 1,03 2,13
C16218T 1 Haplogrup H20a 0,62 2,13
C16222T 1 J, M J1b, M5 0,84 2,13
C16223T 8 C, H, I, J, L,I, M, N,W
C4a, H1j, H3s, J2a, L3h, I1a, M5, M18a, N, W3b
39,04 17,02
T16224C 2 K K1a, K1b 4,99 4,26
A16247C T T 0
C16248T 1 J J2a 0,52 2,13
T16249C 1 J J2b 2,00 2,13
C16260T 1 U U3a 1,18 2,13
C16261T 1 J J1b 7,70 2,13
C16264T 1 H H57 1,17 2,13
G16274A 1 J J2a 2,29 2,13
T16288C 1 H H57 0,70 2,13
C16290T 1 M M18a 3,51 2,13
C16292T 1 N N 2,42 2,13
A16293G 1 H H41a 2,33 2,13
C16294T 5 M,T M5,T, T1a 9,62 10,64
C16295T 2 H, M H57, M5 1,42 4,26
T16298C 1 C C4a 6,15 2,13
T16304C 2 H H5a 6,59 4,26
T16311C 4 H, HV, I; K, L H3s,HV14, I1a,
K1b, L3h 20,61 8,51
A16318T 1 M M18a 0,46 2,13
C16320T 1 T T 2,79 2,13
T16325C 1 N N 3,06 2,13
C16328A 1 H H20a 0,04 2,13
C16327T 1 C C4a 3,91 2,13
T16342C 1 U U5b 0,50 2,13
A16343G 3 H, U H1e, U3, U3a 0,89 6,39
T16356C 3 H, T, U H1j, T1a, U4a 2,38 6,39
T16357C 1 HV HV14 0,96 2,13
T16362C 2 H, U2e H57 16,75 4,26
C16366C 1 J J1c 0,15 2,13
G16390A 1 U U3a 5,79 2,13
G16391A 2 I, M I1a, M5 1,51 4,26
21
Çizelge 3.2 yeralan polimorfizmler incelendiğinde, bu polimorfizmler arasında daha önce literatürde çeşitli hastalıklar ile ilişkisi olduğu belirlenen C150T, T195C, T16093C, G16129A, T16189C, C16192T ve T16362C polimorfizm sıklıkları bir önceki projemizde yeralan benign sıcak ve soğuk tiroid nodüllerine sahip hastalar ile PTC hastaları arasında istatistiksel olarak karşılaştırılmıştır (kaynak bir önceki proje).
Bununla beraber, her iki proje göz önüne alındığında, hasta gruplarının birisinde en az %6’nın üzerinde tespit edilen T146C, T152C, A189G, T204C, C295T, T489C, G709A, T16126C, C16223T, C16294T, T16304C, T16311C, T16325C, A16343G ve T16519C polimorfizm sıklıkları hasta grupları arasında istatistiksel olarak karşılalaştırıldı. Hasta grupları arasında T152C, C295T, G16129A ve T16362C polimorfizm sıklığı açısından istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar gözlemlenmiştir.
Sonuçlar çizelge 3.4’te özetlenmiştir. Bununla beraber bu çalışmada saptanan A16247C polimorfizminin mitomap.org’ daki veriler ile karşılaştırıldığında henüz genbank’ta yeralmadığı saptanmıştır.
Çizelge 3.3 Soğuk nodül ve sıcak nodül taşıyan beningn tiroid lezyonu bulunan hastalar ile PTC hastalarının haplogrup dağılımları
Haplogrup HN
n=70(%)*a
CN n=48(%)**a
PTC n=47(%)
B 1 (1,43) 0 1 (2,13)
C 1 (1,43) 0 1 (2,13)
D 0 1 (2,08) 0
G 1 (1,43) 0 0
H 22(31,43) 14(29,17) 14 (29,79) HV 3 (4,28) 2 (4,16) 1 (2,13)
I 2 (2,86) 1 (2,08) 1 (2,13)
J 2 (2,86) 2(4,16) 4 (8,51)
K 2 (2,86) 2 (4,16) 2 (4,26)
L 0 1 (2,08) 1 (2,13)
M 1 (1,43) 2 (4,16) 2 (4,26)
N 0 2 (4,16) 1 (2,13)
R 3 (4,28) 4 (8,32) 4 (8,51) T 11 (15,71) 5 (10,40) 4 (8,51) U 16 (22,86) 9 (18,75) 9 (19,15)
W 4 (5,71) 3 (6,24) 2 (4,26)
X 1 (1,43) 0 0
T16519C 18 C, H, I, J, K, L, M, N, R, T, U,W
C4a, H1e, H3s, H7h, H28, I1a, J1c,
K1a, K1b, L3h, M18a, R8, R8a, T,
T1a, U2e, U4a, U5b, W3b
61,99 38,30
T16519A 1 B B4b 0,01 2,13
C16527T L L3h 1,24
* HN Sıcak Nodül
** CN Soğuk Nodül
a Veriler 2015 yılında tarafımızdan tamamlanan NKUBAP.00.10.AR.14.07 nolu projemizden alınmıştır.
22
Çizelge 3.2 yeralan polimorfizmler incelendiğinde, bu polimorfizmler arasında daha önce literatürde çeşitli hastalıklar ile ilişkisi olduğu belirlenen C150T, T195C, T16093C, G16129A, T16189C, C16192T ve T16362C polimorfizm sıklıkları bir önceki projemizde yeralan benign sıcak ve soğuk tiroid nodüllerine sahip hastalar ile PTC hastaları arasında istatistiksel olarak karşılaştırılmıştır(kaynak bir önceki proje).
Bununla beraber, her iki proje göz önüne alındığında, hasta gruplarının birisinde en az %6’nın üzerinde tespit edilen T146C, T152C, A189G, T204C, C295T, T489C, G709A, T16126C, C16223T, C16294T, T16304C, T16311C, T16325C, A16343G ve T16519C polimorfizm sıklıkları hasta grupları arasında istatistiksel olarak karşılalaştırıldı. Hasta grupları arasında T152C, C295T, G16129A ve T16362C polimorfizm sıklığı açısından istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar gözlemlenmiştir.
Sonuçlar çizelge 3.4’te özetlenmiştir. Bununla beraber bu çalışmada saptanan A16247C polimorfizminin mitomap.org’ daki veriler ile karşılaştırıldığında henüz genbank’ta yeralmadığı saptanmıştır.
Çizelge 3.3’te yeralan haplogrup dağılımları incelendiğinde, gruplar arasında önemli bir farklılık olmadığı gözlemlenmektedir.
23
No Polimorfizm (Homoplazmik)
HN*
n=70 (%)
CN**
n=48 (%)
PTC***
n=47 (%)
Genebank
Frekansı (%) P Değeri (HN vs CN)
P Değeri (HN vs PTC)
P Değeri (CN vs PTC)
Odds
Ratio %95 CI
1 A73G 46 (65,71) 29 (60,42) 36 (76,60) 73,72 0,346 0,146 0,070
1,088 0,858 0,789
0,818-1,446 0,681-1,081 0,597-1,042
4 T152C 17 (24,29) 7 (14,58) 17 (36,17) 25,88 0,146 0,119 0,014
1,665 0,671 0,403
0,748-3,706 0,383-1,117 0,184-0,882
6 T195C 12 (17,14) 7 (14,58) 7 (14,89) 20,66 0,458 0,478 0,597
10 C295T 2 (2,86) 2 (4,16) 6 (12,76) 4,65 0,538 0,037 0,127
0,686 0,224 0,326
0,1-4,702 0,047-1,062 0,060-1,536
12 T489C 5 (7,14) 4 (8,32) 6 (12,76) 24,93 0,537 0,240 0,356
13 G709A 19 (27,14) 8 (16,66) 14 (29,78) 13,08 0,134 0,457 0,092
1,629 0,911 0,548
0,777-3,413 0,506-1,632 0,254-1,185
14 T16093C 8 (11,43) 1 (2,08) 3 (6,39) 5,66 0,058 0,281 0,301
5,486 1,790 0,326
0,709-42,449 0,501-6,404 0,035-3,027
15 T16126C 14 (20,00) 10 (20,08) 6 (12,76) 11,57 0,545 0,223 0,219
16 G16129A 10 (14,28) 1 (2,08) 12 (25,53) 13,06 0,022 0,1 0,01
6,857 0,560 0,082
0,907-51,853 0,263-1,189 0,011-0,603
19 T16189C 12 (17,14) 8 (16,67) 7+4 (14,89) 25,64 0,576 0,478 0,518
20 C16192T 4 (5,71) 6 (12,50) 1 (2,13) 4,19 0,167 0,329 0,053
0,457 2,686 5,875
0,136-1534 0,897-1,035 0,735-46953
21 C16223T 9 (12,86) 8 (16,67) 6 (12,76) 39,04 0,374 0,610 0,403
24 A16343G 7 (10,00) 3 (6,24) 3 (6,39) 0,89 0,358 0,371 0,651
25 T16362C 3 (4,28) 7 (14,58) 2 (4,26) 16,75 0,048 0,628 0,084
HNCN eksik 1,007 3,427
0,175-5,799 0,750-15,656
26 T16519C 35 (50,00) 22 (45,83) 17 (36,17) 61,99 0,399 0,099 0,227
1,091 1,382 1,267
0,741-1,606 0,885-2,160 0,777-2,066
Çizelge 3.4 mtSNP’lerin benign ve malign tiroit lezyonları üzerine etkisi
24
3.4.2. MtDNA D-Loop bölgesinde mikrosaletellit insitabiltesi (MSI) ve MSI dizilerinde somatik mutasyonlar
3.4.2.1. D310 mikrosatelllit insitabilitesi
Mitokondriyal genom üzerinde 303. ve 315. nükleotidler arasında yeralan gen bölgesi D310 bölgesi olarak isimlendirilmektedir. Oldukça yüksek homopolimerik C dizisi içeren D310 bölgesi birkaç primer tümörde mutasyonel hot spot bölge olarak tanımlanmıştır (Zheng ve ark. 2011). Yapılan çalışmalarda sıklıkla izlenen D310 uzunluk polimorfizmleri bu çalışma kapsamında da incelenmiş olup, soğuk/sıcak nodüller/PTC örnekleri ileçevre tiroid dokuları için belirlenen sitozin sayıları ki-kare testi ilekarşılaştırılmış elde edilen sonuçlar grafik 3.1’de özetlenmiştir.
Grafik 3.1.D310 polisitozin tekrarının benign nodüler dokular, PTC ve çevre dokulardaki dağılımı. D- 310 polisitozin frekansının MNG, TMNG ve PTC vakalarında nodül formasyonuna göre (soğuk nodül ve çevre dokusu (n=48), sıcak nodül ve çevre dokusu (n=70) taşıyan bireyler ve PTC hastaları (n=47)) karşılaştırılması. C7 allel frekansı, soğuk nodül taşıyan bireyler ile PTC hastalarında sıcak nodül taşıyan hasta bireylere göre daha yüksek; sıcak nodül taşıyan hastalarda ise C8, C9, C10 allel frekansı soğuk nodül taşıyan bireyler ve PTC hastalarından daha yüksektir ( 2 test p=0,005) Türk populasyonunda C7 frekansı %37,93;≥ C8 frekansı ise %62,06’ dır (Loueslati ve ark. 2009).
3.4.2.2. D310 polisitozin dizisinde somatik mutasyonlar
Yapılan bu çalışmada PTC hastalarında çevre dokudan farklı olarak tümör dokuda gözlemlenen değişimler ile bir önceki projemizde benign tiroid lezyonlarına
0 10 20 30 40 50 60
C7 C8 C9 C10
D310 Polisitozin Tekrarı
Sıcak Nodül
Çevre Doku (Sıcak Nodül)
Soğuk Nodül
Çevre Doku (Soğuk Nodül)
PTC (Nodüler Doku)
PTC (Çevre Doku)
25
(sıcak ve soğuk nodül) sahip hastalarda nodüler doku ile çevre doku arasında gözlemlenen değişimler istatistiksel olarak ki-kare testi ile karşılaştırılmıştır (çizelge 3.5). Tespit edilen D310 polisitozin dizisi farklılıklarına ait örnek kromotogramlar şekil 3.5’de gösterilmiştir.
A B
C D
E F
Şekil 3.5 D-310 bölgesina ait DNA dizi analizi kromotogramları. A: C7TC6 tekrarına sahip çevre doku; B: C7TC6/C8TC6 heteroplazmisine sahip PTC C: C8TC6 tekrarına sahip çevre doku;
D:C8TC6/C9TC6 heteroplazmisine sahip PTC; E-F:C9TC6/C10TC6 heteroplazmisine sahip çevre doku ve PTC.
26
Çizelge 3.5. D310 bölgesinde çevre doku ile karşılaştırıldıklarında benign tiroid lezyonları ve PTC dokularında meydana gelen somatik mutasyonlar
Sıcak Nodül n=70 (%)
Soğuk Nodül n=48 (%)
PTC n=(47)
HN vs CN p değeri
HN vs PTC p değeri
CN vs PTC p değeri Somatik
D310 Mutasyonları
19 (27,14) 6 (%12,5) 5 (10,64) 0,044 0,024 0,515
3.4.2.3. T16189C mikrosatelllit insitabilitesi
D310 bölgesine benzer olarak polisitozin içeren diğer bir D-loop bölgesi16183.
nt ile 16194. nt arasındaki mtDNA dizisidir. Bu bölgede gerçekleşen T16189C baz değişimi literatürde diabetes mellitus, kardiyopati, endometrial kanser riski, metabolik sendrom, melanoma ve mtDNA kopya sayısı ile ilişkilendirilmiştir(www.mitomap.org).
Yapılan bu çalışmada benign ve malign doku ile çevre dokuda homoplazmik veya heteroplazmik olarak identik saptanan örnekler çizelge 3.4’te belirtilmiş ve gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmadığı tespit edilmiştir.
3.4.2.4. T16189C mikrosatelit dizisinde somatik mutasyonlar
Yapılan bu çalışmada PTC hastalarında, çevre dokudan farklı olarak tümör dokuda gözlemlenen değişimler ile bir önceki projemizde benign tiroid lezyonlarına (sıcak ve soğuk nodül) sahip hastalarda nodüler doku ile çevre doku arasında gözlemlenen değişimler istatistiksel olarak ki-kare testi ile karşılaştırılmıştır (çizelge 3.6). Tespit edilen T16189C polisitozin dizisi farklılıklarına ait örnek kromotogramlar şekil 3.6’de gösterilmiştir. Benign nodüllerle karşılaştırıldığında T16189C baz değişiminin PTC örneklerinde dramatik olarak
Çizelge 3.6. T16189C bölgesinde çevre doku ile karşılaştırıldıklarında benign tiroid lezyonları ve PTC dokularında meydana gelen somatik mutasyonlar
Sıcak Nodül n=70 (%)
Soğuk Nodül n=48 (%)
PTC n=(47)
HN vs CN
p değeri HN vs PTC
p değeri CN vs PTC p değeri Somatik
T16189C
Mutasyonları 0(0) 1 (2,08) 7(14,87) 0,407 0,001 0,027
27
Şekil 3.6. a) homoplazmik yabanıl tip (16189T) taşıyan bireye ait DNA dizi analizi örneği, b) heteroplazmik T16189C polimorfizmi taşıyan nodüler dokuya ait DNA dizi analizi örneği, c) homoplazmik olarak C16186T, T16189C ve T16192C polimorfizmlerini taşıyan nodüle ait DNA dizi analizi sonucu, d) homoplazmik olarak 16189C polimorfizmi taşıyan PTC örneğine ait DNA dizi analizi örneği.
arttığı ve bu artışın istatistiksel olarak anlamlı bir farklılığa sahip olduğu gözlemlenmektedir (p<0.001, p<0,027).
3.4.2.5. D514 mikrosatelit dizisi
MtDNA d-loop bölgesinde bir diğer polimorfik bölge CA dinükleotid tekrarından oluşan D514 bölgesidir. Referans Cambridge mtDNA dizisi 5CA tekrarından oluşmaktadır. Çalışmamızda saptanan her bir polimorfik varyanta ilişkin örnek kromotogram şekil 3.7’de gösterilmiştir. Yapılan bu çalışmada benign ve malign doku ile çevre dokuda homoplazmik / heteroplazmik olarak identik saptanan polimorfik varyantlar çizelge 3.7’te belirtilmiş ve gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmadığı tespit edilmiştir. Bununla beraber, bu çalışmada tespit edilen 4CA, 5CA, 6CA, 7CA tekrarlarının hasta gruplarındaki dağılımı incelendiğinde istatistiksel olarak anlamlı farklılık olduğu tespit edilmiştir (p<0.0001). PTC hastalarında polimorfik 4CA tekrar varyantının sıklığı sıcak nodüllerle karşılaştırıldığında yaklaşık 3 kat, soğuk nodüller ile karşılaştırıldığında 7 kat daha yüksektir.
a) b)
c) d)
28
Şekil 3.7. a) D514 4CA dinükleotid taşıyan bireye ait DNA dizi analizi örneği, b) heteroplazmik D514 4CA/5CA dinükleotid varyantı taşıyan PTC dokusuna ait DNA dizi analizi örneği, c) D514 5CA dinükleotid varyantı olan bireye ait DNA dizi analizi örneği, d) heteroplazmik D514 6CA/5CA dinükleotid varyantı taşıyan soğuk nodül dokusuna ait DNA dizi analizi örneği, e) D514 6CA dinükleotid varyantı olan PTC dokusuna ait DNA dizi analizi örneği, f) D514 7CA dinükleotid varyantı olan sıcak nodül dokusuna ait DNA dizi analizi örneği.
Çizelge 3.7. D514 CA MSI bölgesinde benign tiroid lezyonları ve PTC dokularında 4CA, 6CA ve 7CA tekrarlarının dağılımı
D514 CA tekrarı
Sıcak Nodül n=70 (%)
Soğuk Nodül n=48 (%)
PTC n=(47)
HN vs CN p değeri
HN vs PTC p değeri
CN vs PTC p değeri 6CA&7CA 5 (7,14) 2 (4,16) 3 (6,38) 0,401 0,592 0,490
4CA 9 (12,86) 5 (10,42) 11 (23,40) 0,461 0,109 0,490 4CA tekrarı
a)
4CA/5CA tekrarı b)
5CA tekrarı 5CA/6CA tekrarı
6 CA tekrarı 7 CA tekrarı
c) d)
e) f)
29
Grafik 3.2. D514 CA dinükleotid tekrarının benign nodüler dokular, PTC ve çevre dokulardaki dağılımı.
D-514 CA dinükleotid tekrar dizi frekanslarının MNG, TMNG ve PTC vakalarında nodül formasyonuna göre (soğuk nodül ve çevre dokusu (n=48), sıcak nodül ve çevre dokusu (n=70) taşıyan bireyler ve PTC hastaları (n=47)) karşılaştırılması. 4CA allel frekansı, PTC hastalarında, tümör dokusunda benign (sıcak & soğuk)tiroid nodülü olan hasta bireylere göre daha yüksek; 6CA dinükleotid tekrarı soğuk nodüllerde diğer gruplara göre daha yüksek; 7CA dinukleotid tekrar frekansı ise sıcak nodül taşıyan hastalarda diğer gruplara göre daha yüksektir. ( 2 test p=0,0001)
3.4.2.6. D514 mikrosatelit dizisinde somatik mutasyonlar
Yapılan bu çalışmada PTC hastalarında, çevre dokudan farklı olarak tümör dokuda gözlemlenen değişimler ile bir önceki projemizde benign tiroid lezyonlarına (sıcak ve soğuk nodül) sahip hastalarda nodüler doku ile çevre doku arasında gözlemlenen değişimler istatistiksel olarak ki-kare testi ile karşılaştırılmıştır (çizelge 3.8). Tespit edilen D514 CA dinükleotid tekrar farklılıklarına ait örnek kromotogramlar şekil 3.6’de gösterilmiştir. Benign nodüllerle karşılaştırıldığında D514 4CA dinükleotid tekrar dizi frekansının heteoplazmik olarak PTC hastalarına ait tümör dokularında dramatik olarak arttığı ve bu artışın istatistiksel olarak anlamlı bir farklılığa sahip olduğu gözlemlenmektedir (p<0,0001; p<0,032).
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
4CA 5CA 6CA 7CA
Sıcak Nodül
Çevre Doku (Sıcak Nodül) Soğuk Nodül
Çevre Doku (Soğuk Nodül) Tümör Doku (PTC) Çevre Doku (PTC
